飼料中維生素B2測(cè)定的色譜條件優(yōu)化

邢磊，楊琳芬*，符金華，姜文娟，尹騰桂，金海紅，樊晶

（江西省獸藥飼料監(jiān)察所，江西南昌330096）

飼料中維生素B2測(cè)定的色譜條件優(yōu)化

邢磊1，楊琳芬1*，符金華2，姜文娟3，尹騰桂4，金海紅5，樊晶6

（江西省獸藥飼料監(jiān)察所，江西南昌330096）

本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜法測(cè)定飼料中維生素B2的含量。采用了國(guó)標(biāo)法和優(yōu)化法兩種方法進(jìn)行測(cè)定。國(guó)標(biāo)法∶按照GB/T14701-2002的方法進(jìn)行。優(yōu)化方法∶采用Agilent-1260高效液相色譜儀，ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5-M icrom）色譜柱；流動(dòng)相A液∶1.1003 g庚烷磺酸鈉和0.0502 g EDTA及25 m L冰乙酸、5 m L三乙胺溶液，用冰乙酸、三乙胺調(diào)節(jié)pH值至3.4；B液為甲醇；A∶B=85∶15；檢測(cè)波長(zhǎng)∶265 nm；柱溫∶35℃；流速∶1.0 m L/m in；進(jìn)樣量∶0.5 μL。結(jié)果表明∶國(guó)標(biāo)法的保留時(shí)間為70 m in左右，優(yōu)化法的保留時(shí)間為9 m in，且優(yōu)化法的相關(guān)系數(shù)、重復(fù)性和精密度都滿足要求?？梢妰?yōu)化法測(cè)定所需時(shí)間更短，更具有快速、精確測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)。

高效液相色譜法；維生素B2；色譜條件優(yōu)化

維生素是一類分子量較小的有機(jī)化合物，在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著與三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)完全不同的作用，是動(dòng)物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是動(dòng)物飼料中必需添加的物質(zhì)，它與動(dòng)物的生命健康、生長(zhǎng)發(fā)育及生產(chǎn)都有著密切的聯(lián)系。王晴（2000）認(rèn)為，隨著動(dòng)物養(yǎng)殖行業(yè)的發(fā)展，近年來(lái)，市場(chǎng)上出現(xiàn)了多種維生素B2的添加劑，因此，建立快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)分析方法是必要的。在本實(shí)驗(yàn)中采用了兩種高效液相色譜條件檢測(cè)飼料中維生素B2的含量，根據(jù)兩種色譜條件下測(cè)定結(jié)果的比較找到一種更為快速、準(zhǔn)確測(cè)定飼料中維生素B2含量的液相色譜條件。

1　材料與方法

1.1試劑核黃素標(biāo)準(zhǔn)品（SIGMA）、冰乙酸、三乙胺（分析純）、無(wú)水乙醇（分析純）、甲醇（分析純）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、庚烷磺酸鈉。

1.2儀器本實(shí)驗(yàn)中采用了Agilent-1260高效液相色譜儀（USA Agilent Technologies，包括Agilent Technologies 1260 Infinity紫外檢測(cè)器）、TGL—16G離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、電子天平（常州宏衡）、津騰過(guò)濾器（津騰T-50）、過(guò)濾膜（法利特ф50 mm×0.45 μm）、超聲波清洗器（AS3120）及其他常規(guī)實(shí)驗(yàn)儀器。

1.3樣品飼料A（5%青年蛋雞復(fù)合預(yù)混合飼料）、飼料B（10%后備母豬復(fù)合預(yù)混合飼料）。

1.4樣品前處理

1.4.1試樣溶液的配制稱取A、B兩組復(fù)合預(yù)混合飼料（每組兩個(gè)飼料樣品為平行樣）1～3 g。將其分別加入四個(gè)100 mL的棕色容量瓶中，加入維生素B2提取液至約容量瓶2/3體積處，將容量瓶置于80～100℃水浴鍋中煮沸30 min，待其自然冷卻后加入14 mL的甲醇，最后用維生素B2提取液定容至刻度，混勻后，用0.45 μm濾膜過(guò)濾后待上機(jī)測(cè)定。

1.4.2樣品上機(jī)前處理將工作液（見下面標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制）和兩組四個(gè)試樣液分別裝入離心管中，12000 r/min離心12 min，然后裝入到進(jìn)樣瓶中待上機(jī)檢測(cè)。

1.5試劑配制

1.5.1流動(dòng)相的配制A液:25 mL冰乙酸（CH3COOH）+5 mL三乙胺[（C2H5）3N]+0.0502 g乙二胺四乙酸二鈉（EDTA:C10H16N2O8）+1.1000 g庚烷磺酸鈉（C7H15NaO3S），最后用超純水定容至1000 mL（用三乙胺和冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至3.4）；B液:甲醇。

1.5.2提取液的配制50 mg EDTA+25 mL冰乙酸+5 mL三乙胺用去離子水,，定容至1000 mL。

1.5.3標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制稱取0.0095 g維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品置于100 mL的容量瓶中，加入1 mL冰乙酸在沸水?。?0～100℃）中煮沸30 min，待其自然冷卻到室溫后用去離子水定容至刻度配制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取2.5 mL維生素B2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于50 mL的棕色容量瓶中，用一定比例的流動(dòng)相A液和B液定容至刻度后置于冰箱中待用。

2　試驗(yàn)方法

2.1國(guó)標(biāo)法測(cè)定的色譜條件GB/T14701-2002標(biāo)注的色譜柱:NoVa-pakC18（3.9 mm×150 mm，4-Microm）。

實(shí)驗(yàn)用色譜柱:ZORBAX SB-C18（4.6 mm× 150 mm，5-Microm）。流動(dòng)相:A液與B液按照86∶14的配比混合。流速:0.8 mL/min。進(jìn)樣量:10 μL。柱溫:25～28℃。檢測(cè)波長(zhǎng):267 nm。

2.2優(yōu)化法測(cè)定的色譜條件色譜柱:ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5-Microm）。流動(dòng)相:A液與B液按照85∶15的配比混合。流速:1 mL/min。進(jìn)樣量:5 μL。柱溫:35℃。檢測(cè)波長(zhǎng):265 nm。

3　結(jié)果

3.1標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定結(jié)果

3.1.1國(guó)標(biāo)法測(cè)定結(jié)果按照國(guó)標(biāo)法的色譜條件測(cè)定維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品溶液，同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)2次。在用國(guó)標(biāo)法測(cè)定的過(guò)程中，因色譜柱的型號(hào)非國(guó)標(biāo)的要求，國(guó)標(biāo)GB/T 14701-2002上預(yù)計(jì)的保留時(shí)間為10 min，但在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的出峰時(shí)間都約為70 min，出色譜峰需要的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。其測(cè)定結(jié)果為保留時(shí)間:73 min；出峰時(shí)間: 69.715 min。色譜峰圖如圖1所示。

圖1維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品國(guó)標(biāo)法測(cè)定色譜圖

3.1.2優(yōu)化法測(cè)定結(jié)果按照上述優(yōu)化法的色譜條件測(cè)定維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品溶液，同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)2次。其結(jié)果為保留時(shí)間:9.3 min；出峰時(shí)間:8.562 min；色譜峰圖如圖2所示。

圖2維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品優(yōu)化法測(cè)定色譜圖

3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍選取適當(dāng)?shù)囊埔汗芫芪∨渲坪玫臉?biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 μg/mL），用優(yōu)化法的流動(dòng)相稀釋成濃度為1、5、12.5、25、50 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。在上述優(yōu)化法的色譜條件下檢測(cè)，每個(gè)濃度檢測(cè)2次，進(jìn)樣的順序?yàn)榈蜐舛鹊礁邼舛取纱螠y(cè)得的色譜峰峰面積求平均值，將平均峰值與對(duì)應(yīng)工作液的濃度作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，求其回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

回歸方程為Y=25.123X+8.5728，相關(guān)系數(shù)R=0.999，表明在該方法下維生素B2在0～50 μg/mL濃度范圍線性關(guān)系良好。

3.3樣品測(cè)定結(jié)果將A、B兩組飼料共四個(gè)試樣溶液按照上述優(yōu)化法的液相色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品檢測(cè)2次。根據(jù)測(cè)定得出的色譜峰圖及具體信息可知所有的樣品溶液都在8.5 min右檢測(cè)出目標(biāo)峰，并且所得到的色譜峰峰形較好。查標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得出了樣品中維生素B2的含量，根據(jù)測(cè)定結(jié)果的數(shù)值計(jì)算其相對(duì)偏差，結(jié)果見表1。

表1試樣含量測(cè)定結(jié)果

從上述結(jié)果可發(fā)現(xiàn)A組飼料所測(cè)得的相對(duì)偏差為±2.03%，B組飼料所測(cè)得的相對(duì)偏差為± 0.93%，在實(shí)驗(yàn)中所測(cè)得的兩組飼料樣品中維生素B2的含量都在10×103～1.00×103mg/kg，其相對(duì)偏差滿足≤±10.0%，證明該優(yōu)化法的重復(fù)性良好。

3.4精密度分別取飼料A和飼料B兩組飼料的兩個(gè)樣品中任意一種飼料配制成樣品溶液，按照上述優(yōu)化法的條件在高效液相色譜儀中進(jìn)行平行測(cè)定6次，得其峰譜圖。測(cè)定含量及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值（RSD）見表2。

表2精密度測(cè)定結(jié)果

精密度試驗(yàn)在A、B兩組樣品溶液中所得的RSD分別為:1.02%，1.83%。都小于2%，在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，這說(shuō)明該試驗(yàn)中的色譜儀精密度良好。

4　分析與討論

4.1樣品前處理飼料樣品的前處理程度可在很大的程度上影響樣品的測(cè)定結(jié)果。郭亞冬等（2004）認(rèn)為維生素B2的水溶性較差，在水中的溶解度較小，因此在前處理過(guò)程中應(yīng)適當(dāng)加入少量酸、堿或在水浴上加熱使其完全溶解。維生素B2對(duì)光輻射敏感特別是紫外線，對(duì)其進(jìn)行光照及紫外線照射時(shí)易發(fā)生不可逆的分解反應(yīng)，因此在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中盡量使用棕色容量瓶，并將配制好的維生素B2標(biāo)準(zhǔn)液、工作液放置在避光的環(huán)境中。

4.2色譜條件

4.2.1波長(zhǎng)的選擇采用高效液相色譜法檢測(cè)，不同的試樣出現(xiàn)特征性的色譜峰所需要的檢測(cè)波長(zhǎng)是不同的。梁琳等（2016）將煙酰胺、維生素B6、維生素B1和維生素B2的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行掃描200～400 nm的吸收譜線，得出維生素B2的最大吸收波長(zhǎng)為268 nm。國(guó)標(biāo)（GB/T14701-2002）中表明采用紫外檢測(cè)器測(cè)定維生素時(shí)，多種維生素聯(lián)檢時(shí)的波長(zhǎng)選擇為280 nm，單一檢測(cè)維生素B2時(shí)的波長(zhǎng)選擇為267 nm。根據(jù)國(guó)標(biāo)上的要求，在實(shí)際的檢測(cè)當(dāng)中，優(yōu)化法所選取的測(cè)定波長(zhǎng)是265 nm，此波長(zhǎng)維生素B2有較大吸收。

4.2.2流動(dòng)相的選擇王琛等（2010）認(rèn)為流動(dòng)相的選擇對(duì)優(yōu)化液相色譜的條件有很大的影響，若流動(dòng)相的pH值改變，維生素B2出峰的位置將會(huì)發(fā)生明顯的變化，同時(shí)也將會(huì)影響維生素B2的分離度。根據(jù)維生素B2的特性，在稀酸溶液中較穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)將流動(dòng)項(xiàng)的pH調(diào)為3.4時(shí)維生素B2的分離度較好。

4.2.3甲醇對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響索德成等（2015）研究表明，甲醇含量的變化對(duì)測(cè)定維生素B2的保留時(shí)間有比較明顯的影響，測(cè)定維生素B2的保留時(shí)間將會(huì)隨著流動(dòng)相中甲醇濃度的降低而延長(zhǎng)，而且在得到的色譜峰圖中會(huì)出現(xiàn)明顯的拖尾現(xiàn)象，導(dǎo)致峰的基線不平穩(wěn)，對(duì)稱性較差等。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化法甲醇在流動(dòng)相中的比例為15%，與國(guó)標(biāo)法相似。

4.3國(guó)標(biāo)法與優(yōu)化法的比較按照國(guó)標(biāo)測(cè)定飼料中維生素B2的結(jié)果顯示:A、B兩組飼料中都沒(méi)有檢測(cè)出維生素B2的色譜峰圖，對(duì)于維生素B2的標(biāo)準(zhǔn)品，國(guó)標(biāo)法能檢測(cè)出其峰譜圖，且其峰型良好，基線平穩(wěn)，但所耗用的時(shí)間較長(zhǎng)。采用優(yōu)化法檢測(cè)維生素B2的實(shí)驗(yàn)中，維生素B2的標(biāo)準(zhǔn)品也能得到較好的色譜峰圖，與國(guó)標(biāo)法所得到的色譜峰圖比較，峰形較差，但是出峰的時(shí)間較短，僅需9 min。并且用優(yōu)化法檢測(cè)試樣液中維生素B2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，A、B兩組飼料中的四個(gè)樣品能夠在相應(yīng)的保留時(shí)間內(nèi)得到很好的色譜峰圖。從實(shí)驗(yàn)所得的整個(gè)結(jié)果來(lái)看，優(yōu)化法比國(guó)標(biāo)法具有更高的靈敏度，更有利于實(shí)際操作。

4.4影響測(cè)定結(jié)果的其他因素索德成等（2015）認(rèn)為，復(fù)合預(yù)混飼料中存在大量的金屬離子，在處理樣品的過(guò)程中，加入EDTA可作為金屬離子的掩蔽劑，能夠有效地消除金屬離子對(duì)出峰時(shí)間、峰的對(duì)稱性、基線的平穩(wěn)度等干擾，從而提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

5　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用了兩種不同的色譜條件來(lái)檢測(cè)飼料中維生素B2的含量，不同的色譜條件下檢測(cè)試樣得到的峰不同。就本實(shí)驗(yàn)中的兩種色譜條件來(lái)說(shuō)，國(guó)標(biāo)法的出峰時(shí)間為70 min，峰型較好，基線平穩(wěn)；優(yōu)化法的出峰時(shí)間為9 min，峰型較國(guó)標(biāo)法差，基線不如國(guó)標(biāo)法的平穩(wěn)，但用優(yōu)化法檢測(cè)時(shí)出峰的時(shí)間更短，具有更快的檢測(cè)速度和更高的靈敏度。這表明在沒(méi)有國(guó)標(biāo)法要求的色譜柱的條件下，本實(shí)驗(yàn)中所用優(yōu)化法可作為快速、可行的測(cè)定飼料中維生素B2含量的方法。

[1]王晴.高效液相色譜法測(cè)定飼料中維生素B2[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2000，7∶14～15.

[2]郭亞?wèn)|，馬銀海，李燕華，等.維生素B1、B2含量測(cè)定方法比較[J].食品科學(xué)，2004，25（6）∶153～156.

[3]梁琳，王英.HPLC法同時(shí)測(cè)定維生素預(yù)混合飼料中5種B族維生素[J].中國(guó)飼料，2016，1∶21～23.

[4]王琛，陳彬彬，鄒梅娟，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定多維元素膠囊中煙酰胺，維生素B6，維生素B1和維生素B2的含量[J].海峽藥學(xué)，2010，22（3）∶52～55.

[5]索德成，趙小陽(yáng)，李蘭.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定預(yù)混合飼料中維生素C、維生素B2及其磷酸鹽[J].中國(guó)飼料，2015，2∶34～37.■

DOI∶10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20162010

In this experiment，the content of vitamin B2in feed was determined by high performance liquid chromatography（HPLC）.Two methods of national standard method and optimization method were adopted.The national standard method:according to GB/T 14701-2002.Optimization method:using high performance liquid chromatograph Agilent-1260，ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5-Microm）chromatographic column；mobile phase for A liquid:1000 mL contained 1.1003 g heptane sulfonic acid sodium，0.0502 g EDTA and 25 mL ice acetic acid，5 mL triethylamine solution，with ice acetic acid and triethylamine to adjust pH value of 3.4；B liquid methanol；A∶B（85∶15）；detection wavelength of 265 nm；column temperature 35℃；the flow rate and sample volume:1.0 mL/min，0.5 μL.Results showed that the retention time of national standard method for 70 minutes，optimization method of retention time was about 9 minutes，and the correlation coefficient，repeatability and precision of optimization method meet the requirements.The results indicated that the required time of optimization was shorter，more had the advantages of fast and accurate determination.

high performance liquid chromatography；Vitamin B2；chromatographic condition optimization

S816.17

A

1004-3314（2016）20-0038-03