磁珠吸附法定量檢測乙型肝炎病毒的效能

張程 王宇 聶棱 馬紅

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·論 著·

磁珠吸附法定量檢測乙型肝炎病毒的效能

張程 王宇 聶棱 馬紅

目的 建立磁珠吸附定量檢測HBV DNA的方法，并評價該方法的檢測效率。方法 將病毒載量為107IU/mL的血清樣本，倍比稀釋成不同濃度的HBV DNA作為血清標(biāo)準品(理論值)，分別用磁珠吸附定量法(試劑1)、磁珠法(試劑2)、煮沸法(試劑3)3種方法提取HBV DNA，從靈敏度、定量線性關(guān)系方面比較本實驗方法與國產(chǎn)磁珠法核酸自動提取法和傳統(tǒng)煮沸法的提取效果，并對本實驗方法進行穩(wěn)定性驗證。結(jié)果 靈敏度：HBV DNA定量的檢測下限理論值為101IU/mL，試劑1為3.520×101IU/mL，試劑2為9.123×103IU/mL，試劑3為6.195×101IU/mL。相關(guān)性：試劑1、試劑2、試劑3提取HBV DNA定量與理論值相關(guān)性分析的r值分別為0.986、0.950、0.979(均P<0.01)。穩(wěn)定性：3種方法檢測的相對偏差均值分別為0.243±0.405(試劑1)、1.189±0.855(試劑2)、-0.439±0.618(試劑3)，試劑1對同一樣本在不同時間檢測結(jié)果的相對偏差均值為0.505±0.659。結(jié)論 本實驗所設(shè)計的血清HBV DNA提取方法靈敏，定量線性關(guān)系好，結(jié)果穩(wěn)定準確，為定量檢測HBV DNA奠定了基礎(chǔ)。

HBV DNA；提??；效率

HBV DNA定量檢測可用于慢性HBV感染的診斷和治療適應(yīng)證的選擇，反映病毒復(fù)制水平，為抗病毒治療提供依據(jù)及判斷其療效[1]。PCR是一項非常敏感的技術(shù)，能檢測到10個HBV基因組/mL[2]，但是PCR擴增的效果可能受到提取的HBV DNA載量的影響。因此，隨著患者病毒載量的逐漸下降，需要更高效的提取方法。目前，臨床上所用的HBV DNA定量檢測試劑盒中，進口檢測試劑較國產(chǎn)檢測試劑更敏感[3]，檢測下限為20 IU/mL，線性范圍為20～1.7×108IU/mL，但是價格較貴，而普通國產(chǎn)試劑的靈敏度為200～1000 IU/mL，線性范圍為1000～1×108IU/mL，其檢測效能相對進口試劑較差[4]。本研究采用納米磁珠吸附的方法定量檢測HBV DNA，并與已上市的國產(chǎn)提取試劑盒進行比較，建立敏感、穩(wěn)定、經(jīng)濟的提取方法。

資料和方法

一、標(biāo)本來源

HBV DNA陽性及陰性對照血清均來自北京友誼醫(yī)院肝病中心2015年臨床檢測樣品；陽性血清樣本及稀釋用陰性血清標(biāo)準：應(yīng)用瑞士羅氏公司COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan(CAP-CTM) 實時熒光PCR HBV DNA定量檢測試劑盒，嚴格按照說明書中的步驟操作，用Agilent MX3000p實時熒光定量PCR儀擴增和檢測核酸。該定量試劑對HBV中 DNA的最低檢出限為20 IU/mL。

二、儀器與試劑

Agilent MX3000p實時熒光定量PCR儀；Premix Ex Taq TM(Probe qPCR)、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ購自北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司；蛋白酶K購自Amresco公司(美國)；HBV引物及探針由本實驗設(shè)計，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。HBV上游引物：5′-ACATC AGGAT TCCTA GGACC-3′；HBV下游引物:5′-GGTGA GTGAT TGGAG GTTG-3′；HBV Probe(探針)：FAM-5′-CAGAG TCTAG ACTCG TGGTG GACTT C-3′-TAMRA。

三、 建立方法

陽性血清全部混合在一起(約1.167×107IU/mL)，將混合后陽性血清與混合后陰性血清震蕩混勻，倍比稀釋(10倍)成106IU/mL、105IU/mL、104IU/mL、103IU/mL、102IU/mL、101IU/mL。實驗步驟如下：取1.5 mL的離心管(無RNA酶污染)依次加入1000 μL陽性血清，100 μL 蛋白酶K(10 mg/mL)，吹打混勻，56 ℃加熱孵化60 min；取100 μL上述血清依次加入400 μL裂解液，300 μL結(jié)合液，12 μL磁珠吹打混勻；70 ℃加熱結(jié)合10 min，隔2～3 min混勻1次；用磁鐵吸附納米磁珠，棄掉上清；200 μL washing buffer Ⅰ清洗1遍，棄上清；200 μL washing buffer Ⅱ清洗1遍，棄上清；200 μL washing buffer Ⅲ清洗1遍，棄上清；短時離心，棄殘液；30 μL DEPC-H2O 洗脫，70 ℃ 加熱5 min，磁鐵吸附取上清轉(zhuǎn)管。

PCR反應(yīng)體系：HBV PCR反應(yīng)液28 μL/人份+5 μL模板。

四、對比試驗

取1.5 mL的離心管(無RNA酶污染)依次加入1000 μL陽性血清，100 μL 蛋白酶K(10 mg/mL)，吹打混勻，56 ℃加熱孵化60 min；分別按照試劑2、試劑3兩種試劑盒操作說明書進行核酸提取，將提取液移至PCR反應(yīng)管中，蓋上管蓋，轉(zhuǎn)移到擴增檢測區(qū)；將反應(yīng)管放入熒光PCR擴增儀進行擴增檢測，參照各儀器使用說明書進行設(shè)置循環(huán)參數(shù)。

五、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，檢測3種提取方法的測量值與理論值的相關(guān)性，并依據(jù)3種檢測方法的測量值與理論值的相對偏差評價各檢測方法的穩(wěn)定性。

結(jié) 果

一、3種不同試劑的檢測結(jié)果

3種不同的國產(chǎn)試劑盒對不同濃度梯度的HBV DNA載量的檢測結(jié)果，以評價3種試劑檢測的敏感度，見表1。試劑1與試劑2同為磁珠法，試劑2為臨床中常用方法，與本實驗所設(shè)計的磁珠法相比，所需待測樣本量、擴增體系以及模板量均較大。結(jié)果顯示，試劑1(本方法)的HBV DNA定量為3.520×101IU/mL，相比其他方法(試劑2為9.123×103IU/mL、試劑3為6.195×101IU/mL)，與理論值(101IU/mL)最接近。此外，由表1可知試劑2對于高濃度HBV DNA載量的檢測結(jié)果準確，試劑3對于低濃度HBV DNA載量的檢測結(jié)果準確。

二、不同試劑提取HBV DNA的測量值與理論值的相關(guān)性分析

采用3種試劑對不同濃度梯度的HBV DNA進行檢測，對測量值與理論值的相對偏差進行相關(guān)性分析，以評價3種試劑的相關(guān)性及穩(wěn)定性，見表2。分別計算各測量值與理論值的相對偏差，試劑1、試劑2、試劑3的相對偏差均值分別為0.243±0.405、1.189±0.855、-0.439±0.618，提示試劑1的相對偏差均值最小，說明試劑1的結(jié)果穩(wěn)定、準確。3種試劑提取HBV DNA定量與理論值相關(guān)性好(試劑1r=0.986，試劑2r=0.950，試劑3r=0.979，均P<0.01)，并用散點圖進行描述，見圖1。通過計算各組數(shù)據(jù)的相對偏差得出試劑1的檢測結(jié)果更穩(wěn)定。此外，通過對同一血清樣本在不同時間進行檢測，相對偏差均值為0.505±0.659，提示試劑1穩(wěn)定性好，見表3。

表1 3種不同試劑提取HBV DNA的結(jié)果比較

表2 不同濃度梯度HBV DNA載量的檢測結(jié)果分析(log10 IU/mL)

圖1 測量值與理論值的相關(guān)分析

注：用散點圖描述3種試劑的測量值與理論值的相關(guān)性分析，相關(guān)方程分別為試劑1：y=0.8907x+0.68，試劑2：y=0.6707x+2.5057，試劑3：y=0.7618x+0.5143，提示試劑1的相關(guān)性較好

表3 同一樣本不同時間的檢測結(jié)果分析

討 論

目前，國內(nèi)應(yīng)用最廣的HBV DNA提取方法為煮沸法，但其操作復(fù)雜，包括對樣本的煮沸、裂解、高速離心富集DNA反復(fù)吸取溶液等多個步驟，在整個操作過程中容易導(dǎo)致DNA的丟失，裂解不充分、回收不完全以及交叉污染均會影響HBV DNA的提取效力；而磁性納米顆粒表面積大，高效吸附病毒DNA顆粒，提取充分而快捷，靈敏度高，且可實現(xiàn)高通量自動化病毒DNA提取[5]，因此磁珠法優(yōu)于煮沸法，但磁珠法所需的樣本量及模板量較大，且操作步驟相對復(fù)雜、耗時長。本實驗通過對磁珠法的改進[6]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其檢測下限為3.520×101IU/mL與理論值(101IU/mL)接近，靈敏度最佳；并且對同一批血樣進行重復(fù)檢測，Ct值相差較小，說明實驗設(shè)計穩(wěn)定性好；與國產(chǎn)磁珠法核酸自動提取法和傳統(tǒng)的煮沸法相比，本實驗中所用磁珠尺寸較小，為30～50 nm，避免了因磁珠較大致吸附不充分的可能；與進口試劑的20 IU/mL相比雖仍有差距，但羅氏系統(tǒng)用于檢測的每份血清標(biāo)本量較大，每份血清量達650 μL，而本實驗中的樣本量為100 μL，但二者提取到的待測HBV DNA產(chǎn)物容積相同，且由于反應(yīng)管體積的限制，進行PCR檢測時只能再取其中的2～5 μL的HBV DNA提取產(chǎn)物作為PCR檢測的模板。因此，在血清HBV DNA含量較低時，進入檢測體系的血清標(biāo)本量越多，熒光儀捕捉到熒光信號的概率也就越高，反之，標(biāo)本量越少，檢出概率越低，漏診率也就越高，從而導(dǎo)致本方法的檢測效果較進口試劑稍差，但差別并不大。由此可知，本實驗不但所需體系量少，而且與大體系的進口試劑檢測結(jié)果接近。本實驗設(shè)計增加了清洗洗脫步驟，所得DNA純度高，可將洗脫液移至PCR反應(yīng)管中以備擴增，便于保存，對于檢測結(jié)果可疑的可實現(xiàn)重復(fù)驗證，優(yōu)于國產(chǎn)磁珠法核酸自動提取法及進口試劑的一次性檢測；整個實驗相對于國產(chǎn)磁珠法核酸自動提取法及傳統(tǒng)煮沸法操作步驟簡便、反應(yīng)時間短，20元/人份、耗時30 min/6個樣本(試劑1)；72元/人份、耗時60 min/6個樣本(試劑2)；20元/人份、耗時40 min/6個樣本(試劑3)；檢測成本及操作過程較進口試劑經(jīng)濟、快速。

通過多方面優(yōu)化條件，本實驗中提取所用磁珠價格便宜，操作過程簡便，檢測結(jié)果與理論值相關(guān)性最好，且靈敏度較進口試劑的20 IU/mL差別并不大。此外，鑒于我國大多數(shù)乙型肝炎患者經(jīng)濟能力有限，普遍推廣使用高靈敏度、高成本的進口試劑盒存在難度，因此綜合評價本實驗中的HBV DNA定量檢測方法更適合應(yīng)用于臨床。

隨著抗病毒藥物的廣泛使用，提高國產(chǎn)試劑的檢測靈敏度有重要意義。HBV DNA的定量檢測不僅是一種檢測工具，也是一種診斷方法，更準確的檢測結(jié)果在抗病毒療效的監(jiān)測中能更有效地反映患者實際HBV DNA的下降程度。此外，還可以利用納米磁珠顆粒的表面修飾，對納米磁珠進行特異性抗體標(biāo)記，與特異的抗-HBs結(jié)合，從而提高檢測的特異性及靈敏度。

[1] 張斌. HBV DNA定量檢測方法研究進展. 現(xiàn)代診斷與治療， 2002, 13: 150-152.

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(本文編輯：錢燕)

The efficiency of magnetic bead adsorption for quantitative detection of hepatitis B virus DNA

ZHANGCheng，WANGYu，NIELeng,MAHong.

LiverResearchCenter，BeijingFriendshipHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100050，China

Correspondingauthor:MAHong,Email:mahongmd@aliyun.com

Objective To establish a magnetic bead adsorption method to quantitatively detect hepatitis B virus (HBV) DNA, and to evaluate its efficiency. Methods Serum template of 107IU/ml HBV virus was diluted into different concentrations as serum standard panels (theoretical value), HBV DNA in which were extracted by our magnetic bead adsorption method (reagent 1), domestic automatic nucleic acids extraction with magnetic beads (reagent 2) and boiling method (reagent 3), respectively. Comparisons in extraction efficiency among those 3 methods were carried out by analyzing sensitivity, quantitative linear relationship and stability. Results Theoretical value of lower HBV DNA detection limit was 101IU/mL, and the extraction results were 3.520×101IU/mL by reagent 1, 9.123×103IU/mL by reagent 2 and 6.195×101IU/mL by reagent 3. Correlation analysis between extraction results and theoretical values showed r values as 0.986 (reagent 1,P<0.001), 0.950 (reagent 2,P=0.001) and 0.979 (reagent 3,P<0.001), respectively, which revealed statistically significant differences. Average relative deviations of the 3 methods were 0.243±0.405 (reagent 1), 1.189±0.855 (reagent 2), -0.439±0.618 (reagent 3), respectively. In addition, the average relative deviation of reagent 1 for same sample at different times was 0.505±0.659. Conclusion Magnetic bead adsorption method for HBV DNA extraction has good sensitivity, quantitative linear relationship, stability and accuracy, which might be a reliable method for the quantitative detection of HBV DNA.

HBV DNA; Extraction; Efficiency

王寶恩肝纖維化基金(2011029)；首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(2011-1003-02)；2015年度北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才學(xué)科骨干資助項目(2005-3-003)

100050 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院肝病中心(張程，王宇，馬紅)；武漢哇哇噻納技術(shù)開發(fā)有限公司北京生物技術(shù)研究所(聶棱)

馬紅，Email: mahongmd@aliyun.com；王宇，Email:wangyuliver@126.com

2016-08-04)