□ 陳志強(qiáng)　阿依古麗　宋　鈺　張　穎　吐魯番市質(zhì)量與計(jì)量檢測(cè)所

葡萄干中5-羥甲基糠醛的液相色譜測(cè)定

□ 陳志強(qiáng)阿依古麗宋鈺張穎吐魯番市質(zhì)量與計(jì)量檢測(cè)所

闡述葡萄干中羥甲基糠醛檢驗(yàn)方法和條件，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)確定葡萄干中羥甲基糠醛測(cè)定的提取凈化條件和色譜檢測(cè)條件。本研究針對(duì)樣品的前處理方法、檢測(cè)和確證方法的選擇和優(yōu)化，建立適用于葡萄干樣品的前處理方法、儀器測(cè)定方法和確證方法。

葡萄干；5-羥甲基糠醛；液相色譜；儀器條件

5-羥甲基糠醛（5-Hydroxym ethyl furfural，5-HM F）是葡萄糖、果糖等單糖化合物在高溫或弱酸等條件下脫水產(chǎn)生的醛類化合物，具有高活性的呋喃環(huán)、芳醇、芳醛結(jié)構(gòu)，其衍生物被廣泛的用作真菌劑、腐蝕抑制劑、香料，并作為一種有效防治神經(jīng)退行性疾病、認(rèn)知損害和抗心肌缺血的心血管病藥物，受到研究人員的廣泛關(guān)注。食品工業(yè)中，美拉德反應(yīng)和焦糖化反應(yīng)也可產(chǎn)生羥甲基糠醛，但具有一定毒副作用，對(duì)眼、黏膜、皮膚有刺激性，過量食用會(huì)引起中毒，造成動(dòng)物橫紋肌麻痹和內(nèi)臟損害。

5-羥甲基糠醛的含量是衡量葡萄干品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，吐魯番是我國(guó)最大的葡萄干加工和出口基地，檢測(cè)5-羥甲基糠醛的含量對(duì)于提升葡萄干品質(zhì)，提升市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力具有積極的意義。

1　方法

5-羥甲基糠醛的檢測(cè)方法通常有控制溶液的顏色、紫外法、雙波長(zhǎng)法、雜質(zhì)對(duì)照法等。5-羥甲基糠醛的最大吸收波長(zhǎng)為284 nm，該處干擾較少，紫外法常可作為5-羥甲基糠醛檢測(cè)的首選方法。如中國(guó)藥典2000、BP2000、USP27和日本藥局方中納入的葡萄糖注射液，均采用紫外法測(cè)定5-羥甲基糠醛含量。如果樣品中的雜質(zhì)在284 nm有明顯的吸收，則會(huì)干擾5-羥甲基糠醛的檢測(cè)，應(yīng)采用HPLC法代替。本文主要探討HPLC法的條件。1.1 提取凈化

葡萄干及其制品中主要含有糖、有機(jī)酸、色素、植物蛋白等物質(zhì)，因其含糖量高需對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，5-羥甲基糠醛極性大，易溶于水和甲醇，故采用水稀釋樣品。直接稀釋進(jìn)樣有機(jī)酸、色素干擾大，需凈化待測(cè)樣品。根據(jù)葡萄干的特點(diǎn)和5-羥甲基糠醛的化學(xué)性質(zhì)，Bond Elut EN V、HLB等固相萃取柱在一定條件下對(duì)葡萄干中的羥甲基糠醛有較好的吸附，因此進(jìn)一步研究這些固相萃取柱在葡萄干中5-羥甲基糠醛殘留檢測(cè)中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Bond Elut EN V 固相萃取柱可重復(fù)利用，且上樣后流速較HLB小柱快，故選用Bond Elut EN V小柱作為凈化柱。

選用Bond Elut EN V固相萃取柱（500 m g，6 m L），研究固相萃取凈化時(shí)的上樣量、淋洗、洗脫條件。固相萃取柱用5 m L甲醇，10 m L水活化。

1.2樣品前處理

稱取剪碎的葡萄干10 g加水浸泡1～2 h，放入高速組織搗碎機(jī)中，加少量水搗碎，全部轉(zhuǎn)移至100 m L容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻、過濾，濾液備用。取濾液直接上樣，用水淋洗，去除糖和部分有機(jī)酸。

1.3上樣量

選擇葡萄干濾液為檢測(cè)樣品，分別量取3.0、4.0、5.0、6.0 m L各3份，添加標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μ g，上樣后用水淋洗樣品管和固相萃取柱，用30 m L 20%甲醇水溶液洗脫，洗脫液用水稀釋定容至50 m L，進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算加標(biāo)回收率，見表1。稱樣量為6.0 m L時(shí)，回收率明顯低于其他稱樣量的回收率，這是由于萃取柱的載樣量有限，稱樣大時(shí)易造成萃取柱過載，從而使回收率偏低，為保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，確定樣品稱樣量為 5.0 m L。

表1　不同樣品量加標(biāo)回收率

1.4淋洗及洗脫條件

選擇水作為淋洗劑，結(jié)果表明，5 m L水基本能把固相萃取柱上的糖和極性大的物質(zhì)完全淋洗下來。分別研究體積比為10%、20%、30%的甲醇-水作為洗脫劑的洗脫效果，結(jié)果表明，三種比例的洗脫劑用量20 m L時(shí)，均能將5-羥甲基糠醛從SPE小柱上洗脫下來，其中30%甲醇-水洗脫雜質(zhì)較多，10%和20%甲醇-水洗脫雜質(zhì)少，凈化效果較好。但10%甲醇-水洗脫時(shí)回收率較低，通過增大洗脫劑用量可提高回收率，說明10%甲醇-水作為洗脫劑時(shí)用量大，綜合考慮選擇20%甲醇-水作為洗脫劑。

1.5洗脫條件的優(yōu)化

吸取5 m L葡萄干濾液樣品6份，分別加入100 μ g標(biāo)準(zhǔn)品，平行處理6個(gè)固相萃取柱，按照前述活化、淋洗，分別用10、15、20、25、30 m L和35m L 20%甲醇-水洗脫，制作洗脫曲線。結(jié)果表明洗脫劑體積為20 m L時(shí)，回收率大于99%，基本能洗脫完全，洗脫曲線如圖1所示，為保證不同樣品均能洗脫完全，最終確定洗脫體積為25 m L。

圖1　Bond Elut ENV 柱上羥甲基糠醛的洗脫曲線

1.6最終確定的提取凈化方法

吸取5 m L葡萄干濾液于50 m L離心管中，加入20 m L水，充分溶解混勻，取活化好的聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物固相萃取柱（Bond Elut EN V），將樣品溶液全部上樣，用5 m L水洗滌樣品管，洗滌液也上柱凈化，再用5 m L水淋洗固相萃取柱，最后用25 m L甲醇-水洗脫，整個(gè)固相萃取過程保持流速2～3 m L/m in，收集洗脫液，用水定容至50 m L，過0.2 μ m微孔濾膜，供高效液相色譜法檢測(cè)。

2　高效液相色譜條件

主要研究色譜柱和流動(dòng)相，在色譜柱選擇時(shí)，流動(dòng)相為乙腈-水（10∶90，V/V）比較BEH C18、HSS T3色譜柱，發(fā)現(xiàn)使用BEH C18色譜柱時(shí)，5-羥甲基糠醛出峰過早，在1m in左右出峰，調(diào)整流動(dòng)相比例仍無明顯改變。而HSS T3色譜柱對(duì)極性較大的羥甲基糠醛色譜保留效果較好，所以選擇HSS T3色譜柱進(jìn)行下一步研究。研究流動(dòng)相時(shí)，比較甲醇-水（8∶92，V/V）、乙腈-水（8∶92，V/V）的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，選用甲醇做流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)物與雜質(zhì)分離較差，同時(shí)目標(biāo)物出峰較晚，分析時(shí)間延長(zhǎng)；而選用乙腈做流動(dòng)相時(shí)，分離效果明顯變好且分析時(shí)間縮短，故選定水和乙腈為流動(dòng)相。

最終確定的液相色譜條件如下。色譜柱：W aters ACQ U ITY U PLC H SS T3柱（100 m m×2.1 m m，1.8 μ m）；流動(dòng)相：乙腈-水（8∶92，V/V）等度洗脫，使用前過濾并脫氣；柱溫：35 ℃；樣品室溫度：20 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：285 nm；流速：0.3 m L/m in；進(jìn)樣量：10 μ L。

根據(jù)樣液中羥甲基糠醛的含量情況，選定與樣液濃度相近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液中羥甲基糠醛的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)線性范圍內(nèi)，如果樣液中羥甲基糠醛的含量超出檢測(cè)的線性范圍，則稀釋后再進(jìn)樣。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液等體積分時(shí)段參插進(jìn)樣測(cè)定，以保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量，在給定的液相色譜熒光檢測(cè)條件下，羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖如圖2所示。

3　線性與測(cè)定低限

配制濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 μ g/m L和10.0 μ g/m L的5-羥甲基糠醛系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按方法規(guī)定的色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，并以標(biāo)準(zhǔn)濃度（X，μ g/m L）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)作圖，同時(shí)用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=230 00X+2 778.4，線性相關(guān)系數(shù)R2為1.000 0，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，線性關(guān)系良好。

圖2　羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)溶液的超高效液相色譜圖（4 μg/mL）

圖3　標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2　羥甲基糠醛的加標(biāo)回收率和精密度（n=6）

4　回收率及精密度

本方法采用添加回收的方法，對(duì)葡萄干樣品按表2規(guī)定的水平進(jìn)行添加，每個(gè)樣品添加3個(gè)水平，每個(gè)添加水平重復(fù)6次，按規(guī)定的高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，本方法回收率及室內(nèi)精密度見表2。

5　結(jié)語

目前國(guó)際上對(duì)果汁中5-羥甲基糠醛的含量無統(tǒng)一的限量規(guī)定，歐盟果蔬汁飲料工業(yè)協(xié)會(huì)（AIJN）規(guī)定果汁中5-羥甲基糠醛的最大殘留限量為20 m g/ L；國(guó)際果汁加工聯(lián)合會(huì)（IFFJP）建議果汁中5-羥甲基糠醛的最大殘留限量為5～10 m g/L，濃縮果汁中最大殘留限量為25 m g/L。本檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)中5-羥甲基糠醛的測(cè)定低限能達(dá)到1.0 m g/ kg，滿足國(guó)內(nèi)外相關(guān)限量要求，可作為葡萄干中5-羥甲基糠醛的檢測(cè)依據(jù)。