許斌福，龔 暉，李素一，方冬蘭

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，福建 福州 350003)

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鰻源創(chuàng)傷弧菌的鑒定與血清型分析

許斌福，龔 暉，李素一，方冬蘭

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，福建 福州 350003)

本研究對分離自發(fā)病鰻鱺的疑似創(chuàng)傷弧菌進行鑒定及血清型分析，經(jīng)生化鑒定，從發(fā)病鰻鱺中得到7株創(chuàng)傷弧菌；設(shè)計了創(chuàng)傷弧菌溶血素基因(vlly)特異性引物，并對分離菌進行了PCR檢測，創(chuàng)傷弧菌均可擴增出溶血素基因352 bp的目標片段，而非創(chuàng)傷弧菌未擴增出相應(yīng)的片段；制備了創(chuàng)傷弧菌抗O抗原血清，凝集反應(yīng)顯示所得到的鰻源創(chuàng)傷弧菌抗O抗原血清不能與人源創(chuàng)傷弧菌1.1758發(fā)生凝集反應(yīng)，菌株FJ03-X2抗O抗原血清可與大部分的鰻源創(chuàng)傷弧菌發(fā)生凝集反應(yīng)。以上研究結(jié)果表明，基于溶血素基因設(shè)計的PCR引物具有良好的特異性，可用于創(chuàng)傷弧菌檢測，鰻源創(chuàng)傷弧菌血清型不同于其他來源的創(chuàng)傷弧菌，菌株FJ03-X2的O抗原具有良好的免疫原性，可作為創(chuàng)傷弧菌疫苗研發(fā)的候選菌株。

創(chuàng)傷弧菌；生物型；溶血素基因；血清型

創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)是一種人魚共患病的病原菌，該菌為革蘭陰性嗜鹽菌，適宜溫度范圍為20～37℃，可生長鹽度范圍為5～50，最適鹽度為25，對沿海的養(yǎng)殖魚類危害很大；已報道的感染對象有石斑魚(Epinephelussp.)[1]、鰻鱺(Anguillasp.)[2]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[3]、黃姑魚(Nibeaalbiflora)[4]等，被該菌感染的病魚常表現(xiàn)出嚴重的出血和潰爛癥狀，死亡量大。2000年以來，以體表充血、出現(xiàn)可穿透至肌肉潰瘍灶為主要病征的創(chuàng)傷弧菌病開始在福建沿海養(yǎng)殖鰻鱺中流行，病死率可達50%以上，造成巨大的經(jīng)濟損失。創(chuàng)傷弧菌表型差異大，易發(fā)生變異[5]，因此，對創(chuàng)傷弧菌的精準檢測尤為重要。目前，國內(nèi)還未見鰻源創(chuàng)傷弧菌的血清型的相關(guān)研究，為了建立該菌的科學(xué)檢測方法，掌握該菌的流行規(guī)律，本文分析了鰻源創(chuàng)傷弧菌的生化特性，根據(jù)其溶血素基因(vlly)建立了檢測方法，制備了O抗原血清，并對其血清型進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料來源

福建長樂、連江、福清等地表現(xiàn)出典型創(chuàng)傷弧菌病病征的歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)。

1.2 參考菌株

本試驗所用的參考菌株編號、種類和來源如表1所示；試驗鼠為20日齡昆明鼠，購自福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所。

表1 本研究所用參考菌株

1.3 生化鑒定

在無菌條件下，用接種環(huán)從患病魚病灶處取樣，用含1% NaCl的TSA培養(yǎng)基劃線分離細菌，28℃培養(yǎng)24 h，沾取單菌落重懸于3 mL滅菌生理鹽水中，按照API-20E生化鑒定操作說明書，用微量槍吸取100 μL至鑒定條內(nèi)，置28℃孵育24 h，加反應(yīng)試劑顯色，根據(jù)顏色反應(yīng)結(jié)果，應(yīng)用梅里埃公司API LAB PLUS鑒定結(jié)果分析軟件進行鑒定。

1.4 溶血素基因檢測

1.4.1 引物設(shè)計

根據(jù)GeneBank中已發(fā)表的創(chuàng)傷弧菌的溶血素基因(gi：2108219)[6]，采用Primer5.0軟件設(shè)計。上游引物：5’—GGA GCT GAG TAT CCC TGC TGT G 3’；下游引物：5’—GAT TTG TGA CTT ATC GTC CGA A 3’。

1.4.2 模板制備

將-70℃保存的待測菌劃線于TSA平板，28℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落接種于5 mL TSB培養(yǎng)液，28℃、180 r/min振蕩過夜培養(yǎng)，取200 μL菌液，12 000 r/min離心5 min，除去上清，添加100 μL滅菌去離子水，混勻，100℃沸水浴10 min。12 000 r/min離心5 min，取1 μL上清作為PCR反應(yīng)的模板。

1.4.3 PCR反應(yīng)

PCR的反應(yīng)體系：模板1 μL，dNTP Mixture(10 mmol/L)2 μL，rTaq DNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，上下游引物(5 μmol/L)各1 μL，10×ExTaqBuffer(含2.0 mmol/L Mg2+)2.5 μL，ddH2O 17 μL。

PCR的反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，完成30個循環(huán)后，72℃延伸7 min。

反應(yīng)完畢后，1.0%瓊脂糖電泳對PCR反應(yīng)結(jié)果進行鑒定。

1.5 血清型分析

1.5.1 O抗原制備

將得到的創(chuàng)傷弧菌分別接種至含1% NaCl的TSB培養(yǎng)液內(nèi)，于28℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h，將濃度為5.0×109cfu/mL的菌液100℃煮沸熱滅活40 min，12 000 r/min離心15 min，沉淀用無菌生理鹽水重懸到原體積，即為O抗原，置4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 抗O抗原血清制備

抗原與完全弗氏佐劑按1∶1比例渦漩混勻后，腹腔注射免疫試驗小鼠，每只注射0.2～0.3 mL；7 d后，對應(yīng)抗原與不完全弗氏佐劑按1∶1比例渦旋混勻后，二次腹腔注射免疫試驗小鼠，每只注射0.2～0.3 mL；10 d后，純抗原進行第三次小鼠免疫，每只注射0.2～0.3 mL。免疫結(jié)束10 d，抽樣采血試測血清效價；20 d，眼球采血收集各組鼠抗血清(每組設(shè)2個平行組)，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 凝集反應(yīng)

分別吸取菌液(OD595=0.8)12 μL與用生理鹽水倍比稀釋的抗O抗原血清12 μL于96孔蓋板混勻，置37℃水浴10 min，肉眼觀察凝集效價。菌液變清、出現(xiàn)凝集細塊判斷為反應(yīng)陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 生化鑒定

從來源不同，表現(xiàn)出典型創(chuàng)傷弧菌病病征(圖1)的歐洲鰻鱺病灶處分離得到7株創(chuàng)傷弧菌，這7株菌的鄰硝基苯-半乳糖苷酶試驗(ONPG)、賴氨酸脫羧酶試驗(LDC)、明膠液化試驗(GEL)、葡萄糖發(fā)酵試驗(GLU)和苦杏仁苷發(fā)酵試驗(AMY)結(jié)果均為陽性；精氨酸水解酶試驗(ADH)、檸檬酸鹽試驗(CIT)、硫化氫試驗(H2S)、尿素酶試驗(URE)、苯丙氨酸脫氨酶試驗(TDA)、產(chǎn)乙酰甲基甲醇能力試驗(VP)、肌醇發(fā)酵試驗(IDO)、山梨醇發(fā)酵試驗(SOR)、鼠李糖試驗(RHA)、蔗糖發(fā)酵試驗(SAC)、密二糖發(fā)酵試驗(MEL)和阿拉伯糖試驗(ARA)結(jié)果均為陰性。個別菌株的部分生化指標與其他菌不同，其中菌株070516 和071010-1L的鳥氨酸脫羧酶反應(yīng)(ODC)結(jié)果為陰性；菌株070504-LK的甘露糖苷酶(MAN)結(jié)果為陰性；菌株FJ04-L1的氧化酶反應(yīng)(OX)結(jié)果為陰性。這7株菌的生化鑒定結(jié)果詳見表2。

表2 7株創(chuàng)傷弧菌的生化指標

菌株編號Strains1.1758FJ04-L1070504-LKK-3070516FJ03-X2071010-1L031107-X菌株來源Sources中國普通微生物保藏中心標準株福建;歐洲鰻鱺2004福建;歐洲鰻鱺2007福建;歐洲鰻鱺2003福建;歐洲鰻鱺2007福建;歐洲鰻鱺2003福建;歐洲鰻鱺2007福建;歐洲鰻鱺2003生化指標ONPG-+++++++ADH--------LDC++++++++ODC++++-+-+CIT+-------H2S--------URE--------TDA--------IND+-------VP+-------GEL++++++++GLU++++++++MAN-+-+++++INO--------SOR--------RHA--------SAC--------MEL--------AMY++++++++ARA--------OX+-++++++

2.2 溶血素基因檢測

利用所設(shè)計的引物對創(chuàng)傷弧菌和其他菌株進行PCR擴增，僅有創(chuàng)傷弧菌可擴增出預(yù)期大小為352 bp的片段，其他菌株未擴出。結(jié)果如圖2所示。

M：Mark；1.1.1758；2.FJ04-L1；3.070504-LK；4.K-3；5.070516；6.FJ03-X2；7.071010-1L；8.031107-X；9.FJ-A1(m)；10.FJ03-B1；11.HB040223-I；12.ZN1；13.ND-8；14.ND-33；15.EcGY020401；16.MF-1；17.空白對照(Blank control)。

2.3 凝集反應(yīng)

O抗原凝集反應(yīng)(表3)表明，各菌的抗O抗原血清對本菌均具有良好的凝集性，凝集效價可達26，其中菌株FJ03-X2抗O抗原血清可與所得到的5株其他創(chuàng)傷弧菌O抗原發(fā)生凝集反應(yīng)，與菌株071010-1L的O抗原無凝集；菌株031107-X抗O抗原血清可與所得到的4株其他創(chuàng)傷弧菌O抗原發(fā)生凝集反應(yīng)，但與菌株071010-1L和070504-LK的O抗原無凝集。但菌株071010-1L的抗O抗原血清除了與本菌外，僅可與菌株FJ03-X2的O抗原發(fā)生較強的凝集反應(yīng)，菌株070516和K-3的抗O抗原血清除了與本菌外，僅能與菌株FJ03-X2的O抗原發(fā)生凝集反應(yīng)，菌株070504-LK的抗O抗原血清除了與本菌外，僅能與菌株O70516的O抗原發(fā)生凝集反應(yīng)，菌株FJ04-L1的抗O抗原血清除了與本菌外，還可與菌株K-3、070516和FJ03-X2的O抗原發(fā)生凝集反應(yīng)。

表3 O抗原凝集反應(yīng)結(jié)果

3 討論

本研究所分離到的7株菌株經(jīng)生化鑒定證實是創(chuàng)傷弧菌。創(chuàng)傷弧菌可分為生物1型、生物2型、生物3型，對鰻鱺具有致病力的僅有生物2型，不產(chǎn)生吲哚是生物2型區(qū)別于生物1型的主要特征[7]，本研究鑒定為創(chuàng)傷弧菌的7株菌均不產(chǎn)生吲哚；少部分菌株的個別生化結(jié)果與其他菌株有異，這可能與創(chuàng)傷弧菌的表型不夠穩(wěn)定，易出現(xiàn)非典型菌株有關(guān)[5]，除菌株070516和071010-1L鳥氨酸脫羧酶反應(yīng)(ODC)為陰性外，其余5株創(chuàng)傷弧菌與生物1型或生物2型關(guān)鍵指標相符合[8]；菌株070516和071010-1L是否屬于其他生物型還需進一步探討。

創(chuàng)傷弧菌除了表型不夠穩(wěn)定外，生化鑒定時創(chuàng)傷弧菌生化指標也不易與哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)進行區(qū)分[7]。因此人們嘗試采用免疫學(xué)和分子生物學(xué)的方法檢測創(chuàng)傷弧菌，創(chuàng)傷弧菌的溶細胞素基因(vvhA)已被克隆并應(yīng)用于創(chuàng)傷弧菌的檢測，但該基因與霍亂弧菌E1Tor溶血素具有較高的同源性，用于PCR檢測時，霍亂弧菌也可能出現(xiàn)陽性結(jié)果；而創(chuàng)傷弧菌溶血素基因?qū)儆趯αu苯基丙酮酸雙氧化酶基因(HPPD)家族，具有很高的保守性[6]。本文在生化鑒定的基礎(chǔ)上應(yīng)用創(chuàng)傷弧菌溶血素基因設(shè)計的引物對所分離得到的創(chuàng)傷弧菌進行驗證，結(jié)果表明本試驗所采用的創(chuàng)傷弧菌均能擴增出目標條帶，其余非創(chuàng)傷弧菌均未能檢出；證實了創(chuàng)傷弧菌溶血素具有創(chuàng)傷弧菌種屬特異性[9]，可用于創(chuàng)傷弧菌檢測。

研究表明，創(chuàng)傷弧菌生物2型的脂多糖(LPS)具有與生物1型不同的免疫原性[10]，LPS側(cè)鏈多糖的特異性是細菌學(xué)O群血清型劃分的基礎(chǔ)，本研究制備了創(chuàng)傷弧菌抗O抗原血清，通過凝集反應(yīng)，在國內(nèi)首先對所分離得到的創(chuàng)傷弧菌進行血清學(xué)分析，結(jié)果表明，所得到的鰻源創(chuàng)傷弧菌O抗原均不能與標準株1.1758發(fā)生凝集反應(yīng)，說明二者間存在生物型的差異。另部分菌株抗O抗原血清除了與本菌外，僅可與少數(shù)菌株發(fā)生凝集，而這些菌株多來自同一地區(qū)，說明創(chuàng)傷弧菌可能發(fā)生了變異；有些菌株抗O抗原血清不能識別其他大部分菌株的O抗原，但其他菌的抗O抗原血清可識別其O抗原，可能是因為血清中含有R型抗體之故[11]，菌株FJ03-X2的抗O抗原血清可與除菌株071010-1L外的創(chuàng)傷弧菌發(fā)生凝集反應(yīng)，說明該菌具有良好的免疫原性、廣適性，可作為創(chuàng)傷弧菌疫苗研發(fā)的候選菌株。

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Identification and serotypes analysis of Vibrio vulnificus from Anguilla anguilla

XU Binfu，GONG Hui*，LI Suyi，F(xiàn)ANG Donglan

(Biotechnology Institute，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)uzhou 350003，China)

Seven strains of bacteria were isolated from the diseased eel，and which were identified asVibriovulnificusthrough 21 kinds of biochemical indexes analysis.The specific primers amplifying hemolysin gene(vlly)ofVibriovulnificuswere designed to detect the isolated bacteria genome DNA，the PCR results indicated that the specific fragments of 352 bp DNA could be amplified from the isolatedVibriovulnificus，but could not amplify any positive band from non-Vibriovulnificusbacteria.The mouse serum anti the O antigen ofVibriovulnificuswere prepared，and the assay of agglutination reaction showed that the serum anti-O antigen ofVibriovulnificusfrom eel could not agglutinate to the strain 1.1758 ofVibriovulnificusisolated from human.However，the serum anti O antigen of FJ03-X2 could agglutinate to the most strains ofVibriovulnificusfromAnguillaanguilla.These results suggested that the PCR primers based on hemolysin gene could specifically detect the strains ofVibriovulnificus，the serovar ofVibriovulnificusfrom eel was different from other sources，and the strain of FJ03-X2 had good immunogenicity O antigen and could be as candidate strain for vaccine development ofVibriovulnificus.

Vibriovulnificus；biotype；gene of hemolysin；serotype

2016-07-20 資助項目：福建省科技廳公益類科研院所專項(2014R1019-6)；福建省科技廳農(nóng)業(yè)引導(dǎo)重點項目(2014N0010)；福建省農(nóng)科院雙百項目(sbmd1627).

許斌福(1973-)，男，副研究員，主要從事水生生物病害研究.E-mail：xbfcxj@163.com

龔 暉(1971-)，男，研究員，主要從事水生生物病原學(xué)、免疫學(xué)研究.E-mail：ghxfjm@163.com

Q936；S941.42

A

1006-5601(2016)05-0351-06

許斌福，龔 暉，李素一，等.鰻源創(chuàng)傷弧菌的鑒定與血清型分析[J].漁業(yè)研究，2016，38(5)：351-356.