吳 桐 徐文峰 年四季 葉迎春 袁 青

(四川醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，瀘州646000)

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金黃色葡萄球菌α-溶血素的克隆及可溶性融合表達①

吳 桐 徐文峰 年四季 葉迎春 袁 青

(四川醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，瀘州646000)

目的：表達純化可溶性金黃色葡萄球菌α-溶血素(α-HL)作為抗原，用以后期制備全人源抗α-HL抗體，為金黃色葡萄球菌感染提供新的治療手段。方法：提取金黃色葡萄球菌總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術(shù)，擴增α-HL cDNA，將cDNA雙酶切后與載體pCold-TF連接，轉(zhuǎn)化E.coli TOPO 10，菌落PCR及測序驗證插入基因的正確性。將測序正確的α-HL/pCold-TF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21進行低溫誘導表達，SDS-PAGE和Western blot驗證表達產(chǎn)物的正確性。結(jié)果：PCR擴增得到的α-HL基因大小為900 bp左右；將重組質(zhì)粒α-HL/pCold-TF轉(zhuǎn)化E.coli BL21，經(jīng)15℃低溫誘導表達24 h ，誘導得到可溶性的α-HL融合蛋白，融合蛋白大小為90 kD左右(載體上的TF 分子伴侶大小為45 kD左右)；經(jīng)Western blot 驗證表達純化的蛋白為α-HL融合蛋白。將純化的α-HL蛋白注射BABL/c小鼠制備抗血清，結(jié)果顯示抗血清與金黃色葡萄球菌結(jié)合良好，效價大于10 000倍。結(jié)論：成功對α-HL進行了基因克隆，并成功表達純化到可溶性的α-HL融合蛋白。

金黃色葡萄球菌；α-HL；可溶性表達

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是人類感染性疾病的重要病原體，特別容易引發(fā)肺炎、皮膚膿腫和菌血癥，感染后具有很高的死亡率?？股厥侵委熃瘘S色葡萄球菌感染的主要手段，長期以來是有效的。隨著近年世界范圍內(nèi)的抗生素濫用越來越嚴重，金黃色葡萄球菌出現(xiàn)了對幾乎所有抗生素耐藥的菌株--耐甲氧西林金葡菌MRSA。MRSA幾乎對所有β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥，甚至累及到紅霉素、環(huán)丙沙星和慶大霉素。如果葡萄球菌屬一旦對萬古霉素耐藥，臨床將無藥可用。而抗生素研究在近年發(fā)展緩慢，幾乎沒有新的更有效的抗生素產(chǎn)品問世。金黃色葡萄球菌感染特別是耐甲氧西林金葡菌MRSA的感染，已經(jīng)成為世界上三大感染治療難題之一。MRSA的感染治療難度越來越大，甚至已經(jīng)成為醫(yī)源性感染的主要死因。

金黃色葡萄球菌α-溶血素(α-HL)是一種外毒素，具有良好的抗原性，已經(jīng)被證明是金黃色葡萄球菌導致多種動物感染性疾病的關(guān)鍵毒力因子，在金黃色葡萄球菌感染特別是醫(yī)源性感染中，起主要作用。針對金黃色葡萄球菌α-HL，近來的研究表明，免疫治療的方法是有效的。但人類自身的抗體對抗α-HL的效果很微弱，而動物源性的抗體在臨床上證明是很有局限性的，容易產(chǎn)生人抗鼠抗體反應(HAMA)[1-3]。因此，我們研究通過制備抗α-HL 的全人源單克隆抗體，以獲得更好的治療效果[1,4]。本研究首先需要表達純化出可溶性的金黃色葡萄球菌α-HL作為抗原[5-7]，為后期制備抗α-HL的全人源抗體奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 金黃色葡萄球菌標準菌株購自中國科學院微生物研究所，DNA回收試劑盒購自天根生物，質(zhì)粒提取試劑盒購自omega 公司，p-Cold-TF載體，Ni-NTA 親和純化系統(tǒng)、蛋白預染Marker(BenchMarkTMpre-stained protein ladder)，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、Ex Taq 酶、DNA標準分子量(1 000 bp DNA ladder)、低分子量蛋白Marker 購自TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌總RNA提取和基因擴增 利用煮沸法提取金黃色葡萄球菌總RNA。液體培養(yǎng)基培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，離心收集細菌沉淀，加入溶葡萄球菌酶，37℃溫育10 min，再加入蛋白酶K，并繼續(xù)于37℃溫育10 min，然后煮沸10 min。迅速轉(zhuǎn)移至冰浴放置1 min，離心收集上清加入等體積的氯仿，離心收集水相加入等體積的異丙醇，大力振蕩后離心。沉淀用70%乙醇洗滌兩次，離心后在空氣中干燥，并溶解于25 μl RNase-free水中。

RT-PCR擴增金黃色葡萄球菌α-HL cDNA。從NCBI 基因數(shù)據(jù)庫中下載金黃色葡萄球菌α-HL基因序列，根據(jù)基因序列設(shè)計引物，采用巢氏PCR擴增α-HL(表1)。取 α-HL cDNA 2 μl 作為模板，采用引物對α-HL F1-Forword/α-HL R1-Reverse進行第一次PCR擴增。取第一次PCR產(chǎn)物為模板，進行第二次PCR擴增，引物對為α-HL F2-XhoⅠ/α-HL R2-EcoRⅠ。PCR程序為：94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)，然后72℃ 10 min。

1.2.2 金黃色葡萄球菌α-HL的克隆 將金黃色葡萄球菌α-HL PCR擴增產(chǎn)物進行DNA回收，用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和 EcoRⅠ雙酶切α-HL，回收DNA和載體質(zhì)粒pCold TF DNA。將酶切產(chǎn)物用T4連接酶連接轉(zhuǎn)化E.coli TOPO 10，將轉(zhuǎn)化菌涂于含氨芐青霉素的LB(LBA)平板，37℃培養(yǎng)過夜，次日挑取單菌落進行菌落PCR鑒定。鑒定的陽性克隆子提取質(zhì)粒，送公司測序驗證。將測序正確的α-HL/p-Cold TF陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21，涂LBA平板過夜培養(yǎng)，次日挑取單菌落，PCR及測序驗證質(zhì)粒插入序列的正確性。

1.2.3 金黃色葡萄球菌α-HL的表達純化 接種轉(zhuǎn)化有α-HL/p-Cold TF陽性重組質(zhì)粒的E.coli BL21于LBA培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4～0.5，立即將培養(yǎng)液移至15℃放置30 min，加入終濃度1 mmol/L 的IPTG，15℃振蕩培養(yǎng)24 h。離心取細菌沉淀，通過4種不同的裂解方法使得細菌裂解，再將裂解的沉淀和上清分別上樣進行SDS-PAGE電泳，鑒定融合蛋白的可溶性。4種不同的裂解方法分別為：① 取5 ml 表達細菌沉淀，加入500 μl天然蛋白Lysis buffer(配方參見Ni-NTA 親和純化系統(tǒng)說明書)重懸，反復凍融3～5次，離心分別取上清和沉淀備用；② 取5 ml 表達細菌沉淀，加入500 μl天然蛋白Lysis buffer重懸，加入溶菌酶，冰上搖動30 min，再反復凍融3～5次，離心分別取上清和沉淀備用；③ 取5 ml 表達細菌沉淀，加入500 μl 1×PBS重懸,反復凍融3～5次，離心分別取上清和沉淀備用；④ 取5 ml 表達細菌沉淀，加入500 μl 1×PBS重懸,加入溶菌酶，冰上搖動30 min，再反復凍融3～5次，離心分別取上清和沉淀備用。

按Invitrogen公司的Ni-NTA 親和純化系統(tǒng)說明書對表達的可溶性蛋白進行天然純化，并進行SDS-PAGE和Western blot鑒定。鑒定表達、純化的蛋白采用抗His-tag單克隆抗體(GE Healthcare，來源于小鼠)和羊抗小鼠(IgG)辣根過氧化物酶標記抗體(Promega,USA)進行檢測，最后加入化學發(fā)光劑(Lu minata Crescendo Western HRP substrate，USA)顯色。

1.2.4 α-HL多克隆抗體的制備及效價測定 將純化的α-HL蛋白100 μg與弗氏完全佐劑混合，皮下注射BABL/c小鼠，間隔2周后，用50 μg α-HL蛋白與弗氏不完全佐劑混合后皮下注射BABL/c小鼠2次，每次中間間隔2周。末次注射后，心臟采血，離心取血清于4℃保存。

用包被液(0.1 mol/L NaHCO3/Na2CO3溶液)稀釋金黃色葡萄球菌為1×107CFU/ml，包被酶聯(lián)板4℃過夜，次日加入封閉液(1×PBST含5%脫脂奶粉)，37℃保濕溫育1 h。加入封閉液×100、×1 000、×10 000稀釋的α-HL抗血清，每孔100 μl，37℃封閉1 h；洗滌酶聯(lián)板后，加入羊抗鼠HRP(1∶5 000)抗體，37℃保濕溫育1 h；洗滌后加入TMB底物溶液避光顯色，30 min后加入2 mol/L H2SO4終止反應，酶標儀OD450讀數(shù)。

表1 用于擴增金黃色葡萄球菌α-HL cDNA的引物對

Tab.1 Primer used for amplification of S.aureus α-HL cDNA

PrimerSequenceα-HLF1-Forword5'CACCATGCTATTGCTAGGTTCC3'α-HLR1-Reverse5'GGTACCTTTCCAATTTGTTGAAGTCCAATG3'α-HLF2-xhoⅠ5'CCGCTCGAGATGACACGTATAGTCAGCTCA3'α-HLR2-EcoRⅠ5'CCGGAATTCTTCTGAAGAACGATCTGTCCA3'

2 結(jié)果

2.1 金黃色葡萄球菌總RNA的提取與α-HL基因的擴增 提取金黃色葡萄球菌總RNA時，采用了傳統(tǒng)的酚/氯仿抽提法、天根生物的總RNA提取試劑盒及本研究方法中使用的煮沸法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)前兩種方法提取的總RNA濃度和質(zhì)量都較低，不能滿足后續(xù)RT-PCR的要求，可能由于金黃色葡萄球菌細胞壁厚而堅固，導致破壁不完全。而煮沸法采用溶葡萄球菌酶使金黃色葡萄球菌破壁完全，釋放總RNA，從而得到質(zhì)量較高且完整的RNA，濃度為912.05 ng/μl ，采用0.8% 瓊脂糖電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，總RNA的3條帶(28S、18S、5S)條帶清晰，說明總RNA提取率高，并且降解少。

以總RNA為模板，Oliga dT15 為引物反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。在進行PCR擴增α-HL基因片段時，采用了巢氏PCR，分兩次擴增，其中第二次擴增時在引物上加入了xhoⅠ和 EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶位點，最終得到了大小為900 bp 左右的金黃色葡萄球菌α-HL基因片段(圖1)。

圖1 PCR擴增α-HL cDNA Fig.1 Identification of amplified α-HL cDNA by PCRNote: M.DNA marker 1 000 bp；Line 3.α-HL cDNA.

2.2 金黃色葡萄球菌α-HL基因的克隆與表達 由于表達菌株E.coli BL21轉(zhuǎn)化效率低，所以將金黃色葡萄球菌α-HL和pCold-TF重組質(zhì)粒雙酶切并連接后，首先轉(zhuǎn)化E.coli TOPO 10菌株，PCR及測序驗證插入序列正確后，將重組質(zhì)粒α-HL/p-Cold TF轉(zhuǎn)化E.coli BL21并進行表達。pCold TF是插入蛋白可溶性標簽的融合型冷休克表達載體，采用低溫誘導的方法，使大腸桿菌自身的蛋白質(zhì)合成受到抑制、目的蛋白質(zhì)獲得高效表達。pCold TF載體在His tag序列和多克隆位點之間插入了Trigger Factor(TF)基因，可與目的蛋白質(zhì)進行融合表達，提高目的蛋白的可溶性。

在進行金黃色葡萄球菌α-HL表達時，在15℃誘導表達了24 h，為了驗證目的蛋白的可溶性，收集表達的細菌沉淀，分別用方法中所述4種方法對細菌沉淀進行裂解，再離心分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳。結(jié)果顯示：4種方法中采用的Lysis buffer 和PBS中都不含有蛋白變性劑，為天然蛋白緩沖液，將表達的細菌沉淀用反復凍融或加入溶菌酶后反復凍融的方式使細菌裂解，離心后SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示4種方法都能夠有效的裂解表達細菌，從而使目的可溶性蛋白有效的釋放出來，所以細菌裂解上清中都有目的融合蛋白出現(xiàn)，大小為90 kD 左右(載體上的TF 分子伴侶大小為45 kD左右)，而裂解離心后的細菌碎片沉淀中并沒有出現(xiàn)目的蛋白。說明表達的蛋白為可溶性蛋白，并且表達量高，達到了2 mg/100 ml 左右(圖2)。

2.3 金黃色葡萄球菌α-HL 的純化及鑒定 由于pCold-TF載體上帶有His-tag標簽，對表達的可溶性蛋白Ni-NTA親和純化系統(tǒng)中天然蛋白純化條件進行純化。純化后的蛋白用SDS-PAGE進行了鑒定(圖3)，結(jié)果顯示在90 kD處出現(xiàn)了目的蛋白條帶。由于是將表達細菌進行裂解，細菌的蛋白也同時釋放到緩沖液中。Ni-NTA親和純化系統(tǒng)在進行純化時，對細菌蛋白也有一些非特異性的吸附，所以導致純化時出現(xiàn)了微弱的非特性條帶。為了驗證在90 kD出現(xiàn)的條帶為α-HL，對表達的蛋白進行了Western blot驗證，結(jié)果顯示在90 kD處出現(xiàn)了單一條帶，說明表達純化的可溶性蛋白為α-HL融合蛋白(圖4)。

圖2 SDS-PAGE電泳α-HL融合蛋白可溶性驗證Fig.2 Analysis solubility of α-HL recombinant protein by SDS-PAGENote: M.Protein molecular weight marker；Line 1.Positive control；Line 2,4,6,8.Supernatant of lysised sample by method ①，②，③，④；Line 3，5，7，9.Precipitation of lysised sample from method ①，②，③，④.

圖3 SDS-PAGE分析純化的α-HL融合蛋白Fig.3 Analysis of purified α-HL protein by SDS PAGENote: M.Protein molecular weight marker；Line 1-3.Expressed protein of α-HL.

圖4 α-HL 純化蛋白Western blot 驗證印跡Fig.4 Analysis of expressed α-HL protein by Wes-tern blot

圖5 α-HL多克隆抗體ELISA效價測定Fig.5 α-HL polyclonal antibody ELISA titer determination

2.4 抗金黃色葡萄球菌α-HL抗血清制備及效價測定 為了驗證表達純化的α-HL融合蛋白具有生物學活性，將純化的金黃色葡萄球菌α-HL分3次皮下注射BABL/c小鼠，取血清進行ELISA檢測其抗血清效價。為了驗證所制備的抗血清是針對金黃色葡萄球菌α-HL，在進行ELISA檢測時，將金黃色葡萄球菌包被酶標板，結(jié)果顯示制備的抗血清能與金黃色葡萄球菌良好結(jié)合，其抗血清效價>10 000倍(圖5)，說明表達純化的α-HL融合蛋白是具有生物學活性的。

3 討論

金黃色葡萄球菌是一種人類的主要病原菌，可造成危及生命的侵襲性感染，如肺炎、皮膚膿腫及菌血癥、心內(nèi)膜炎等。隨著全球范圍內(nèi)的抗生素濫用，出現(xiàn)了幾乎對所有抗生素(除萬古霉素)耐藥的金葡菌MRSA。近年抗生素的研究滯后，使得金黃色葡萄球菌感染的治療越來越困難。研究發(fā)現(xiàn)，在健康人、金黃色葡萄球菌攜帶者和感染者的血清中，都檢測到有金葡菌的抗體，但此抗體的抗感染保護作用還存有很大爭議。

金黃色葡萄球菌α-HL是金黃色葡萄球菌的主要毒力因子，在感染中發(fā)揮主要作用。近來的研究發(fā)現(xiàn)，通過免疫治療的方法，以α-HL作為抗原，制備全人源的抗α-HL抗體，在小鼠肺炎模型中，可以顯著提高小鼠的存活率；在小鼠皮膚膿腫模型中，可以有效減小膿腫病灶并且使單位感染面積的細菌量顯著降低；在小鼠菌血癥模型中，小鼠的存活率也幾乎增大一倍[1]。因此，抗金黃色葡萄球菌α-HL全人源抗體藥物的開發(fā)，具有極大臨床應用潛力。本研究提取金黃色葡萄球菌總RNA，擴增克隆α-HL cDNA，從而表達可溶性的α-HL。金黃色葡萄球菌細胞壁厚而堅固，裂解困難，RNA降解速度快，提取完整的總RNA不容易。通過查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻，對各種提取方法進行實驗比較，發(fā)現(xiàn)基于溶葡萄球菌酶的煮沸法是最好的提取方法，此法成功提取到高質(zhì)量的完整金葡菌總RNA。采用pCold-TF載體在E.coli BL21中對α-HL進行可溶性表達。大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前研究最為深入，發(fā)展最迅速的原核表達系統(tǒng)。大腸桿菌不僅在遺傳學背景、基因表達調(diào)控機理方面的研究非常清晰，而且擁有多種適應不同表達的載體和宿主菌，但其缺點是表達的蛋白大部分為沒有生物學活性的包涵體。本研究采用pCold-TF表達載體在低溫條件下誘導表達的α-HL可溶性融合蛋白，將α-HL可溶性融合蛋白注射BABL/c小鼠，得到的抗血清可與金黃色葡萄球菌良好結(jié)合，說明誘導表達的α-HL具有生物學活性[8]。采用pCold-TF表達系統(tǒng)表達的α-HL產(chǎn)量高，可達到2 mg/100 ml，可滿足后續(xù)全人源抗α-HL抗體的篩選。由于表達的α-HL為融合蛋白，帶有TF標簽，在后續(xù)作為抗原進行抗α-HL抗體的篩選時，為避免非特異性篩選，需用Factor Xa 將TF標簽切除后再使用。

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[收稿2015-09-15 修回2015-11-24]

(編輯 倪 鵬)

Clone and soluble fusion expression of α-HL of Staphylococcus aureus

WU Tong,XU Wen-Feng,NIAN Si-Ji,YE Ying-Chun,YUAN Qing.The School of Basic Medical Sciences,Sichuan Medical University,Luzhou 646000，China

Objective:Expression and purification of the α-HL of Staphylococcus aureus as antigen for making full human anti-α-HL antibody later,providing of new treatment for Staphylococcus aureus infection.Methods: The total RNA of Staphylococcus aureus was extracted and the cDNA of α-HL was amplified by RT-PCR.The DNA of α-HL and pCold-TF plasmid was digested and ligated by T4 ligase and then transformed into E.coli TOPO 10.The recombinant plasmid α-HL/pCold-TF which verified by sequencing was transformed into E.coli BL21 for expression.The expression products was identified by SDS-PAGE and Western blot.Results: The size of amplified cDNA of α-HL was about 900 bp and the expressed soluble fusion protein of α-HL was about 90 kD(including the molecular chaperone in the vector) after inducing expression for 24 h at 15℃.The Western blot results showed that the expressed protein was the fusion protein of α-HL.The purified α-HL was injected into BABL/c mice for making antiserum.The results showed that the antiserum had good binding activity with Staphylococcus aureus and the titer was greater than 10 000 times.Conclusion: The α-HL of Staphylococcus aureus was successfully cloned and the soluble fusion protein of α-HL was successfully expressed.

Staphylococcus aureus；α-HL；Soluble expression

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.018

吳 桐(1982年-)，男，助理實驗師，主要從事感染免疫學研究。

及指導教師：袁 青(1978年-)，女，博士，教授，主要從事重組抗體方面研究，E-mail:yuanqing_ok@hotmail.com。

R392.11

A

1000-484X(2016)04-0532-05

①本文為四川省科技廳項目(LY-96,013SZZ005)和瀘州市科技局項目(2013LZLY-K77)。