王玉林，夏方亮

(濱州市食品藥品檢驗檢測中心,山東 濱州 256600)

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高效液相色譜法測定天杞補腎膠囊中馬錢苷、補骨脂素和異補骨脂素的含量

王玉林，夏方亮

(濱州市食品藥品檢驗檢測中心,山東 濱州 256600)

目的 建立高效液相色譜法(HPLC)測定天杞補腎膠囊中馬錢苷、補骨脂素和異補骨脂素的含量測定方法。方法 用 C18柱為固定相，以甲醇-水(42∶58)為流動相，檢測波長為240 nm。結(jié)果 馬錢苷、補骨脂素和異補骨脂素分別在5.06～126.5、0.527 5～13.187 0、0.480 8～12.020 0 mg·L-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，R2分別為1.000、1.000、1.000(n=6)，其平均回收率分別為98.93%，100.09%和98.97%。 結(jié)論 該方法具有較高的準確性和專屬性。

天杞補腎膠囊；馬錢苷；補骨脂素；異補骨脂素

天杞補腎膠囊由哈爾濱同一堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，處方中有淫羊藿、陽起石、補骨脂、山茱萸、枸杞子等多味中藥材，臨床用于腎陰陽兩虛，癥見腰膝酸軟、頭暈耳鳴，倦怠乏力等。原質(zhì)量標準采用高效液相色譜法測定淫羊藿苷的含量，只能對處方中的淫羊藿進行質(zhì)量控制，為提高本品質(zhì)量標準，增強對處方中其他藥材的質(zhì)控力度，本研究采用高效液相色譜法測定處方中山茱萸主要成分馬錢苷和補骨脂主要成分補骨脂素、異補骨脂素的含量，可作為原標準的有效補充。馬錢苷、補骨脂素和異補骨脂素能很好分離，理論板數(shù)較高，處方中的其他藥材成分無干擾，回收率高。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT高效液相色譜儀，Prominence SPD-20A/UV-VIS檢測器；天杞補腎膠囊為哈爾濱同一堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號04140402、04140409、04140512；馬錢苷對照品(批號111640-200604，純度為100.0%)、補骨脂素對照品(批號110739-201416，純度為99.9%)、異補骨脂素對照品(批號110738-201313，純度為100.0%)均購自中國食品藥品檢定研究院，甲醇為色譜純(美國TEDIA公司)，水為純化水(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：依利特Sinochrom ODS-BP(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(42∶58)[1-3]；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測波長：240 nm；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取馬錢苷對照品25.3 mg置50 mL量瓶中、補骨脂素對照品13.20 mg置250 mL量瓶中、異補骨脂素對照品12.02 mg置250 mL量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，作為對照品貯備液。精密量取三份對照品貯備液各1 mL，置同一10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物，混勻，研細，取約0.8 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方比例配制不含山茱萸或補骨脂的樣品，同“2.2.2”項下供試品溶液的制備項下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗 取“2.2.1對照品溶液”、“2.2.2 供試品溶液”和“2.2.3 陰性樣品溶液”，按“2.1 色譜條件”進樣測定，記錄色譜圖，馬錢苷、補骨脂素和異補骨脂素具有較高的分離度和理論板數(shù)，馬錢苷保留時間約為10.8 min，理論板數(shù)高于25 000，補骨脂素保留時間約為23.0 min，理論板數(shù)高于20 000，異補骨脂素保留時間約為26.7 min，理論板數(shù)高于22 000。色譜圖見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取馬錢苷、補骨脂素、異補骨脂素對照品貯備液各0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，進樣量10 μL，以馬錢苷、補骨脂素、異補骨脂素的濃度(mg·L-1)為橫坐標(X)，以峰面積為縱坐標(Y)，得回歸方程分別為：馬錢苷：Y= 8512.1X-1074.7,R2=1.000(n=6);補骨脂素：Y= 81855X-1652,R2=1.000(n=6);異補骨脂素：Y=77279X-856.64,R2=1.000(n=6)。結(jié)果表明，馬錢苷濃度在5.06～126.50 mg·L-1、補骨脂素濃度在0.527 5～13.187 0 mg·L-1、異補骨脂素濃度在0.480 8～12.020 0 mg·L-1范圍內(nèi)線性良好。

2.5 精密度試驗 取“2.2.1”項下對照品溶液，注入液相色譜儀，連續(xù)進樣5次，進樣量10 μL，記錄馬錢苷、補骨脂素和異補骨脂素的峰面積，RSD分別為0.07%、0.05%、0.05%。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液，按“2.1色譜條件”分別于0、3、6、12、24 h進樣，進樣量10 μL，記錄馬錢苷、補骨脂素和異補骨脂素的峰面積，RSD分別為0.16%、0.25%、0.19%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.7 重復(fù)性試驗 稱取批號為04140402的天杞補腎膠囊內(nèi)容物6份，每份約0.8 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1色譜條件”測定馬錢苷、補骨脂素和異補骨脂素的平均含量并計算RSD，結(jié)果為：馬錢苷平均含量2.751 mg·g-1，RSD為0.22%；補骨脂素平均含量0.291 6 mg·g-1，RSD為0.12%；異補骨脂素平均含量0.328 9 mg·g-1，RSD為0.21%。

A.對照品

B.供試品

C.陰性樣品1(缺山茱萸)

D.陰性樣品2(缺補骨脂)

注：1：馬錢苷;2：補骨脂素;3：異補骨脂素。

圖1 天杞補腎膠囊HPLC圖

2.8 加樣回收率試驗 稱取已知含量的天杞補腎膠囊(馬錢苷含量2.751 mg·g-1，補骨脂素含量0.2916 mg·g-1，異補骨脂素含量0.328 9 mg·g-1)6份，每份約0.4 g，精密稱定，分別精密加入“2.2.1”項下馬錢苷對照品貯備液2 mL、補骨脂素對照品貯備液2 mL、異補骨脂素對照品貯備液3 mL，按“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法制備得濃度約為樣品濃度100%的供試品溶液，按上述方法測定馬錢苷、補骨脂素、異補骨脂素的含量，計算回收率，結(jié)果見表1～3。

表1 天杞補腎膠囊中馬錢苷加標回收率試驗結(jié)果

表2 天杞補腎膠囊中補骨脂素加標回收率試驗結(jié)果

表3 天杞補腎膠囊中異補骨脂素加標回收率試驗結(jié)果

2.9 樣品含量測定 取3批樣品，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，每批4份，按“2.1”項下色譜條件對本品進行含量測定，計算平均含量和RSD，結(jié)果見表4。

表4 天杞補腎膠囊中馬錢苷、補骨脂素

2.10 檢測限(LOD)與定量限(LOQ) 取“2.2.1”項下馬錢苷、補骨脂素和異補骨脂素的對照品貯備液，稀釋一定倍數(shù)后進樣測定，以信噪比3∶1計算馬錢苷、補骨脂素和異補骨脂素的檢測限分別為0.253、0.132、0.120 ng；以信噪比10∶1計算定量限分別為1.012、0.396、0.481 ng。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 將三種對照品貯備液用甲醇稀釋后進行紫外圖譜掃描，馬錢苷在238 nm波長處有最大吸收，補骨脂素在246 nm和294 nm波長處有最大吸收，在327 nm處有一肩峰，異補骨脂素在247 nm和300 nm波長處有最大吸收，為提高定量的準確性，提高回收率，本文選用三種成分均響應(yīng)較高的240 nm作為檢測波長，試驗取得了令人滿意的結(jié)果。

3.2 流動相和色譜柱的選擇 補骨脂素和異補骨脂素測定流動相多用甲醇-水[4-5]或乙腈-水[6]，馬錢苷多用乙腈-水[7-8]，也有文獻采用四氫呋喃-乙腈-甲醇-0.05%磷酸溶液[9]和甲醇-磷酸鹽緩沖液[10]，本研究經(jīng)試驗篩選，采用C18柱為固定相和甲醇-水為流動相對三種成分分離最好，保留時間適宜，理論板數(shù)較高且經(jīng)濟環(huán)保。

3.3 提取方法的選擇 在提取方式上，本研究嘗試了回流[8]、超聲[4-6]等，并考察了回流時間和超聲時間，實驗結(jié)果表明，回流和超聲的測定結(jié)果無明顯差異，當(dāng)超聲時間小于20 min時，三種成分含量測定結(jié)果均偏低，超聲30 min以上含量較高且穩(wěn)定，故本文的提取方法定為超聲30 min。

3.4 耐用性 分別用兩根色譜柱依利特Sinochrom ODS-BP(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Thermo BDS HYPERSIL C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)在兩臺高效液相色譜儀(日本島津LC-20AT、美國Agilent1260)上進行耐用性試驗考察，試驗結(jié)果表明，上述兩種色譜柱和兩個型號的高效液相色譜儀均可取得滿意的實驗結(jié)果。

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Determination of loganin,psoralen and isopsoralen in tianqibushen capsules by HPLC

WANG Yulin,XIA Fangliang

(FoodandDrugInspectionandTestingCenter,Binzhou,Shandong256600,China)

Objective To establish a method for the determination of Loganin,Psoralen and Isopsoralen in Tianqibushen Capsules by HPLC.Methods The C18column was used,the mobile phase was methanol-water(42∶58),and the detection wavelength was 240 nm.Results The standard curves of Loganin,Psoralen and Isopsoralen were linear in the ranges of 5.06～126.5 mg·L-1(R2=1.000,n=6),0.527 5～13.187 0 mg·L-1(R2=1.000,n=6) and 0.480 8～12.020 0 mg·L-1(R2=1.000,n=6) respectively,and the average recoveries were 98.93%，100.09% and 98.97%.Conclusion The method is highly accurate and specific.

Tianqibushen capsule;Loganin;Psoralen;Isopsoralen

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.10.013

2016-05-06，

2016-08-01)