張 姝,羅昭遜,莫 非，何 蕓，孫朝琴,張婉穎,曹玉巧，張 嵐

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頭花蓼對(duì)幽門螺桿菌粘附定植的影響

張 姝1,羅昭遜2,莫 非1，何 蕓1，孫朝琴2,張婉穎1,曹玉巧1，張 嵐1

目的 觀察頭花蓼水提物對(duì)幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)粘附定植的影響。方法 采用尿素酶活性比色法定量檢測(cè)頭花蓼水提物作用前后幽門螺桿菌尿素酶活性的影響；運(yùn)用半固體布氏瓊脂平板法檢測(cè)不同濃度頭花蓼對(duì)幽門螺桿菌鞭毛運(yùn)動(dòng)的影響；利用細(xì)胞爬片革蘭染色觀察不同濃度頭花蓼作用后幽門螺桿菌在GES-1細(xì)胞表面粘附的變化并計(jì)算各組抑制率；采用Real-time PCR 技術(shù)檢測(cè)頭花蓼作用前后相關(guān)基因ureB、ureE、ureF、flaA、flaB、babA、alpA、alpB的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果 頭花蓼水提物對(duì)幽門螺桿菌尿素酶活性具有抑制作用，抑制率為44.90±0.289。頭花蓼濃度為1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC分別作用后幽門螺桿菌菌膜暈圈直徑顯著小于對(duì)照組, 分別為(5.67±0.55)mm ,(8.5±0.50)mm ,(11.67±1.53)mm,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同濃度頭花蓼水提物均能抑制細(xì)菌粘附胃上皮細(xì)胞，各濃度組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。頭花蓼作用后，與對(duì)照組比較，下調(diào)了尿素酶結(jié)構(gòu)基因ureB，尿素酶活性基因ureE、ureF、鞭毛相關(guān)基因flaB、flaA以及粘附素基因babA、alpA、alpBmRNA的轉(zhuǎn)錄水平，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 頭花蓼對(duì)幽門螺桿菌具有明顯的抑制作用，是通過(guò)抑制幽門螺桿菌尿素酶活性，減緩幽門螺桿菌的鞭毛動(dòng)力，影響幽門螺桿菌對(duì)胃粘膜上皮細(xì)胞的粘附等方面發(fā)揮其抑菌作用。

幽門螺桿菌；頭花蓼；尿素酶；鞭毛；粘附；

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)的發(fā)現(xiàn)革命性改變很多胃腸疾病的基本理論，根除幽門螺桿菌治療廣泛應(yīng)用于這些疾病的防治。幽門螺桿菌呈螺旋形，有鞭毛、適應(yīng)性酶和粘附素，這使它能在胃腔不利的酸性環(huán)境中定植和生存[1]。因此，成功定植于胃粘膜細(xì)胞是整個(gè)致病過(guò)程中前提和關(guān)鍵，粘附定植的過(guò)程可作為我們根治幽門螺桿菌感染研究的一個(gè)新的靶點(diǎn)。參與整個(gè)定植和生存的因素包括：尿素酶的活性[2-3]、鞭毛動(dòng)力[4-5]以及粘附性影響[1]。

本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)頭花蓼水提物在體外對(duì)幽門螺桿菌具有良好的抑菌活性[6],同時(shí)發(fā)現(xiàn)其作用可減少幽門螺桿菌在小鼠胃粘膜上的定植密度，但具體的機(jī)制尚不清楚。因此，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，在體外觀察頭花蓼水提物作用對(duì)幽門螺桿菌尿素酶活性和鞭毛動(dòng)力的影響；并以人永生化胃上皮細(xì)胞GES-1為靶細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞爬片實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度頭花蓼水提物對(duì)幽門螺桿菌粘附胃粘膜上皮細(xì)胞的粘附能力的影響；Real-time PCR檢測(cè)頭花蓼水提物作用前后粘附定植相關(guān)因子基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，探討頭花蓼水提物抑制幽門螺桿菌成功定植的作用機(jī)制，為頭花蓼的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 幽門螺桿菌ATCC700392國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序株，購(gòu)自ATCC(美國(guó)菌種保藏中心)，由本課題組保管。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥材 水提苗藥頭花蓼浸膏粉，棕色粉末，批號(hào)為20010401，由浙江眾益藥業(yè)有限公司提供。1.1.3 試劑 布氏肉湯干粉、哥倫比亞血瓊脂粉、腦心浸液粉，Oxoid；觸酶、氧化酶、尿素酶購(gòu)自于梅里埃；細(xì)菌活性蛋白提取試劑盒及尿素酶活性定量檢測(cè)試劑盒；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于TaKaRa。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

1.2.1.1 固體培養(yǎng)平板的制備按說(shuō)明書方法，稱取哥倫比亞血瓊脂粉3.9 g，加入84 mL去離子水溶解，高壓滅菌(121 ℃，20 min)，待瓊脂冷卻至56 ℃左右加入無(wú)菌脫纖維綿羊血10 mL，混抗1 mL，實(shí)驗(yàn)組分別加入5 mL濃度為40 mg/mL、20 mg/mL、10 mg/mL頭花蓼藥液，使其平板濃度分別為1/2MIC(2 mg/mL)、1/4MIC(1 mg/mL)、1/8MIC(0.5 mg/mL)，對(duì)照組加無(wú)菌去離子水，充分混勻后傾倒于直徑為90 mm的無(wú)菌平皿中，培養(yǎng)基厚度約為3～4 mm。

1.2.1.2 半固體瓊脂平板的制備 稱取布氏肉湯干粉1.405 g，哥倫比亞瓊脂粉0.45 g于錐形瓶中，加入去離子水44.5 mL溶解，此為對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組則是加入39.5 mL水溶解。高壓滅菌(121 ℃，20 min)處理。待瓊脂冷卻至56 ℃左右時(shí)加入無(wú)菌脫纖維綿羊血5 mL，混抗0.5 mL，實(shí)驗(yàn)組需再分別加入5 mL濃度為40 mg/mL、20 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL頭花蓼液，使其平板濃度分別為4 mg/mL、2 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL充分混勻后傾倒于直徑為90 mm的無(wú)菌平皿中，培養(yǎng)基厚度約為3 mm～4 mm，使其成為含10%脫纖維羊血的布氏肉湯半固體培養(yǎng)基。

1.2.2 尿素酶蛋白活性的檢測(cè) 刮取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期幽門螺桿菌于腦心浸液肉湯中制備成濃度為1～9×108cfu/mL菌懸液，無(wú)菌棉簽涂布于空白平皿及含2 mg/mL頭花蓼藥平皿上，置于微需氧環(huán)境中37 ℃培養(yǎng)72 h，同樣操作傳代于新的平皿，共培養(yǎng)3代后，分別取100 mg于預(yù)冷的無(wú)菌PBS中。5 000 g離心5 min收集菌體，根據(jù)試劑盒說(shuō)明提取總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。參照Rokita E推薦的方法，根據(jù)GENMED細(xì)菌尿素酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)幽門螺桿菌的尿素酶活性。尿素酶活性的抑制率=(對(duì)照組-實(shí)驗(yàn)組)/對(duì)照組100%

1.2.3 細(xì)菌鞭毛動(dòng)力定量檢測(cè) 收集培養(yǎng)48 h生長(zhǎng)狀態(tài)良好的幽門螺桿菌懸于腦心浸液，調(diào)整菌液濃度至3×108CFU/L。菌液保存在4 ℃?zhèn)溆谩Ｈ?0 μL分別穿刺接種于實(shí)驗(yàn)組(含頭花蓼藥液)和對(duì)照組(含等量無(wú)菌去離子水)的布氏肉湯半固體瓊脂血平板上，相同濃度的各接種2個(gè)，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。分別測(cè)量實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組含藥培養(yǎng)基上幽門螺桿菌菌膜暈圈的直徑(直尺量其直徑)。

1.2.4 頭花蓼水提物對(duì)幽門螺桿菌粘附GES-1細(xì)胞粘附抑制實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 菌液的制備 刮取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期幽門螺桿菌，對(duì)照組：用不含雙抗細(xì)胞完全培養(yǎng)基調(diào)節(jié)菌液濃度為2×106cfu/mL，藥物組：分別用含藥濃度為128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL的無(wú)雙抗細(xì)胞完全培養(yǎng)基溶液調(diào)節(jié)菌液濃度為2×106cfu/mL。

1.2.4.2 細(xì)胞的培養(yǎng) 從-80 ℃液氮罐中取出凍存管，迅速置于37 ℃水浴箱，輕輕搖動(dòng)使其盡快融化。用一次性吸管吸取細(xì)胞懸液，注入預(yù)加有6 mL細(xì)胞培養(yǎng)基的離心管中，混合后，1 000 rpm/min，離心5 min，去除上清。將細(xì)胞接種于5 mL10% DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞的形態(tài)。

1.2.4.3 爬片實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的粘附 按照文獻(xiàn)方法[7-8]，采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GES-1細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞3次，胰酶消化，離心收集細(xì)胞，用不含雙抗細(xì)胞完全培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2×104個(gè)/mL，加入到放置有無(wú)菌蓋玻片的6孔板中，每孔2 mL，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，用PBS洗滌兩次，實(shí)驗(yàn)組分別加入含頭花蓼濃度為128 μg/ mL、64 μg/ mL、32 μg/ mL、16 μg/ mL細(xì)胞培養(yǎng)基配制的2×106cfu/mL的菌懸液2 mL，對(duì)照組加入不含藥物培養(yǎng)基配制的幽門螺桿菌菌懸液2 mL(設(shè)每個(gè)濃度做5個(gè)復(fù)孔)，放入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，取出用PBS洗滌3次，取出蓋玻片，自然干燥、甲醇固定15 min，PBS漂洗一次，以便漂掉蓋玻片上未粘附幽門螺桿菌，然后用革蘭染色，油鏡下觀察計(jì)數(shù)每個(gè)細(xì)胞上粘附的細(xì)菌數(shù)，每組計(jì)數(shù)30個(gè)細(xì)胞。計(jì)算每個(gè)細(xì)胞粘附細(xì)菌平均數(shù)，分析并計(jì)算抑制率。抑制率=(對(duì)照組-實(shí)驗(yàn)組)/對(duì)照組100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)幽門螺桿菌粘附定植相關(guān)基因表達(dá)水平

1.2.5.1 幽門螺桿菌總RNA提取 在頭花蓼水提物終濃度為2 mg/mL平板上培養(yǎng)至48 h后的幽門螺桿菌ATCC 700392設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，同批未經(jīng)頭花蓼處理的幽門螺桿菌ATCC 700392為對(duì)照組。將對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本用腦心浸液肉湯調(diào)試細(xì)菌懸液至1～9×107CFU/mL，采用Trizol法提取各組樣品的總RNA。

1.2.5.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR：將各組的幽門螺桿菌RNA按照TaKaRa試劑盒說(shuō)明書分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA后，以其為模板,以16SrRNA基因作為內(nèi)參,運(yùn)用SYBR ○R Premix Ex TaqTMII試劑盒在ROCHE Light Cycler480熒光定量PCR儀上檢測(cè)鞭毛相關(guān)基因flaA、flaB,尿素酶活性基因ureE、ureF及粘附素基因babA、alpA、alpB引物設(shè)計(jì)采用的Primer Primer 5.0軟件。相關(guān)基因引物序列見表1。引物委托上海生工公司合成。25 μL PCR反應(yīng)體系：目的基因的上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，SYBR Premix EX TaqTMⅡ(2X) 12.5 μL, RNase Free ddH2O 8 μL，ROX Reference Dye(50×)0.5 μL。反應(yīng)條件為: 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每一個(gè)樣品3個(gè)技術(shù)重復(fù)，每組做3個(gè)生物重復(fù)。每次PCR反應(yīng)均設(shè)置陰性對(duì)照(ddH2O代替cDNA 模板)。采用比較2-△△CT法，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表1 PCR引物序列
Tab.1 Primers sequence of PCR

基因名稱(Gene)引物序列(5'to3')(Primersequence)產(chǎn)物長(zhǎng)度(bp)(Productlength)16SrRNA-FCCGCCTACGCGCTCTTTAC10016SrRNA-RCTAACGAATAAGCACCGGCTAACflaA-FATTGGCGTGTTAGCAGAAGTGA99flaA-RTGACTGGACCGCCACATCflaB-FACATCATTGTGAGCGGTGTGA95flaB-RGCCCCTAACCGCTCTCAAATbabA-FTGCTCAGGGCAAGGGAATAA95babA-RATCGTGGTGGTTACGCTTTTGalpA-FGCACGATCGGTAGCCAGACT90alpA-RACACATTCCCCGCATTCAAGalpB-FACGCTAAGAAACAGCCCTCAAC82alpB-RTCATGCGTAACCCCACATCAureFFGGGGCTTGTGGATAGCATAA206ureFRCGCATTCTTTTGGGCTAGAAureEFTCTTGGCTTGGATGTGAATG185ureERGGAATGGTTTGAAACGAGGAureBFGGTCCTGCTGATGGCACTA236ureBRGCGTCGTTAGAAGCGTTACG

3 結(jié) 果

3.1 頭花蓼水提物對(duì)細(xì)菌尿素酶活性的影響 采用尿素酶活性比色法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的尿素酶活性，顯示頭花蓼作用后幽門螺桿菌尿素酶活性與對(duì)照組相比顯著降低，為184.78 mIU/min±4.74 mIU/min，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的尿素酶活性抑制率為44.90±0.289。見圖1。

圖1 頭花蓼對(duì)幽門螺桿菌尿素酶活性的影響Fig.1 Effect of P. capitatum on H. pylori urease activity

3.2 苗藥頭花蓼作用對(duì)幽門螺桿菌鞭毛動(dòng)力的影響 幽門螺桿菌在半固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，測(cè)量結(jié)果顯示1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC頭花蓼作用后幽門螺桿菌菌膜暈圈直徑顯著小于對(duì)照組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。藥物濃度的越大，幽門螺桿菌菌膜暈圈直徑越小。表明苗藥頭花蓼可降低幽門螺桿菌鞭毛動(dòng)力，且幽門螺桿菌鞭毛動(dòng)力的抑制程度與苗藥頭花蓼藥物濃度呈劑量相關(guān)性。見表2。

表2 頭花蓼作用前后幽門螺桿菌菌膜圈直徑的變化
Tab.2 Primers sequence of PCR

組別Group菌膜圈直徑(mm)Bacterialcirclediameter對(duì)照組16.00±1.001/8MIC組11.67±1.53*1/4MIC組8.50±0.50*1/2MIC組5.67±0.55*

*與空白組相比P<0.05

3.3 不同頭花蓼藥物濃度對(duì)細(xì)菌粘附的影響 各藥物濃度作用下，細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的粘附情況見圖2。A圖為GES-1細(xì)胞在低倍鏡下的正常形態(tài)。油鏡下，對(duì)照組可見幽門螺桿菌局灶性粘附GES-1細(xì)胞的一側(cè)，呈現(xiàn)趨向性。不同濃度(16 μg/mL、32 μg/mL、64 μg/mL、128 μg/mL)頭花蓼對(duì)幽門螺桿菌粘附GES-1細(xì)胞均有抑制作用，細(xì)胞上粘附的細(xì)菌數(shù)均顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。粘附細(xì)菌數(shù)量隨著藥物濃度的增加而減少，在128 μg/mL頭花蓼組粘附的細(xì)菌數(shù)量最少。粘附呈彌漫性粘附，無(wú)規(guī)則地粘附在GES-1細(xì)胞表面。見表3。

注：A細(xì)胞爬片革蘭染色(×100)； B對(duì)照組(×1 000)；C為16 μg/mL頭花蓼處理組(×1 000) ；D為32 μg/mL頭花蓼處理組(×1 000)；E為64 μg/mL頭花蓼處理組(×1 000)；F為128 μg/mL頭花蓼處理組(×1 000)A：Cell slide Gram stain(×100)，B: The control group A: experimental group(×1 000)，C：The 16 μg/mL P. capitatum group(×1 000)，D：The 32 μg/mL P. capitatum group；(×1 000)，E：The 64 μg/mL P. capitatum group(×1 000)，F(xiàn)：The 128 μg/mL P. capitatum group(×1 000)圖2 不同頭花蓼濃度對(duì)幽門螺桿菌粘附的影響Fig.2 Effect of different concentration of P. capitatum on H. pylori adhesion to cells

表3 不同頭花蓼藥物濃度對(duì)細(xì)菌粘附的影響
Tab.3 Effect of different concentration of P. capitatum on H. pylori adhesion to cells

頭花蓼濃度P.capitatumconcentration對(duì)照組Thecontrolgroup16μg/mL32μg/mL64μg/mL128μg/mL粘附細(xì)菌數(shù)/個(gè)Numberofadherentbacteria58.5±4.5534.50±4.55*26.40±2.81*18.37±3.88*13.4±1.90*抑制率Inhibitionrate—0.410.550.690.77

*P<0.05vs control group

3.4 頭花蓼作用對(duì)定植相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響 以16SrRNA 基因作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法對(duì)頭花蓼對(duì)幽門螺桿菌作用后對(duì)定植相關(guān)基因表達(dá)差異進(jìn)行分析。在頭花蓼作用幽門螺桿菌前后，尿素酶基因ureB、ureE、ureF，鞭毛相關(guān)基因flaA、flaB，粘附素基因babA、alpA、alpB均有表達(dá)，其中對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組相比其表達(dá)量有顯著差異(P<0.05)，且對(duì)照組>實(shí)驗(yàn)組。其中babA基因變化下調(diào)最為明顯，為17.3倍。見圖4。

圖4 頭花蓼對(duì)幽門螺桿菌粘附定植相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄的影響Fig.4 Effect of P. capitatum on Transcription of genes related to H. pylori colonization

4 討 論

幽門螺桿菌的致病機(jī)制包括諸多環(huán)節(jié)，其中定植是致病的關(guān)鍵，而粘附是定植的前提，幽門螺桿菌之所以能夠在胃腸蠕動(dòng)是不會(huì)與食物一起驅(qū)除的原因是幽門螺桿菌的動(dòng)力比其他菌種強(qiáng)，這使幽門螺桿菌能夠快速穿過(guò)胃腔的酸性環(huán)境達(dá)到中性的粘液層中，并穿過(guò)粘稠的粘液層，定植與胃黏膜上，幽門螺桿菌可產(chǎn)生大量的尿素酶，約占菌體總蛋白的10%[9]。尿素酶是幽門螺桿菌產(chǎn)生的一種能將尿素水解為氨和二氧化碳的酶，在菌體周圍形成“氨云”，使pH值升高引起的低酸可降低黏液中黏蛋白的含量，破壞黏液的離子完整性，削弱胃黏膜屏障功能，使細(xì)菌能夠順利穿過(guò)胃黏液層到達(dá)胃黏膜表面[10-11]。他對(duì)于幽門螺桿菌的定植和生存起著重要的作用?？?jié)兯幬镆揽ū短乜赏ㄟ^(guò)抑制幽門螺桿菌的尿素酶活性抑制幽門螺桿菌定植而達(dá)到輔助治療幽門螺桿菌慢性胃炎等消化性疾病[12]。幽門螺桿菌尿素酶基因族共包含九個(gè)基因，其中ureE、ureF為尿素酶活性基因，他們一起為尿素酶的活性表達(dá)所必須[13]。本研究采用比色法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的尿素酶活性，觀察到在頭花蓼的作用下，尿素酶活性降低。同時(shí)檢測(cè)幽門螺桿菌尿素酶活性蛋白基因ureE、ureFmRNA水平與平行培養(yǎng)的對(duì)照組相比分別下調(diào)3.77倍和5.09倍。因此推測(cè)苗藥頭花蓼除了通過(guò)抑制尿素酶活性降低其催化效率外，還通過(guò)影響尿素酶基因的轉(zhuǎn)錄，降低幽門螺桿菌尿素酶的生成量降低幽門螺桿菌對(duì)尿素酶的催化效率，進(jìn)而降低幽門螺桿菌在胃的生存能力。

當(dāng)幽門螺桿菌進(jìn)入胃后，在尿素酶提供的微環(huán)境前提下，鞭毛的擺動(dòng)使細(xì)菌作旋轉(zhuǎn)前進(jìn)，穿透覆蓋于胃粘膜上皮細(xì)胞的粘液層。故認(rèn)為鞭毛的動(dòng)力可直接影響菌株在宿主的定植及生存能力。菌株動(dòng)力性與其在宿主的感染率成正比，動(dòng)力極強(qiáng)的菌株感染率可達(dá)100%,無(wú)鞭毛菌株或鞭毛突變株則不能成功定植于胃黏膜。幽門螺桿菌的鞭毛蛋白由2個(gè)鞭毛素基因falA和flaB編碼的FalA、FlaB蛋白多聚體組成。這兩種鞭毛蛋白對(duì)于細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)均是必須的。本研究中，幽門螺桿菌含苗藥頭花蓼水提取的半固體瓊脂平板上的游泳運(yùn)動(dòng)能力明顯小于對(duì)照組，說(shuō)明其可降低細(xì)菌的游泳動(dòng)力。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示頭花廖可顯著下調(diào)flaA、flaB基因的表達(dá)。推測(cè)苗藥頭花蓼作用可能通過(guò)影響幽門螺桿菌鞭毛相關(guān)基因falA、flaB影響其編碼FalA、FlaB鞭毛蛋白的從而抑制幽門螺桿菌的運(yùn)動(dòng)能力。

在尿素酶提供的微環(huán)境和鞭毛提供動(dòng)力下，幽門螺桿菌順利到達(dá)相對(duì)中性的胃粘膜表面，此時(shí)幽門螺桿菌通過(guò)粘附素特異性的直接與宿主細(xì)胞、粘蛋白等結(jié)合使幽門螺桿菌能在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期生存。幽門螺桿菌這種特異性的粘附反映了它存在粘附因子，其中最為重要是BabA，AlpA和AlpB。BabA是血型抗原結(jié)合性粘附素，介導(dǎo)幽門螺桿菌的初始粘附[14]。AlpA和AlpB由高度同源的基因alpA和alpB編碼，alpA、alpB主要與宿主的黏連蛋白層結(jié)合介導(dǎo)細(xì)菌與胃粘膜組織的粘附，當(dāng)alpA和alpB缺失情況下，可以減少幽門螺桿菌在動(dòng)物的定植量[15]在體外細(xì)胞爬片實(shí)驗(yàn)中觀察，頭花蓼作用后幽門螺桿菌對(duì)GES-1細(xì)胞的粘附數(shù)量減少，表明頭花蓼可以抑制幽門螺桿菌對(duì)GES-1細(xì)胞的粘附。熒光定量PCR檢測(cè)頭花蓼作用前后粘附素BabA、AlpA、AlpB的基因水平，頭花蓼作用后粘附素BabA、AlpA、AlpB的mRNA水平均下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。推測(cè)當(dāng)苗藥頭花蓼作用通過(guò)抑制babA基因表達(dá)影響幽門螺桿菌表面粘附素BabA的生成量，由BabA介導(dǎo)的細(xì)菌初始粘附能力降低。同時(shí)等位基因編碼的alpA、alpB粘附素基因表達(dá)同樣受到抑制，alpA、alpB的抑制可降低細(xì)菌在胃粘膜的定植量。

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Luo Zhaoxun,Email：2860330236@qq.com

Influence ofPolygonumcapitatumon the adherency and colonization ofHelicobacterpylori

ZHANG Shu1,LUO Zhao-xun2,MO Fei1,HE Yun1,SUN Chao-qin2,ZHANG Wan-ying1,CAO Yu-qiao1,ZHANG Lan1

(1.BiochemistryAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversityGuiyang550004,China；2.DepartmentofClinicalLaboratory,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

We aimed to observe the influence ofP.capitatumon adherency and colonization ofH.pylori. Urease active colorimetric method would be adopted to quantitatively detect the influence on urease activity ofH.pyloribefore and after the function ofP.capitatum; semi-solid Brucella agar plate method would be used to detect the influence on flagellar movement ofH.pyloribefore and after the function ofP.capitatum; Gram’s stain of cell slides would be utilized to observe the changes of different concentrations ofP.capitatumandH.pylorion the bacteria adhered on the surface of GES-1 cells and calculate the inhibition ratio of all groups; real-time PCR technologies would be adopted to detect the expression level of related genes ofureE,ureF,flaA,flab,babA,alpAandalpBbefore and after the function ofP.capitatum.P.capitatumhad inhibition effect on urease activity ofH.pyloriwith the inhibition ratio being 44.90±0.289. The concentration ofP.capitatumwas respectively 1/2MIC, 1/4MIC and 1/8MIC; after respective function, the diameter ofH.pyloripellicle halo was significantly smaller than that of the control group, respectively (5.67±0.55) mm, (8.5±0.50) mm and (11.67±1.53) mm with statistical difference (P<0.05); different concentrations ofP.capitatumcould all inhibit the bacteria to adhere to gastric epithelial cells and compared to the control groups, all concentration groups were with statistical difference (P<0.05). After the function ofP.capitatum, compared to the control group, the expression level of urease active genesureEandureF, flagellin genes flab and flaA as well as adhesion genesbabA,alpAandalpBmRNA was reduced with statistical difference (P<0.05). It came to the conclusion thatP.capitatumhas obvious inhibition effect onH.pylori, which exerts its antibacterial effect via inhibiting urease activity ofH.pylori, slowing down the flagella movement ofH.pyloriand impacting the adherence ofH.pylorito gastric epithelial cells.

Helicobacterpylori,Polygonumcapitatum,ureases,flagella；adherence

2014年地方高校國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(No.201410660014)和2014年貴州省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(No.201410660014)聯(lián)合資助

羅昭遜，Email：2860330236@qq.com

1.貴州醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)教研室，貴陽(yáng) 550004；

2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴陽(yáng) 550004

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.08.010

R378

A

1002-2694(2016)08-0734-07

2016-02-21；

2016-04-20

貴州省科技合作計(jì)劃基金(No.黔科合LH(2015)7417號(hào))；貴州省衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)基金(No.gzwjkj2015-1-003)

Supported by the Special Funds for the Joint Fund from the Scientific and Technological Cooperation Plan Fund in Guizhou (No.Qian Scientific Cooperation LH (2015) 7417),the Joint Fund from the Science and Technology Fund at Sanitation and Family Planning Commission in Guizhou (No.gzwjkj2015-1-003),the Joint Fund from the Science and Technology Plan Project in Guiyang (Construction Scientific Cooperation [No.20141001]);the Joint Fund from the,National University Student Innovation and Entrepreneurship Training Program in local universities in 2014 (No.201410660014)the Joint Fund from the University Student Innovation and Entrepreneurship Training Program in Local Universities in 2014 (No.201410660014)