湯水粉，錢(qián)卓真，羅方方，王麗娟

(福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門(mén) 361013)

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高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中15種多環(huán)芳烴

湯水粉，錢(qián)卓真，羅方方，王麗娟

(福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門(mén) 361013)

本文采用QuEChERS 技術(shù)，對(duì)前處理?xiàng)l件進(jìn)行改進(jìn)，然后通過(guò)對(duì)色譜條件的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中15種PAHs的高效液相色譜法檢測(cè)。在優(yōu)化條件下，15種PAHs線性范圍為1～50 ng/mL，線性相關(guān)系數(shù)大于0.995；以信噪比(S/N)≥3 確定各組分的檢出限，15種PAHs的檢出限在0.1～2.0 μg/kg之間。對(duì)對(duì)蝦樣品進(jìn)行15種PAHs污染物的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，回收率在75.8%～101%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15.0%。最后，將QuEChERS-高效液相色譜法應(yīng)用于實(shí)際樣品中15種PAHs的檢測(cè)，結(jié)果證明，該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，適用于水產(chǎn)品中PAHs污染物的檢測(cè)。

多環(huán)芳烴(PAHs)；水產(chǎn)品； 高效液相色譜； QuEChERS

多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是由二至七個(gè)不等的苯環(huán)組成的芳香族化合物，為人們熟知的持久性有機(jī)污染物之一，也是世界上最早發(fā)現(xiàn)的對(duì)人類有致癌效應(yīng)的一類污染物，具有潛在致癌、致畸、致突變效應(yīng)等特點(diǎn)[1-2]。PAHs主要通過(guò)廢水排放、大氣沉降、地表徑流及原油泄露等多種途徑進(jìn)入水體，對(duì)水生生物造成不利影響，并通過(guò)飲水、皮膚接觸及水產(chǎn)品食用等途徑危害人體健康。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道PAHs在不同食品中的檢出，其中蔬菜、水果、油品、谷類及煙熏肉制品等食品中均有PAHs檢出[3-6]。世界各國(guó)對(duì)PAHs都有嚴(yán)格限制，美國(guó)EPA 將16 種多環(huán)芳烴列入優(yōu)先控制污染物名單，歐盟以及WHO 也采取了限制PAHs 的措施[7]，中國(guó)GB 2762—2005《食品中污染物限量》標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定熏烤肉、糧食中苯并(a)芘限值5 μg/kg、植物油中為10 μg/kg[8]。因此，研究水體及水產(chǎn)品PAHs的污染特征及其健康風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

目前，PAHs的檢測(cè)方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[9-10]和高效液相色譜法[11-12]。分光光度法僅適用于某種特定PAHs的測(cè)定，且基質(zhì)干擾較大，靈敏度達(dá)不到檢測(cè)要求。GC-MS法引入特征碎片離子，對(duì)多組分具有較好的確證能力，但是提取過(guò)程繁瑣，且三種苯并熒蒽難以用氣相色譜法分離，重質(zhì)PAHs的回收率較低[2]。高效液相色譜法操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，且具有較好的選擇性和準(zhǔn)確性[13]，是目前水產(chǎn)品藥物殘留檢測(cè)的主要方法。因此，研究采用QuEChERS技術(shù)，對(duì)前處理?xiàng)l件進(jìn)行改進(jìn)，然后通過(guò)對(duì)色譜條件的優(yōu)化，旨在實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中15種PAHs的高效液相色譜法檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

魚(yú)取背部肌肉；蝦、蟹類等取可食部分。用絞肉機(jī)絞成漿狀，裝入潔凈塑封袋，-18℃貯存。

1.2 儀器與試劑

Waters 2695液相色譜儀、Waters 2475熒光檢測(cè)器、Empower工作站軟件：Waters公司；漩渦振蕩器：德國(guó)IKA；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司；低速離心機(jī)、高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

PAHs標(biāo)準(zhǔn)品：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer，純度≥98%；Florisil/C18固相萃取小柱：北京振翔科技有限公司；無(wú)水硫酸鈉，無(wú)水硫酸鎂：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純；乙腈：美國(guó)Tedia，色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為Millipore Academic 制備的超純水。

1.3 樣品前處理方法

稱取(5.00±0.05)g已均質(zhì)的組織樣品于50 mL具塞離心管中，加入5 mL超純水，混合振搖1 min，然后加入15 mL乙腈劇烈振搖1 min，接著加入6 g無(wú)水硫酸鎂和1.5 g無(wú)水乙酸鈉，渦漩1 min，6 000 r/min離心5 min，使有機(jī)相和水相分層，有機(jī)相即樣液。

Florisil/C18小柱用5 mL乙腈預(yù)淋洗，再準(zhǔn)確移取5 mL樣液上樣，用5 mL乙腈洗脫三次，收集全部流出液于100 mL雞心瓶中，旋蒸至近干，乙腈定容至1 mL，過(guò)0.2 μm濾膜后，供高效液相色譜分析。

1.4 儀器分析條件

色譜柱：Thermo HYPERSIL Green PAH，5 μm，4.6 mm× 150 mm；

流動(dòng)相流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；流動(dòng)相為水(A)、乙腈(B)的混合溶液。梯度條件見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

吸取適量的PAHs標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈-水配制成濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，各吸取50 μL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，據(jù)各組分的響應(yīng)峰面積與相應(yīng)的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 回收率與精密度

稱取(5.00±0.05)g勻漿后的樣品，加入一定量不同濃度的PAHs標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后按同樣的樣品前處理方法進(jìn)行提取、凈化以及高效液相色譜檢測(cè)，計(jì)算各種多環(huán)芳烴的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 梯度洗脫條件的選擇

結(jié)合參考PAHs色譜分析方法的文獻(xiàn)報(bào)道[14-15]，PAHs流動(dòng)相主要是乙腈-水混合溶液，由于流動(dòng)相的比例直接影響樣品保留時(shí)間和峰面積，實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同的有機(jī)相配比，即有機(jī)相濃度分別為40%、45%、51%、60%，對(duì)樣品組分保留時(shí)間與目標(biāo)峰的分離進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有機(jī)相太小，保留時(shí)間靠前的PAHs如萘、苊、芴菲、蒽不能較好的分離；有機(jī)相比例越大，保留時(shí)間靠前的13種PAHs組分分離較好，而高分子量的PAHs保留時(shí)間長(zhǎng)且峰形差。因此，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)優(yōu)化，選擇梯度程序進(jìn)行洗脫，確保15種多環(huán)芳烴物質(zhì)的有效分離。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

相對(duì)紫外檢測(cè)法，熒光檢測(cè)法受雜質(zhì)的干擾較小，靈敏度較高，因此采用熒光法測(cè)定15種PAHs污染物。參考相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道[16-17]，同時(shí)根據(jù)15 種PAHs 的保留時(shí)間和最佳激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)，確定各個(gè)物質(zhì)的測(cè)定波長(zhǎng)(表2)。在優(yōu)化的檢測(cè)條件下，各種PAHs污染物能夠很好的分離，且基線平穩(wěn)、峰形好(圖1)。

表2 PAHs的熒光檢測(cè)波長(zhǎng)程序

2.3 提取凈化方法的選擇

目前，針對(duì)食品樣品基質(zhì)中PAHs的前處理技術(shù)主要有液液萃取、固相萃取、固相微萃取、超臨界流體萃取法等。

由于PAHs屬于親脂性物質(zhì)，容易在樣品的脂質(zhì)組分中擴(kuò)散，并存在于組織細(xì)胞內(nèi)部[18]，因此必須選擇合適的提取方法才能有效分離萃取PAHs。實(shí)驗(yàn)分別考察了正己烷-二氯甲烷、甲醇-氫氧化鉀-環(huán)己烷以及QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe) 技術(shù)等幾種前處理方法對(duì)PAHs提取效率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用正己烷-二氯甲烷提取時(shí)，回收率不能滿足要求；用甲醇-氫氧化鉀-環(huán)己烷提取步驟繁瑣；QuEChERS 技術(shù)通過(guò)乙腈沉降蛋白，無(wú)水乙酸鈉和無(wú)水硫酸鎂進(jìn)行鹽析脫水，再用Florisil /C18固相萃取柱去除脂肪，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用QuEChERS 技術(shù)對(duì)水產(chǎn)品中15種PAHs進(jìn)行提取時(shí)，基質(zhì)干擾小、回收率高，能滿足水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求。因此，實(shí)驗(yàn)采用QuEChERS 技術(shù)對(duì)水產(chǎn)品中15種多環(huán)芳烴進(jìn)行提取。

然而在用Florisil /C18固相萃取柱除脂過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用乙腈進(jìn)行一次洗脫時(shí)，回收率很低，進(jìn)而進(jìn)行二次洗脫。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，第二次洗脫液中仍有部分待測(cè)物，兩次洗脫后回收率仍達(dá)不到要求。因此，本實(shí)驗(yàn)采用三次洗脫并收集全部流出液的方法進(jìn)行除脂凈化。

2.4 濃縮過(guò)程的優(yōu)化

PAHs是揮發(fā)性碳?xì)浠衔铮栽跐饪s過(guò)程中可能會(huì)有揮發(fā)損失。實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，在旋蒸濃縮時(shí)，如果完全蒸干，對(duì)低碳的物質(zhì)尤其是PAHs中萘的回收率有很大影響，這可能就是因?yàn)镻AHs沸點(diǎn)較低，過(guò)分蒸干導(dǎo)致目標(biāo)物揮發(fā)。因此，為了防止易揮發(fā)組分在濃縮過(guò)程中揮發(fā)損失，在實(shí)驗(yàn)中，待測(cè)組分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，然后用乙腈定容至1 mL。再過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

2.5 線性相關(guān)和檢出限

吸取適量PAHs標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈-水配制成濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，各吸取50 μL進(jìn)樣分析，據(jù)各組分的響應(yīng)峰面積與相應(yīng)的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表 2。以信噪比(S/N)≥3 確定各組分的檢出限，萘的檢出限為2.0 μg/kg，芴、芘、苯并(a)蒽、苯并(k)熒蒽為0.1 μg/kg，苯并(a)芘為0.5 μg/kg，其它PAHs為1.0 μg/kg?？梢?jiàn)15 種PAHs 的線性良好，靈敏度較高，說(shuō)明高效液相色譜法可用于水產(chǎn)品中15種PAHs含量的測(cè)定。

表3 15種多環(huán)芳烴的線性方程及相關(guān)系數(shù)

2.6 方法準(zhǔn)確性

以蝦、蟹、魚(yú)等樣品為研究對(duì)象，在相同的樣品處理?xiàng)l件下對(duì)15種PAHs污染物進(jìn)行加標(biāo)回收和精密度實(shí)驗(yàn)。圖2為對(duì)蝦樣品和加標(biāo)樣品的色譜圖，以考察方法的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性；實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可知，在不同濃度的加標(biāo)濃度下，樣品的回收率均在75.8%～101%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏均差在15.0%以下。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，高效液相色譜法的準(zhǔn)確度和精密度滿足水產(chǎn)品中PAHs污染物殘留檢測(cè)的要求。

表4 對(duì)蝦加標(biāo)樣的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

組分名稱Nameoftheanalytes加標(biāo)量/(μg/kg)Spikedconcentrations平均回收率/%Averagerecoveries相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差/%RSD萘Naphthalene(Nap)10.095.68.49苊Acenaphthene(Ace)10.092.413.7

續(xù)表4

3 實(shí)際樣品應(yīng)用

實(shí)驗(yàn)應(yīng)用QuEChERS技術(shù)結(jié)合高效液相色譜法，對(duì)2014年采集的60個(gè)蝦、蟹樣品進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度高、實(shí)用性強(qiáng)，適用于水產(chǎn)品中PAHs的檢測(cè)，該方法為進(jìn)一步排查水產(chǎn)中PAHs的隱患和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供技術(shù)支持。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)前處理?xiàng)l件及檢測(cè)條件的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中15種PAHs污染物殘留的同時(shí)測(cè)定。在提取過(guò)程中，采用QuEChERS技術(shù)提取樣品中的PAHs；而在色譜檢測(cè)時(shí)，采用熒光法，通過(guò)多梯度程序和檢測(cè)波長(zhǎng)的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中15種PAHs的有效分離。

在本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)條件下，15種PAHs線性范圍為1～50 ng/mL，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.995。以信噪比(S/N)≥3確定各組分的檢出限，萘的檢出限為2.0 μg/kg，芴、芘、苯并(a)蒽、苯并(k)熒蒽為0.1 μg/kg，苯并(a)芘為0.5 μg/kg，其它PAHs為1.0 μg/kg。對(duì)對(duì)蝦樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，當(dāng)加標(biāo)量為10 μg/kg時(shí)，回收率在75.8%～101%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在15.0%以下。QuEChERS-高效液相色譜法與其他常用提取方法相比，能有效提高水產(chǎn)品中PAHs的回收率，而且設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，適用于水產(chǎn)品中PAHs污染物的檢測(cè)。

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Determination of 15 polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs)residues in aquatic products by high performance liquid chromatography

TANG Shuifen，QIAN Zhuozhen，LUO Fangfang，WANG Lijuan

(Fisheries Research Institute of Fujian，Xiamen 361013，China)

The testing conditions were optimizing and improving based on QuEChERS technique combined with high performance liquid chromatography(HPLC)，which is frequently used for pesticide detection in aquatic products.In the optimized conditions，15 polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs)residues in aquatic products were separated and detected by HPLC.The calibration curves were linear in a concentrations range of 1～50 ng/mL for 15 PAHs with correlation coefficients over 0.995.As(S/N)≥3，the limits of detection was 0.1～2.0 μg/kg.The average recovery ranged from 75.8% to 101% and the relative standard deviation was below 15.0% for spiked shrimp sample with PAHs.Finally，QuEChERS-HPLC was applied for PAHs detecting in practical samples and presented that this method was simple and sensitive to be suitable for PAHs determination in aquatic products．

polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs)；aquatic products；high performance liquid chromatography；QuEChERS

2016-08-11 資助項(xiàng)目：福建省省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)(2014R1003-13)；閩臺(tái)重要海洋生物資源高值化開(kāi)發(fā)技術(shù)公共服務(wù)平臺(tái)(2014FJPT01)；福建重要海洋經(jīng)濟(jì)生物種質(zhì)庫(kù)與資源高效開(kāi)發(fā)技術(shù)公共服務(wù)平臺(tái)(14PZY017NF17).

湯水粉(1985-)女，工程師，主要從事水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè).E-mail：powder2005@126.com

O656.31

A

1006-5601(2016)05-0394-08

湯水粉，錢(qián)卓真，羅方方，等.高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中15種多環(huán)芳烴[J].漁業(yè)研究，2016，38(5)：394-401.