張明 賈曉鵬 王曉波 胡現(xiàn)斌 于國強(qiáng)

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·論著·

精索靜脈曲張對睪丸超微結(jié)構(gòu)和精子形態(tài)影響的實驗研究

張明 賈曉鵬 王曉波 胡現(xiàn)斌 于國強(qiáng)

目的 揭示精索靜脈曲張導(dǎo)致男性不育的機(jī)制。方法 將 SD(Sprayue-Dawley)三級雄性大鼠隨機(jī)編號，雙數(shù)為實驗組即精索靜脈曲張組，單數(shù)組為觀察組，精索靜脈曲張動物模型按Turner法制造。第12周將2組大鼠分別脫頸處死，摘取2組動物左側(cè)睪丸后，以透射電鏡觀察睪丸的超微結(jié)構(gòu)。摘取2組動物的附睪，并分離出其內(nèi)精子。觀察精子密度、活力及運動參數(shù)。在光學(xué)顯微鏡下觀察精子的形態(tài)，計算精子畸形率。結(jié)果 實驗組電鏡觀察與觀察組相比較，支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及精子細(xì)胞核明顯變化(P<0.05)。實驗組的結(jié)果與觀察組比較，精子的運動指標(biāo)：MAD、WPB、LIN、BCF值無明顯的變化(P>0.05)，其他觀察指標(biāo)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 精索靜脈曲張導(dǎo)致睪丸精原細(xì)胞核等超微結(jié)構(gòu)的改變，對睪丸間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞造成創(chuàng)傷。精索靜脈曲張可降低精子的運動能力，并使精子的畸形率明顯增加。

精索靜脈曲張；大鼠；動物模型；睪丸細(xì)胞；精子

在男性不育癥的病因中，精索靜脈曲張占第一位，因其影響男性的生育能力的問題越來越受到重視[1]。大量研究表明，精索靜脈曲張的患者睪丸萎縮、精子產(chǎn)生量減少、性激素下降。但是精索靜脈曲張導(dǎo)致男性不育的機(jī)制尚不明確[2]。本課題對雄性大鼠制造精索靜脈曲張的動物模型，通過觀察實驗組大鼠的睪丸的病理變化以及精子形態(tài)和運動的異常，探討精索靜脈曲張導(dǎo)致男性不育的病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型建立

1.1.1 選擇動物和分組：選擇飼養(yǎng)條件相同的健康SD(Sprayue-Dawley)三級(青春期)雄性大鼠共40只(河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)，鼠齡40～60 d，體重240～280 g。將入組大鼠采用隨機(jī)原則分組：實驗組(精索靜脈曲張組)20只，觀察組(假手術(shù)組)20只。

1.1.2 制造動物模型：動物模型按Turner[3]的方法制造:①將所有入組大鼠麻醉。②制定實驗組靜脈曲張模型：固定大鼠在實驗板上，縱切口，部位為上腹部左側(cè)0.5 cm處，分離出腎臟、左腎靜脈、左腎上腺靜脈，在左腎上腺靜脈和左腎靜脈之間置于直徑約0.8 mm注射器針頭,將針頭、左腎靜脈用3-0的絲線在其交叉處結(jié)扎，拔出針頭。③觀察組(假手術(shù)組)，分離左腎靜脈，不結(jié)扎。其余步驟與實驗組相同。④術(shù)后處理：避免感染，所有入組大鼠，給予青霉素劑量20萬U，1次/d，腹腔注射，連用3 d。⑤判斷動物模型是否成功：術(shù)后第12周，處死所有大鼠，實驗組大鼠，左右兩側(cè)腎臟比較：重量、形態(tài)無明顯差別，而左側(cè)精索靜脈明顯擴(kuò)張(直徑>1 mm)表示成功。

1.2 標(biāo)本采集、檢測

1.2.1 睪丸電鏡標(biāo)本觀察：①摘取入組大鼠的左側(cè)睪丸，切取睪丸組織(約1 mm)。②按如下步驟制備切片：固定24 h(1%多聚甲醛及2%戊二醛混合液),漂洗12 h( pH值7.4的PBS液),再固定2 h(1%四氧化鋨酸液),再漂洗(pH值7.4的PBS液),脫水(梯度乙醇),包埋(環(huán)氧樹脂)、切片、染色(醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛)。③用透射電子顯微鏡(HITACHI-H7500型)觀察切片。

1.2.2 精液標(biāo)本采集及檢測方法：所有入組大鼠，分離出附睪尾部，，將尾部縱行切開3個切口，放入離心管內(nèi)，加PBS液到2 ml,然后放入水浴箱(水溫為37℃)內(nèi)，精子自由游出， 約溫浴20 min[4]。

1.2.2.1 觀察精子運動的能力：采用計算機(jī)輔助精液分析儀(CASA)系統(tǒng)觀察精子運動能力并分析數(shù)據(jù)參數(shù)。

1.2.2.2 觀察精子的形態(tài)：將精子懸液固定，1%伊紅染液染色[5]。用光鏡觀察精子的形態(tài)并作出形態(tài)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，正態(tài)分布的計量資料以±s表示，非正態(tài)分布用中位數(shù)表示，均數(shù)比較用t檢驗，中位數(shù)比較用Wilcoxon 符號秩檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)的結(jié)果

2.1.1 支持細(xì)胞:觀察組表現(xiàn)：細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則或高錐體形或三角形，基部與基膜緊密相連，頂部向曲精小管腔面突出。核大呈橢圓形或三角形，不規(guī)則，頂部形成陷窩，核仁明顯，胞質(zhì)有豐富的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，有發(fā)達(dá)的高爾基復(fù)合體，在側(cè)面見到Sertoli-Sertoli細(xì)胞連接。實驗組表現(xiàn)：基底膜水腫，基部與基膜分離，Sertoli-Sertoli連接斷裂，細(xì)胞大片融合，細(xì)胞器明顯胞質(zhì)減少，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大的空泡。見圖1、2。

圖1 假手術(shù)組精索靜脈曲張大鼠睪丸組織支持細(xì)胞電鏡觀察結(jié)果(×15000)

圖2 精索靜脈曲張組精索靜脈曲張大鼠睪丸組織支持細(xì)胞電鏡觀察結(jié)果(×15000)

2.1.2 間質(zhì)細(xì)胞:①觀察組表現(xiàn)：細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，表面有大量細(xì)長的微絨毛，胞質(zhì)呈嗜酸性，線粒體多，呈管嵴狀，富含滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞核較大，呈圓形或卵圓形，胞質(zhì)內(nèi)無顆粒。②實驗組表現(xiàn)：細(xì)胞表面的微絨毛明顯減少，細(xì)胞器明顯減少，胞質(zhì)內(nèi)有大量溶酶體顆粒。大量細(xì)胞凋亡。見圖3、4。

圖3 假手術(shù)組精索靜脈曲張大鼠睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞電鏡觀察結(jié)果(×20000)>

圖4 精索靜脈曲張組精索靜脈曲張大鼠睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞電鏡觀察結(jié)果(×20000)

2.1.3 實驗組精子細(xì)胞表現(xiàn)為：精子細(xì)胞頭部無頂體，核畸形，核膜消失，染色質(zhì)濃縮成塊狀。見圖5。

圖5 精索靜脈曲張組精索靜脈曲張大鼠睪丸組織精子細(xì)胞電鏡觀察結(jié)果(×20 000)

2.2 精液分析的結(jié)果 實驗組與觀察組相比，MAD、LIN、BC、WOB四個參數(shù)值無明顯變化，MOT、STR兩個參數(shù)值明顯降低(P<0.05)；精子密度、精子活率、a、b級快速前向運動、VAP、VSL、VCL、ALH的值明顯降低(P<0.01)；精子細(xì)胞的畸形率顯著增加(P<0.01)。見表1。

表1 2組CASA系統(tǒng)的精液分析結(jié)果 n=20,±s

表1 2組CASA系統(tǒng)的精液分析結(jié)果 n=20,±s

注：與觀察組比較,*P<0.05,#P<0.01

項目觀察組實驗組精子密度(106/ml)260.19±159.82100.76±86.43#MOT(%)4.38±7.9444.63±16.54*直線運動精子密度(106/ml)48.35±28.9616.72±9.23#直線運動精子活率(%)19.70±11.0611.08±6.80#VAP(μm/ml)20.76±6.5414.94±5.08#a(%)23.88±7.9015.20±7.73#b(%)9.74±4.816.21±2.68#VCL(μm/ml)42.74±15.6721.21±13.10#VSL(μm/ml)12.74±5.207.33±3.30#BCF(Hz)7.17±1.267.26±1.62MAD(°/s)266.21±37.92266.00±40.04LIN%24.78±8.9621.35±9.53STR%56.09±7.4750.2±7.11*WOB%40.96±12.0639.08±12.10ALH(μm/ml)1.14±0.450.65±0.42#精子畸形率(%)22.88±3.7355.33±1.04#

3 討論

隨著社會發(fā)展，男性不育越來越受到關(guān)注。在男性不孕的眾多病因中，精索靜脈曲張位居首位，病例中占 19%～41%[6]。但精索靜脈曲張導(dǎo)致不育的機(jī)制尚不清楚。

睪丸支持細(xì)胞被認(rèn)為是一種極性細(xì)胞，具有旺盛的分泌功能，主要分泌雄激素結(jié)合蛋白、激素類(如抑制素和激動素)等物質(zhì)，并具有營養(yǎng)和吞噬功能。睪丸間質(zhì)細(xì)胞可合成、分泌雄激素-睪酮。睪酮對生精過程具有維持效應(yīng)[7]。孟慶杰等[8]指出受精能力與精子的頂體形態(tài)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，精子的頂體形態(tài)結(jié)構(gòu)可作為評價男性生育能力的指標(biāo)。頂體消失或頂體畸形，使得精子的活動率明顯下降，精子與卵子結(jié)合受阻，影響受精，導(dǎo)致不育。

精子密度也是影響男性生育能力的指標(biāo)。本研究證明，精索靜脈曲張的大鼠，精子密度、精子活率明顯下降(P<0.05)。精索靜脈曲張使得精子成熟障礙，主要是精索靜脈曲張啟動了免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生大量的抗精子抗體，使得精子成熟障礙[9]，從而影響男性的生育能力。

通常采用精子的密度、活力、運動方式參數(shù)對精子運動能力進(jìn)行測定[10]。精子與卵子相遇前，精子在子宮和輸卵管處獲能后，精子運動方式發(fā)生劇烈而活躍的運動才能在女性輸卵管內(nèi)穿行，與等待的卵子結(jié)合完成受精。本研究表明，實驗組精子活力參數(shù)VCL、VSL、VAP明顯降低 (P<0.01)。而BCF、MAD值兩組之間無顯著變化(P>0.05)。精子運動方式參數(shù)實驗組與觀察組相比，運動方式參數(shù)LIN、WOB之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而ALH、STR之間存在差異(ALH:P<0.01；STR:P<0.05)，但參數(shù)STR兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.046)。此結(jié)果有待進(jìn)一步驗證其準(zhǔn)確性。也就是精索靜脈曲張使得精子運動能力下降，精子無法于輸卵管穿行，完成受精，影響了男性的生殖能力。

Liu等[11]研究指出形態(tài)正常的精子才能與透明帶緊密結(jié)合，并穿過透明帶，完成受精過程。本研究表明，精索靜脈曲張使精子畸形率明顯升高 (P<0.01)，導(dǎo)致男性不育。

綜上所述，本實驗解釋了精索靜脈曲張的大鼠模型，睪丸細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)(包括支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞)、精子的形態(tài)異常導(dǎo)致精子的運動、活度等方面異常，導(dǎo)致受精不能完成，引起不育。這為臨床上精索靜脈曲張的男性不育患者，臨床治療提供了可靠的依據(jù)。

1 麥芒，何學(xué)軍，王魯華，等.精索靜脈曲張患者精索靜脈血與外周血性激素含量對照分析.放射免疫學(xué)雜志，2003，16：74-76.

2 郭應(yīng)祿，李宏軍主編．男性不育癥.第1版.北京：人民軍醫(yī)出版社，2003.278-283．

3 Turner TT.The study of varicocele through the use of animal models.Hum Reproduction Update,2001,7:78-84.

4 蒲育棟,王坤,黨瑜慧,等.芹菜汁對小鼠精液參數(shù)及毒性作用的影響.中國計劃生育學(xué)雜志,2008,3:156-158.

5 范瑞泉，魏青，丘欽英，等.小鼠精子畸形試驗改良法與傳統(tǒng)法效果比較.華南預(yù)防醫(yī)學(xué)，2004，30:51-52.

6 Lui WY,Mruk D,Lee WM,et al.Sertoli cell tight junction dynamics: their regulation during spermatogenesis.Biol Reprod.,2003,68:1087-1097.

7 姚泰主編.生理學(xué).第7版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2001.503-504.

8 孟慶杰,鄒成安,周玉霞,等.正常男性與不育男性的精子運動參數(shù)CASA分析.中國男科學(xué)雜志,2002,16:125-126.

9 Green S,Fishel S.Morphology comparison of individually selected hyperactivated and nonhyperactivated human spermatozoa.Hum Reprod,1999,14:123-130.

10 Bozheddomov VA,Teodorovich OV.Epidemiology and causes of auto immune male infertility.Urologiia,2005,1:35-44.

11 Liu de Y,Baker HW.Frequency of defectives permzona pellucida interaction in severely teratozoo spermic infertile men.Hum Reprod,2003,18:802-807.

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.22.030

項目來源：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題計劃(編號：2012-A09)

063000 河北省唐山市，華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院急診科(張明),呼吸內(nèi)科(王曉波);河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院泌尿外科(賈曉鵬);河北省武安市第一人民醫(yī)院泌尿外科(胡現(xiàn)斌);河北省玉田縣醫(yī)院外一科(于國強(qiáng))

賈曉鵬，050051 石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院泌尿外科;

E-mail：41110571@qq.com

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A

1002-7386(2016)22-3466-03

2016-05-23)