李會(huì)英 李國(guó)興 崔佳 劉哲敏 杜寧 劉學(xué)聰 喬玉巧

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·論著·

黃芩苷對(duì)牙周炎大鼠牙齦組織及外周血中IL-8表達(dá)的影響

李會(huì)英 李國(guó)興 崔佳 劉哲敏 杜寧 劉學(xué)聰 喬玉巧

目的 采用大腸桿菌脂多糖誘導(dǎo)大鼠牙周炎模型，觀察黃芩苷對(duì)牙周炎大鼠牙齦組織及外周血中白介素-8(IL-8)表達(dá)水平的影響。方法 選用50只8周齡SD大鼠，隨機(jī)分成5組，每組10只，A組為正常對(duì)照組，B組為牙周炎組，C1、C2、C3組為黃芩苷治療組(分別以0.01、0.1、1.0 μg/ml黃芩苷治療)，治療1周后處死大鼠采取其外周血及牙齦組織，采用微量樣本多重蛋白定量技術(shù)(CBA)檢測(cè)外周血中IL-8表達(dá)含量，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)牙齦組織中IL-8的表達(dá)含量。結(jié)果 牙周炎組大鼠牙齦組織及外周血中IL-8表達(dá)含量均明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)，黃芩苷治療組大鼠牙齦組織中IL-8和外周血中IL-8表達(dá)含量均明顯低于牙周炎組(P<0.05)，且C1、C2、C3組IL-8水平逐漸下降(P<0.05)。結(jié)論 黃芩苷可以降低牙周炎大鼠牙齦組織和外周血中IL-8的表達(dá)含量，抑制脂多糖對(duì)大鼠牙周組織的損傷作用。

黃芩苷；牙周炎；牙齦組織；外周血；IL-8

牙周炎是發(fā)生在牙齒支持組織的炎癥破壞性疾病，其發(fā)病的始動(dòng)因子主要為菌斑和細(xì)菌，細(xì)菌內(nèi)毒素的主要毒性成分脂多糖(LPS)既可引起牙周局部組織的損害，又可引起宿主防御細(xì)胞釋放多種炎性細(xì)胞因子[如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-8(IL-8)和白介素-6(IL-6)等]，進(jìn)一步導(dǎo)致牙周組織的損傷[1]。研究表明，IL-8是一種具有趨化、激活和調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞活性的炎性因子，參與牙周組織炎性反應(yīng)[2]，可反映牙周炎的靜止與活動(dòng)水平，與牙周炎的治療有關(guān)。黃芩苷的藥理活性主要為抑菌、清熱、抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)等[3]，本研究中牙周局部應(yīng)用黃芩苷治療大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)和微量樣本多重蛋白定量技術(shù)(CBA)分別檢測(cè)大鼠牙齦組織和外周血中 IL-8的表達(dá)含量，觀察大鼠牙齦組織及外周血中IL-8表達(dá)含量的改變，探討黃芩苷治療牙周炎的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康清潔級(jí)雄性8周齡SD大鼠50只(河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)1410084)，體重(220±20) g。大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼料喂飼大鼠，自由攝取水和食物。

1.1.2 主要藥品與儀器：大腸桿菌ATCC O55:B5脂多糖 (美國(guó)sigma公司)，黃芩苷(中國(guó)藥物生物制品檢定所)，大鼠IL-8 CBA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD公司)；大鼠IL-8酶聯(lián)免疫試劑盒(上海森雄科技有限公司)。流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，SPECTRAⅠ酶標(biāo)儀(澳大利亞CRYOLOGIC 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配制:于2 ml 0.9%氯化鈉溶液中溶解2 mg黃芩苷，加入碳酸氫鈉調(diào)整pH值7.4，直至完全溶解為1 mg/ml的溶液，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫囼?yàn)時(shí)用0.9%氯化鈉溶液稀釋至所需濃度；取10 mg LRS，用0.9%氯化鈉溶液稀釋至1 mg/ml的溶液。LPS終末濃度為1 mg/ml，黃芩苷終末濃度為0.01、0.1、1.0 μg/ml。

1.2.2 動(dòng)物分組及牙周炎模型的建立：將50只SD實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為5組：A組為正常對(duì)照組、B組為牙周炎組、C1、C2、C3組分別為0.01、0.1、1.0 μg/ml黃芩苷治療組，每組10只。A組除外，用10%水合氯醛(0.3 g/kg)腹腔注射,將B組、C1、C2、C3組大鼠麻醉成功后，在大鼠右側(cè)上頜第1、2磨牙之間頰腭側(cè)齦溝底注射LPS(1 mg/ml)各0.2 ml，每天在同一部位重復(fù)注射1次，連續(xù)3 d，每天探診各組大鼠牙周袋深度，觀察牙周組織、全身狀況、毛發(fā)、食欲及糞便情況，直至1周后大鼠牙周炎模型建立。

1.2.3 黃芩苷的局部治療：大鼠牙周炎模型形成后第2天開始用藥，分別在C1、C2、C3組大鼠右側(cè)上頜第1、2磨牙之間頰腭側(cè)齦溝底注射0.01、0.1、1.0 μg/ml黃芩苷溶液各0.2 ml，B組大鼠的同部位注射等量0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)用藥3 d，各組分籠飼養(yǎng)。繼續(xù)每天探診5組大鼠牙周袋深度，觀察5組大鼠牙周組織、全身狀況、毛發(fā)、食欲及糞便情況。

1.2.4 動(dòng)物處死及標(biāo)本采集：用藥后第7天，10%水合氯醛腹腔注射麻醉成功后，于腹主動(dòng)脈取血5 ml，3 500 r/min離心，取上清液，-70℃冰箱保存，用于外周血中IL-8含量的檢測(cè)；用頸椎脫臼法處死各組大鼠，5 min內(nèi)取其右上頜第1、2磨牙頰腭側(cè)實(shí)驗(yàn)處新鮮牙齦組織，液氮驟冷后，-70℃冰箱保存，用于牙齦組織中IL-8含量的檢測(cè)；再剪取各組大鼠的右上頜第1、2磨牙實(shí)驗(yàn)處的牙、牙槽骨及牙周組織，用0.9%氯化鈉溶液沖洗后，10%甲醛固定24 h，10%EDTA脫鈣，石蠟包埋，制作磨牙頰腭向石蠟切片，每片厚度為5 μm，蘇木精-伊紅染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠牙周組織病理變化情況。

1.2.5 大鼠外周血中IL-8表達(dá)含量的測(cè)定：將已分離的血清上清液標(biāo)本從冰箱取出置于室溫下，待溶解后采用微量樣本多重蛋白定量技術(shù)(CBA技術(shù))，通過流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)檢測(cè)IL-8的含量，具體按試劑盒說明書操作。

1.2.6 大鼠牙齦組織中IL-8 表達(dá)含量測(cè)定：將采集的牙齦組織從冰箱取出置于室溫下，待溶解后準(zhǔn)確稱重，按重量體積比加緩沖液PBS制備成10%的組織勻漿，2 000 r/min離心10 min，取其上清液，采用LISA法檢測(cè)IL-8含量，具體按試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)和方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況觀察 注射LPS后第2天，B組、C1、C2、C3組大鼠開始出現(xiàn)神態(tài)萎靡、活動(dòng)減少、皮毛疏松、進(jìn)食水減少、大便較干燥，隨著注射LPS次數(shù)的增加，上述癥狀逐漸加重；B組局部注射0.9%氯化鈉溶液后大鼠牙齦仍明顯腫脹，神態(tài)倦怠、活動(dòng)較少、皮毛無光澤、進(jìn)食水較少、大便干燥，上述癥狀無明顯改善；C1、C2、C3組大鼠注射黃芩苷治療后，全身狀態(tài)逐漸改善，神態(tài)趨于正常，皮毛光澤改善，進(jìn)食、活動(dòng)增多，以C3組效果最明顯。實(shí)驗(yàn)期間A組大鼠神態(tài)、活動(dòng)、皮毛光澤、飲食水、大便均正常。

2.2 大鼠口腔肉眼觀察 注射LPS后第2天，B組、C1、C2、C3組大鼠開始出現(xiàn)牙齦組織出現(xiàn)充血腫脹，探之易出血，隨著注射LPS次數(shù)的增加，上述癥狀逐漸加重，注射LPS后1周牙周袋形成，探診深度4～5 mm；B組大鼠局部注射0.9%氯化鈉溶液后，牙齦仍明顯腫脹，牙周袋深度4～5 mm；C1、C2、C3組大鼠注射局部黃芩苷治療后，全身狀態(tài)明顯改善，牙齦組織充血腫脹減輕，牙周袋變淺，探診深度3～4 mm；實(shí)驗(yàn)期間A組大鼠表現(xiàn)無明顯變化，牙齦組織無充血腫脹，無牙周袋形成。

2.3 大鼠牙周組織病理變化 光鏡下可見，B組牙齦上皮形成潰瘍，部分壞死，牙周袋內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，固有層血管擴(kuò)張及淋巴細(xì)胞滲出明顯，牙周膜纖維排列不齊，牙槽嵴表面部分吸收明顯，牙槽骨可見破骨細(xì)胞、骨吸收陷窩，骨質(zhì)疏松；C1、C2、C3組牙周組織表現(xiàn)較牙周炎組明顯好轉(zhuǎn)，牙周膜及牙槽骨結(jié)構(gòu)趨于正常，牙周袋變淺，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，固有層血管擴(kuò)張及淋巴細(xì)胞滲出減輕，牙周膜纖維束排列較整齊，牙槽骨內(nèi)破骨細(xì)胞、骨吸收陷窩較少，骨質(zhì)疏松明顯減輕；A組牙周膜纖維排列整齊，牙槽骨表面光滑，無明顯破骨細(xì)胞和骨吸收陷窩形成，牙齦上皮和上皮下結(jié)締組織結(jié)構(gòu)較完整。見圖1。

圖1 光鏡下5組牙周組織形態(tài)(HE×4)

2.4 黃芩苷對(duì)大鼠外周血和牙齦組織中IL-8表達(dá)含量的影響 牙齦組織大鼠外周血牙周炎組中IL-8含量明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)，而C1、C2、C3組IL-8含量均較B組明顯降低(P<0.05)，且C1、C2、C3組的IL-8含量逐漸下降(P<0.05)。見表1,圖2。

表1 2組組織及其外周血中IL-8的表達(dá) n=100，±s

表1 2組組織及其外周血中IL-8的表達(dá) n=100，±s

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05;與牙周炎組比較，#P<0.05；與C組比較，△P<0.05；與C2組比較,☆P<0.05

組別牙齦組織中IL-8(μg/L)外周血中IL-8(pg/ml)正常對(duì)照組0.122±0.0251.00±0.00牙周炎組0.708±0.038*1.95±0.07*C1組0.524±0.041*#1.72±0.04*#C2組0.374±0.029*#△1.53±0.06*#△C3組0.192±0.034*#△☆1.36±0.05*#△☆

圖2 黃芩苷對(duì)大鼠牙齦組織及其外周血中IL-8的表達(dá)含量的影響

3 討論

牙周炎是由革蘭氏陰性(G-)細(xì)菌等引起的一種以骨破壞為主要特征的慢性細(xì)菌感染性疾病，其中革蘭氏陰性厭氧菌及其內(nèi)毒素可引起宿主局部免疫細(xì)胞反應(yīng),激活宿主防御細(xì)胞釋放多種炎性細(xì)胞因子，繼發(fā)引起牙齦組織炎癥、牙槽骨破壞和吸收等牙周組織損傷[4，5]。LPS是G-菌胞壁外膜中的內(nèi)毒素的主要成分,是G-菌所獨(dú)有的一種對(duì)牙周組織具有很高毒性的致病物質(zhì)，LPS的化學(xué)組成在不同微生物之間有所不同，但其基本結(jié)構(gòu)相似，類脂A是LPS的生物活性中心，無種屬特異性，在各種G-菌中的化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)相似，可引導(dǎo)其所有的生物學(xué)反應(yīng),因此不同G-菌來源的LPS產(chǎn)生的毒性作用相似[6]。根據(jù)文獻(xiàn)采用大腸桿菌LPS誘導(dǎo)的大鼠實(shí)驗(yàn)牙周炎模型,操作簡(jiǎn)便、可比性及重復(fù)性強(qiáng)[5]。本實(shí)驗(yàn)采用大腸桿菌LPS進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，連續(xù)3 d在大鼠右上頜磨牙同一部位的牙齦組織中注射LPS,1周后牙周袋形成,牙齦紅腫,探診出血。光鏡下顯示，炎性細(xì)胞、破骨細(xì)胞浸潤(rùn),牙槽骨開始吸收。

IL-8是一種內(nèi)源性中性粒細(xì)胞趨化因子和破骨細(xì)胞活化因子，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、 中性粒細(xì)胞、牙齦成纖維細(xì)胞等在白細(xì)胞介素-1(IL-1)、TNF-α、LPS等刺激下，均能產(chǎn)生IL-8，IL-8通過趨化和活化中性粒細(xì)胞釋放各種酶，吞噬、殺傷、消化細(xì)菌，造成組織病理性炎癥損害和骨質(zhì)吸收[7，8]。謝昊等[9]研究發(fā)現(xiàn)，血清IL-8在牙周炎患者中的檢出率明顯高于在健康對(duì)照組的檢出率，表明IL-8與牙周炎癥的發(fā)生發(fā)展密不可分，是促進(jìn)牙周炎癥的一種重要炎性介質(zhì)。米叢波等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在牙齦組織發(fā)生炎癥時(shí)，IL-8在磨牙的壓力側(cè)牙周組織中的表達(dá)增強(qiáng)，尤其在牙周膜成纖維細(xì)胞漿及破骨細(xì)胞中表現(xiàn)高強(qiáng)度表達(dá)，與正常對(duì)照組比較，IL-8在牙周炎組牙周組織中的表達(dá)強(qiáng)度顯著增高，牙槽骨內(nèi)骨吸收陷窩明顯增多，而IL-8在正常組大鼠的牙周組織中僅少量表達(dá)，表明IL-8可介導(dǎo)牙周炎癥發(fā)生、提高破骨細(xì)胞活性，與牙周炎癥發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，牙周炎患者齦溝液及外周血中的IL-8等細(xì)胞因子含量明顯升高，促進(jìn)炎性細(xì)胞進(jìn)入感染部位，造成牙周組織的破壞[11,12]。因此，在牙周炎的臨床治療中，抑制IL-8等炎性細(xì)胞因子的生成，對(duì)牙周炎有積極的治療意義。

黃芩苷具有抑菌、清熱、抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)等藥理活性，可顯著抑制脂多糖對(duì)炎性細(xì)胞因子的誘導(dǎo)合成，增強(qiáng)牙齦成纖維細(xì)胞活性，促進(jìn)牙齦成纖維細(xì)胞有作用促進(jìn)細(xì)胞合成膠原和蛋白質(zhì)，抑制牙周組織的炎性反應(yīng)[13-15]。有研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷對(duì)內(nèi)毒素還有較好的直接降解作用，其降解作用具有時(shí)間和濃度依賴性，黃芩苷局部治療牙周病可以有效改善臨床及細(xì)菌學(xué)指標(biāo)[4,16]。雖然目前化學(xué)藥物局部應(yīng)用治療牙周炎的療效也比較明顯，但化學(xué)藥物對(duì)致病菌僅是直接殺菌作用，對(duì)菌體溶解后產(chǎn)生的內(nèi)毒素卻不能產(chǎn)生降解作用，并且毒副作用大、不良反應(yīng)多、耐藥性強(qiáng)，應(yīng)用受到局限，而黃芩苷既對(duì)內(nèi)毒素有直接降解作用，又可抑制炎性因子的合成，促進(jìn)牙周成纖維細(xì)胞的活性，黃芩又是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，來源豐富、價(jià)格低廉、毒副作用小，因此利用黃芩苷防治牙周病具有廣闊的前景。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，局部注射黃芩苷治療后，與牙周炎組相比，黃芩苷治療組大鼠的牙周及一般情況均有明顯好轉(zhuǎn)，各治療組大鼠牙齦組織充血減輕，牙周袋變淺，神態(tài)趨于正常，皮毛光澤改善，進(jìn)食水、活動(dòng)增多；黃芩苷各治療組牙齦組織中和其外周血中IL-8的表達(dá)含量均明顯低于牙周炎組，隨著黃芩苷濃度升高，IL-8表達(dá)水平逐漸降低，表明黃芩苷可降低實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠牙齦組織中和其外周血中IL-8的表達(dá)水平，抑制IL-8的分泌和合成，減少炎性介質(zhì)的釋放，減輕機(jī)體炎性反應(yīng)，抑制牙槽骨吸收，提示臨床上局部應(yīng)用黃芩苷治療牙周炎，可抑制牙周組織的炎性反應(yīng)，對(duì)牙周炎的恢復(fù)有一定的療效。

總之，本研究提示黃芩苷可改善牙周炎大鼠的牙周及一般狀況，降低牙周炎大鼠牙齦組織和外周血中IL- 8的表達(dá)水平，阻斷脂多糖對(duì)大鼠牙周組織的損傷，但具體作用機(jī)尚需進(jìn)一步研究。

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Effects of baicalin on the expression levels of interleukin-8 in gingival tissues and peripheral blood of rats with periodontitis

LIHuiying,LIGuoxing,CUIJia,etal.DepartmentofStomatology,HebeiProvincialChildren’sHospital.Shijiazhuang050031,China

Objective To observe the effects of baicalin on the expression levels of interleukin-8 in gingival tissues and peripheral blood of rats with periodontitis induced by colibacillus lipopolysaccharide (LPS).Methods Fifty SD rats (8-week age ) were randomly divided into five groups,with 10 rats in each group, which were control group (group A), periodontitis group (group B),low-dose baicalin treatment group (0.01μg/ml,group C1),median-dose baicalin treatment group (0.1μg/ml,group C2),high-dose baicalin treatment group (1.0μg/ml,group C3). After 1-week treatment, these rats were sacrificed,and the specimens of gingival tissues and peripheral blood were obtained,then the expression levels of IL-8 in peripheral blood of rats were measured by cytometric bead array (CBA),and the expression levels of IL-8 in gingival tissues of rats were detected by ELISA.Results The expression levels of IL-8 in peripheral blood in group B were significantly higher than those in control group (P<0.05).The expression levels of IL-8 in gingival tissues and peripheral blood in the three baicalin treatment groups were significantly higher than those in group B (P<0.05),moreover, the expression levels of IL-8 in group C1, C2, C3 were gradually decreased in order (P<0.05).Conclusion The baicalin can decrease the expression levels of IL-8 in gingival tissues and peripheral blood of rats with periodontitis and can inhibit the destructive effects of LPS on periodontal tissues of rats.

baicalin; periodontitis; gingival tissues；peripheral blood；interleukin-8

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.22.002

項(xiàng)目來源：河北省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥類科研計(jì)劃課題(編號(hào):2013181)

050031 石家莊市，河北省兒童醫(yī)院口腔科

劉學(xué)聰，050031 石家莊市，河北省兒童醫(yī)院口腔科；

E-mail:lgxlhy@163.com

R 781.4

A

1002-7386(2016)22-3369-04

2016-05-23)