孫 榮，歐維正，王 燕，蒙 俊，秦 萬，畢雅坤，陳崢宏

?

貴陽市結(jié)核分枝桿菌鏈霉素和乙胺丁醇耐藥相關(guān)基因突變的檢測與分析

孫 榮1，歐維正2，王 燕2，蒙 俊2，秦 萬2，畢雅坤1，陳崢宏1

目的 了解貴陽市及周邊地區(qū)結(jié)核分枝桿菌鏈霉素和乙胺丁醇耐藥相關(guān)基因rpsl、rrs和embB的突變特征。方法 對(duì)39株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株(乙胺丁醇和鏈霉素均耐藥菌株19株，均敏感菌株20株)的rpsl、rrs和embB基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，以H37Rv菌株序列為參考，比較耐藥菌株和敏感菌株的突變特征。結(jié)果 19株耐藥菌株中有14株檢出rpsl基因突變，突變率為73.7%(14/19)，其中12株為AAG43AGG突變，1株為AAG43AAT突變，1株為AAG88AGG突變；20株敏感菌株中有1株發(fā)生rpsl基因AAG43AGG突變，突變率為5.0%；耐藥菌株和敏感菌株均未檢測出rrs基因突變。19株耐藥菌株中有16株檢出embB基因突變，突變率為84.2%(16/19)，突變包括6株ATG306GTG突變，ATG306ATA、ATG306ATT和ATG306ATC突變各1株； GGC406GCC和GGC406AGC突變各3株，1株CAG497CGG突變；20株敏感菌株未檢測出突變。結(jié)論 貴陽地區(qū)結(jié)核分枝桿菌菌株鏈霉素和乙胺丁醇耐藥相關(guān)基因突變具有多樣性；優(yōu)勢突變分別為rpsl43和embB306位點(diǎn)突變。

結(jié)核分枝桿菌；鏈霉素；乙胺丁醇；耐藥性；基因突變

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種傳染性疾病，雖然結(jié)核病的發(fā)病率呈緩慢下降趨勢，但是近年來由于耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)和傳播，使得結(jié)核病的疫情仍然不容樂觀。據(jù)估算，2013年耐多藥肺結(jié)核疫情最高的是印度(6.1萬)，中國排在第2位(5.4萬)，俄羅斯排在第3位(4.1萬)。中國新患者中耐多藥的比例為5.7%，高于全球平均水平3.5%[1]。中國是人口大國，也是結(jié)核病22個(gè)高負(fù)擔(dān)國家之一。貴陽市是貴州省的省會(huì)，位于中國西南部，屬于中國西部地區(qū)，經(jīng)濟(jì)、醫(yī)療、衛(wèi)生水平處于全國下游，結(jié)核病的疫情高于全國平均水平[2]。

合理選擇化療藥物、全程足量用藥是治療結(jié)核病的關(guān)鍵問題。利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇是治療結(jié)核病的常用一線藥物，對(duì)這些藥物耐藥的結(jié)核病也是臨床上治療的一大難題。耐藥結(jié)核病患者需要藥物敏感性試驗(yàn)來優(yōu)化治療方案。傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)試驗(yàn)耗時(shí)長，不利于結(jié)核病的治療，因此需要研發(fā)快速的耐藥診斷技術(shù)。 目前基因芯片法檢測利福平和異煙肼已在臨床開展應(yīng)用，鏈霉素和乙胺丁醇尚無商品化的快速檢測試劑和方法。據(jù)報(bào)道[3-4]，rpsl、rrs和embB基因的突變分別與鏈霉素和乙胺丁醇耐藥相關(guān)，由于結(jié)核分枝桿菌耐藥基因具有多態(tài)性，各地區(qū)的流行菌群不同，突變熱點(diǎn)也不一致。因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)貴陽市分離的耐藥和敏感菌株進(jìn)行rpsl、rrs和embB基因突變的篩查，為評(píng)估和建立本地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的快速診斷耐藥性的方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株 質(zhì)控菌株H37Rv由中國疾病預(yù)防控制中心(CDC)傳染病所結(jié)核病研究室提供，為異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇敏感菌株。39株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株均來自貴陽市肺科醫(yī)院肺結(jié)核患者的痰液標(biāo)本，根據(jù)《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌的分離及鑒定，藥物的敏感性實(shí)驗(yàn)采用比例法進(jìn)行[5]，包括乙胺丁醇和鏈霉素均耐藥菌株19株，均敏感株20株。

1.2 主要試劑和儀器 2×Taq PCR Master MIX和DNA Ladder Marker(上海生工生物技術(shù)有限公司)；柱式分枝桿菌基因組DNA提取試劑盒(北京天恩澤生物技術(shù)有限公司)；生物安全柜由貴陽市公共衛(wèi)生救治中心分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室提供，PCR儀由貴州省高校病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 結(jié)核分枝桿菌基因組DNA的制備 挑取一定量L-J培養(yǎng)基斜面上生長的結(jié)核分枝桿菌，置于400 μL TE緩沖液中，混勻后80 ℃水浴滅活15 min，采用柱式分枝桿菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA的提取，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增和測序 在GenBank中查詢標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的rpsl(Gene：888259)、rrs(2700429)和embB(886126)基因的全序列，根據(jù)文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)引物(由上海生工生物技術(shù)有限公司合成)，詳見表1。PCR產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進(jìn)行測序，對(duì)于發(fā)生突變的菌株均進(jìn)行兩次PCR和測序，確保所得序列的正確性。

1.5 DNA序列分析 將臨床分離株測序所得序列在NCBI中進(jìn)行BLAST分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，并與GenBank中結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的rpsl、rrs和embB基因序列進(jìn)行比對(duì)，尋找突變位點(diǎn)。

表1 目的基因，引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小
Tab.1 Target gene, primer sequences and product sizes

PrimerSequences(5'→3')Productsize/bprpslF:GCCGAGCTCAAACAGAACGT-GAAAG486R:GTTAAGCTTCGTAGACCGGG-TCGTTGrrsF:ACGGTAGGTGGAGAAGAAG160R:CCCGCACGCTCACAGTembBF:TTAGATACTTCACCCTGACCG-ACGC847R:CAACTTACGGTGAACAGGCA-TAGCG

2 結(jié) 果

2.1 鏈霉素相關(guān)耐藥基因檢測結(jié)果 39株MTB臨床分離菌株經(jīng)rpsl基因片段引物擴(kuò)增后均得到長度約為486 bp的產(chǎn)物(見圖1)。將各臨床菌株的rpsl基因片段測序結(jié)果與GenBank中結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的rpsl基因序列進(jìn)行比對(duì)，19株耐藥菌株中有14株存在rpsl基因突變，突變率為73.7%(14/19)，其中12株為AAG→AGG突變，1株為AAG43AAT突變，1株AAG88AGG密碼子突變，20株敏感菌株有1株發(fā)生rpslAAG43AGG突變，變異率為5.0%；rpsl43突變在鏈霉素耐藥菌株和敏感菌株中的分布差異具有顯著性(χ2=17.03，P<0.05)。39株MTB臨床分離菌株經(jīng)rrs基因片段引物擴(kuò)增后均得到長度約為160 bp的產(chǎn)物(見圖2)，但均未檢測到rrs基因突變。

M: 100 bp DNA marker; 1: H37Rv; 3-10: Sample; 2: Negative control圖1 部分菌株rpsl基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis of the amplified PCR products of rpsl

M: 100 bp DNA marker; 1: H37Rv; 3-10: Sample; 2: Negative control圖2 部分菌株rrs基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.2 Electrophoresis of the amplified PCR products of rrs

2.2 乙胺丁醇相關(guān)耐藥基因檢測結(jié)果 對(duì)39株

MTB臨床分離菌株的embB基因片段進(jìn)行引物擴(kuò)增后，均得到長度為847 bp的產(chǎn)物(見圖3)。將臨床分離株的embB基因擴(kuò)增產(chǎn)物測序后與GenBank中結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的embB基因進(jìn)行比對(duì)，19株耐藥菌株中有9株檢出embB基因突變，47.4%(9/19)為306位密碼子突變，其中6株為ATG→GTG突變，1株為ATG→ATA突變，1株為ATG→ATT突變，1株為ATG→ATC突變。有7株發(fā)生embB基因406及497位密碼子突變，3株為406位密碼子GGC→GCC突變，3株為406位密碼子GGC→AGC突變，1株CAG→CGG(Gln→Arg)突變，embB306突變在乙胺丁醇耐藥菌株和敏感菌株中的分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.32，P<0.05)。20株敏感菌株未檢測出突變。

M: 100 bp DNA marker; 1: H37Rv; 3-10: Sample; 2: Negative control圖3 部分菌株embB基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis of the amplified PCR products of embB

表2 結(jié)核分枝桿菌臨床分離株基因變異分布
Tab.2 Gene mutations in M. tuberculosis clinical isolates

PrimerLocusSequencesAminoacidsequencesVarianceofresistantstainsVarianceofsensitivestainsrpsl43AAG→AGGK→R12143AAG→AATK→N1088AAG→AGGK→R10embB306ATG→GTGM→V60ATG→ATAM→I10ATG→ATTM→I10ATG→ATCM→I10406GGC→GCCG→A30GGC→AGCG→S30497CAG→CGGG→R10

3 討 論

作為一線抗結(jié)核藥物，異煙肼、利福平、乙胺丁醇和鏈霉素在結(jié)核病的防治、治療方面起著重要作用。隨著分子生物的不斷發(fā)展，經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道的，與一線藥物耐藥相關(guān)的耐藥基因有十多種。其中與異煙肼耐藥相關(guān)的katG[7]、inhA[8]及oxyR-aphC[9]基因，與利福平耐藥相關(guān)的rpoB[10]基因，與鏈霉素耐藥相關(guān)的rpsl、rrs基因及與乙胺丁醇耐藥相關(guān)的embB基因一直是學(xué)者們研究較多的內(nèi)容，目前關(guān)于貴州省結(jié)核分枝桿菌耐藥基因多態(tài)性方面的研究較少。本課題組曾對(duì)貴陽及周邊地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的異煙肼和利福平耐藥的特征進(jìn)行了研究[11-13]，為基因芯片技術(shù)快速診斷利福平和異煙肼耐藥的推廣提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本文對(duì)結(jié)核分枝桿菌臨床菌株進(jìn)行了鏈霉素和乙胺丁醇主要耐藥相關(guān)基因序列的檢測和分析，可為研發(fā)和推廣應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)快速診斷耐藥結(jié)核提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥是由于編碼核糖體S12蛋白的rpsl基因和編碼16S rRNA的rrs基因發(fā)生突變所致。rpsl基因最常見K43R位突變，少數(shù)見K43N位突變[14]。在本次研究的19株鏈霉素耐藥菌株中有14株檢測出rpsl43基因突變，其中13株為K43R，1株為K43N突變，也與之前的研究結(jié)果一致。在新加坡、東印度[15-16]等地區(qū)rpsl43位也是鏈霉素耐藥基因突變的主要變異類型。本次實(shí)驗(yàn)中1株鏈霉素敏感株檢出了rpsl43位突變，雖然rpsl43位突變與鏈霉素耐藥性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是敏感株發(fā)生的突變，降低了rpsl43用于檢測鏈霉素耐藥性的特異度。rrs基因的突變主要集中在491位C→T，512位C→T，516位C→T，在530高度保守的環(huán)區(qū)還可發(fā)生513位A-C/T的顛換[17]，但本實(shí)驗(yàn)鏈霉素敏感和耐藥株均未檢出rrs基因變異，可能是該基因本身突變率較低或者該突變株非本地流行菌群。

乙胺丁醇主要作用于阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶，抑制阿拉伯糖基聚合入阿拉伯半乳聚糖，影響細(xì)胞壁分枝菌酸-阿拉伯半乳聚糖-肽聚糖復(fù)合物的形成，使藥物與酶的相互作用發(fā)生改變，導(dǎo)致耐藥。embB基因(特別第306位密碼子)的錯(cuò)義突變最常見[18]，embB基因突變使糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響了乙胺丁醇與其相互作用，從而導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)乙胺丁醇耐藥性的產(chǎn)生。結(jié)核分枝桿菌耐乙胺丁醇分離株embB基因突變主要發(fā)生在306位密碼子，變異類型多為M306V, M306I, M306L[19]，這與本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)的19株乙胺丁醇耐藥菌株embB基因突變率為84.2%，9株為306位密碼子突變，尚存在G406A，G406S和G497R突變，未發(fā)現(xiàn)其他地區(qū)菌株存在的embB基因285、330和630位點(diǎn)突變[20]，并且有3株乙胺丁醇耐藥株未檢出embB基因變異。結(jié)果表明結(jié)核分枝桿菌embB基因突變特征存在地區(qū)差異，并且除embB基因突變外，本地結(jié)核分枝桿菌對(duì)乙胺丁醇可能有其他耐藥機(jī)制。

本研究通過對(duì)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的基因測序分析發(fā)現(xiàn)，各耐藥基因突變位點(diǎn)與國內(nèi)外的研究基本一致，但各位點(diǎn)突變形式和比例又有自身特點(diǎn)。鑒于MTB基因具有豐富的地域多態(tài)性，為最大限度地避免假陰性結(jié)果，以基因芯片法檢測耐藥突變和在某地區(qū)的廣泛應(yīng)用還需要以大量的臨床菌株進(jìn)行驗(yàn)證。

[1] World Health Organization(WHO): Global Tuberculosis Report[R], Geneva:WHO press.2014.

[2] Wang LX, Cheng SM, Chen MT, et al. The fifth national tuberculosis epidemiological survey in 2010[J]. Chin J Antitube rculosis, 2012, 34(8): 485-508. (in Chinese)

王黎霞, 成詩明, 陳明亭, 等. 2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告[J]. 中國防癆雜志, 2012, 34(8):485-508.

[3] Cuevas-Córdoba B, Cuellar-Sánchez A, Pasissi-Crivelli A, et al.rrsandrpslmutations in streptomycin-resistant isolates ofMycobacteriumtuberculosisfrom Mexico[J]. J Microbiol Immunol Infect. 2013, 46(1): 30-34. DOI: 10.1016/j.jmii.2012.08.020

[4] Sirgel FA, Warren RM, Streicher EM, et al.EmbB306 mutations as molecular indicators to predict ethambutol susceptibilit y inMycobacteriumtuberculosis[J]. Chemotherapy, 2012, 58(5): 358-363.DOI:10.1159/000343474

[5] Canetti G, Fox W, Khomenko A, et al. Advances in techniques of testing mycobacterial drug sensitivity, and the use of se nsitivity tests in tuberculosis control programmes[J]. Bull World Health Organ, 1969, 41(1): 21-43.

[6] Wang Y, Xie JP, Hu CH，et al. Molecular epidemiological research and rapid detection of streptomycin-resistant gene in drug-resist antMycobacteriumtuberculosis[J]. Chin J Infect, 2006, 6(5): 313-316. (in Chinese)

王瑩, 謝建平, 胡昌華等. 耐藥結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥基因的分子流行病學(xué)研究及其快速檢測 [J]. 中國感染與化療雜志, 2006, 6 (5): 313-316.

[7] Loots du T. An alteredMycobacteriumtuberculosismetabolome induced bykatGmutations resulting in isoniazid resistan ce[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2014, 58(4): 2144-2149. DOI:10.1128/AAC.02344-13

[8] Tseng ST, Tai CH, Li CR, et al. The mutations ofkatGandinhAgenes of isoniazid-resistantMycobacteriumtuberculosisis olates in Taiwan[J]. J Microbiol Immunol Infect, 2015, 48(3): 249-255. DOI: 10.1016/j.jmii.2013.08.018

[9] Dalla Costa ER, Ribeiro MO, Silva MS, et al. Correlations of mutations inkatG,oxyR-ahpCandinhAgenes andinvitrosusceptibility inMycobacteriumtuberculosisclinical strains segregated by spoligotype families from tuberculosis prevalent cou ntries in South America[J]. BMC Microbiol, 2009, 9: 39. DOI: 10.1186/1471-2180-9-39

[10] Xu G, Wang J, Guo Y, et al. Analysis of the molecular evolution of theMycobacteriumtuberculosisdrug-resistant gene rpoB in Asia using a Bayesian evolutionary method[J]. Clin Lab, 2015, 61(8): 1017-1025.

[11] Bi YK, Ou WZ, Luo KW, et al. Isoniazid resistance and related gene mutation of 31Mycobacteriumtuberculosisclinical isolates in Guiyang area[J]. Chin J Pathogen, 2014, 9(10): 885-887.DOI： (in Chinese)

畢雅坤, 歐維正, 駱科文，等. 31株結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥相關(guān)基因檢測及序列分析[J]. 中國病原生物學(xué)雜志, 2014, 9(10): 885-887.

[12] Ou WZ, Chen ZH, Chen J, et al. Determination of resistance geneskatGandinhAinMycobacteriumtuberculosisisola tes from Guizhou Province by gene chip[J]. Chin J Zoonoses, 2014, 9(10): 885-887. DOI：(in Chinese)

歐維正, 陳崢宏, 陳靜, 等. 基因芯片技術(shù)檢測貴州省結(jié)核分枝桿菌耐藥基因katG和inhA[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào), 2015, 31 (7): 655-658.

[13] Ou WZ, Luo KW, Chen ZH, et al. Analysis of characteristic ofropBgene mutations associated withMycobacteriumtuberculosisresistance to rifampicin in Guizhou of China[J]. Chin J Clin Pharmacol, 2015, 31(10): 833-835.DOI： (in Chinese)

歐維正, 駱科文, 陳崢宏, 等. 貴州地區(qū)結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥相關(guān)基因ropB突變特征分析[J]. 中國臨床藥理學(xué)雜志, 2015, 31(10): 833-835.

[14] Shi R, Zhang J, Li C, et al. Detection of streptomycin resistance inMycobacteriumtuberculosisclinical isolates from C hina as determined by denaturing HPLC analysis and DNA sequencing[J]. Mic Infect, 2007, 9(14/15): 153 8-1544.

[15] Sun YJ, Luo JT, Wong SY, et al. Analysis ofrpslandrrsmutations in Beijing and non-Beijing streptomycin-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates from Singapore[J]. Clin Mic Infect, 2010, 16(3): 287-289.DOI: 10.1111/j.1469-0691

[16] Potdar P, Thakur P. Development of sequence based molecular diagnostic test to evaluate MDR and XDR inM.tuberculosispatients from Western India[J]. Am J Infect Dis Microbiol, 2013, 1(3): 50-58.

[17] Meier A, Sander P, Schaper KJ, et al. Correlation of molecular resistance mechanisms and phenotypic resistance levels in streptomycin-resistantMycobacteriumtuberculosis[J]. Antimicrob Agents Chemother, 1996, 40(11): 2452-2454.

[18] Ramaswamy S, Amin AG, Goksel S, et al. Molecular genetic analysis of nucleotide polymorphisms associated with etha mbutol resistance in human isolates ofMycobacteriumtuberculosis[J]. Antimicrob Anents Chemother, 2000, 44(2): 321.

[19] Zhang H, Chen X, Wang Z, et al. Pyrosequencing analysis for mutations in embB codon306 among clinicalMycobacteriumtuberculosisisolates from Qingdao, China[J]. Int J Clin Exp Med, 2015, 8(7): 11276-11282

[20] Zhao LL, Sun Q, Liu HC, et al. Analysis ofembCABmutations associated with ethambutol resistance in multidrug-resist antMycobacteriumtuberculosisisolates from China[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2015, 59(4): 2045-2050.DOI: 10.1128/ AAC.04933-14

Chen Zheng-hong, Email: chenzhenghong@gmc.edu.cn

Detection of mutations associated with streptomycin and ethambutol resistance inMycobacteriumtuberculosisclinical isolates

SUN Rong1, OU Wei-zheng2, WANG Yan2, MENG Jun2,QING Wan2,BI Ya-kun1, CHEN Zheng-hong1

(1.DepartmentofMicrobiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,China;2.GuiyangPublicHealthCenter,Guiyang550003,China)

Therpsl,rrsandembBgene fragments ofM.tuberculosisisolates collected throughout Guiyang were PCR-amplified and screened for mutations by direct sequencing methodology. These strains included 19 resistant strains resistant to both streptomycin and ethambutol, and 20 strains susceptible to both streptomycin and ethambutol. Results showed that 73.7% (14/19) resistantM.tuberculosisisolates had mutations in therpslgene, and therpslAAG43AGG substitution predominated (85.7%). One isolate had mutations in therpslAAG43AAT, one in therpslAAG88AGG. TherpslAAG43AGG substitution was also found in one susceptible strain, and mutation rate was 5.0% in 20 susceptible strains. No mutations in therrsgene were found in both resistant and susceptible strains. Of 84.2%(16/19) resistant isolates had mutations in theembBgene, includingembBATG306GTG substitution in 6 strains, ATG306ATT, ATG306ATC and CAG497CGG in 3 strains respectively. Three strains harboured theembBGGC406GCC substitution and 3 had GGC406AGC mutation. No mutation ofembBfragment was determined in all the 20 susceptible strains. The results showed diversity in therpslandembBmutations related with streptomycin or ethambutol inM.tuberculosisin Guiyang. Therpsl43 andembB306 are the predominant mutation loci.

Mycobacteriumtuberculosis; streptomycin; ethambutol; antibiotic resistance; gene mutation

陳崢宏，Email: chenzhenghong@gmc.edu.cn

1.貴州醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，貴陽 550025；

2.貴陽市公共衛(wèi)生救治中心，貴陽 550003

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.08.015

R378

A

1002-2694(2016)08-0760-05

2016-01-22；

2016-03-18

貴州省社會(huì)發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目(黔科合SY[2013]3060號(hào))；貴陽市科技計(jì)劃項(xiàng)目(筑科合同[20141001]33號(hào))聯(lián)合資助

Supported by the Brainstorm Project on Social Development in Guizhou Province (Guizhou Science Contract No.[2013]3060) and the Science and Technology Project in Guiyang City (Guiyang Science Contract No.[20141001]33)