周柳青，劉勇強，張小兵

（1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，甘肅蘭州730000；2.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)研究所，甘肅蘭州730000）

建立符合人類診斷標(biāo)準(zhǔn)的變應(yīng)性鼻炎大鼠模型初探*

周柳青1，劉勇強2，張小兵1

（1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，甘肅蘭州730000；2.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)研究所，甘肅蘭州730000）

建立符合人類診斷標(biāo)準(zhǔn)的變應(yīng)性鼻炎大鼠模型。取6-8周齡的Wistar大鼠27只，雌雄各半，隨機分為模型組（n=12）和對照組（n=12），另有3只空白大鼠用于被動皮膚過敏試驗（PCA）。模型組以卵清蛋白（OVA）作為變應(yīng)原輔以氫氧化鋁佐劑進(jìn)行腹腔注射，完成基礎(chǔ)致敏；之后用2%OVA生理鹽水進(jìn)行鼻內(nèi)激發(fā)。對照組以生理鹽水替代OVA。模型組基礎(chǔ)致敏階段完成后，PCA（+），證明IgE產(chǎn)生；鼻內(nèi)激發(fā)階段完成后，各大鼠行為學(xué)評分均>5分，出現(xiàn)噴嚏、鼻癢、流清涕等典型癥狀，鼻粘膜病理切片HE染色示嗜酸性粒細(xì)胞浸潤。對照組無上述變化。本實驗成功建立了符合人類診斷標(biāo)準(zhǔn)的可重復(fù)的變應(yīng)性鼻炎大鼠模型。

耳鼻咽喉頭頸外科；變應(yīng)性鼻炎；大鼠模型；IgE；嗜酸性粒細(xì)胞

近年來變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）患病率直線上升，全球患者超過5億，圍繞其預(yù)防、診療所開展的科學(xué)研究成為熱點[1]。AR是一種發(fā)生在鼻粘膜的I型變態(tài)反應(yīng)疾病，其診斷要點為發(fā)作時典型的臨床癥狀、IgE抗體陽性和鼻粘膜嗜酸性粒細(xì)胞浸潤[2]。此次，我們設(shè)計并建立了符合以上診斷標(biāo)準(zhǔn)的AR大鼠模型，通過行為學(xué)再現(xiàn)了AR發(fā)作時的典型臨床癥狀[3]，使用PCA試驗說明了IgE抗體陽性[4]，通過鼻粘膜病理切片HE染色展示了嗜酸性粒細(xì)胞浸潤[5]。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

1.1.1 實驗動物及分組

6～8周齡Wistar大鼠 （蘭州大學(xué)實驗動物中心提供），共27只，雌雄各半，體重180～220g，SPF級。在清潔空調(diào)動物房飼養(yǎng)，避免常見過敏原存在，早晚12h間斷照明。隨機分為兩組，每組12只。第1組為模型組；第2組為對照組。另有3只空白大鼠用于被動皮膚過敏試驗 （passive cutaneous anaphylaxis reaction,PCA）。

1.1.2 藥品與試劑

卵白蛋白（ovalbumin，OVA，美國Sigma公司，V級）。氫氧化鋁佐劑制備：AlCl3+3NaOH=Al(OH)3↓+ 3NaCl。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過反復(fù)混勻、抽吸和洗滌后得到新鮮配制的膠態(tài)氫氧化鋁[6]。

1.2 造模方法

1.2.1 基礎(chǔ)致敏

模型組：0.3mgOVA+1mlAl(OH)3佐劑，腹腔注射，隔日1次，共7次。對照組：1mL生理鹽水+ 1mLAl(OH)3佐劑，腹腔注射，隔日1次，共7次。

1.2.2 鼻內(nèi)激發(fā)

基礎(chǔ)致敏階段末次腹腔注射結(jié)束后隔日開始鼻內(nèi)激發(fā)階段。模型組：每日每側(cè)鼻腔滴入2%OVA生理鹽水20ul，連續(xù)10d。對照組：每日每側(cè)鼻腔滴入生理鹽水20ul，連續(xù)10d。

1.3 模型評價項目

1.3.1 行為學(xué)觀察

激發(fā)后即刻至30min內(nèi)，用數(shù)碼攝像對大鼠行為進(jìn)行記錄，觀察動物撓鼻、噴嚏、流涕癥狀。評分標(biāo)準(zhǔn)見表1[3，7]。

表1 變應(yīng)性鼻炎大鼠

1.3.2 PCA反應(yīng)

血清制備：基礎(chǔ)致敏完成后，自模型組和對照組中隨機各取3只大鼠，脫毛開胸心臟采血約5mL。血液樣本于4℃保存2～4h，隨后離心（3000 rpm，4℃）以獲得血清。

另取空白大鼠3只，麻醉后脫毛，背部皮下分4個區(qū)域，每個區(qū)域1個注射點，每點間隔大于2cm。將所制備的各組血清原液，分別皮內(nèi)注射于相應(yīng)空白大鼠背部皮膚，0.1mL/點。7h后尾靜脈注射含有相同致敏劑量的抗原和伊文思藍(lán)（Evans Blue，北京索萊寶科技有限公司）等量混合液，共1mL。30min后處死大鼠，剝離背部皮膚，測量藍(lán)斑直徑，直徑大于5mm者判斷為陽性[8]。

1.3.3 組織病理學(xué)評價

鼻標(biāo)本提取：末次激發(fā)1h后，各組大鼠以10%水合氯醛300mg/kg行腹腔注射。麻醉后取鼻中隔粘膜固定于10%中性甲醛溶液中，石蠟包埋，制成4um厚切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟入水后做HE染色，用以觀察鼻粘膜的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤等組織病理學(xué)改變。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

計數(shù)結(jié)果以 “均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用單因素方差分析進(jìn)行組件比較，采用q檢驗進(jìn)行兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)評分

每次鼻內(nèi)激發(fā)后，模型組動物均出現(xiàn)頻繁撓鼻、噴嚏及流水樣涕，每只的疊加量化評分都大于5分，平均評分為（7.6±0.7）。對照組大鼠激發(fā)后，偶有撓鼻，無其他上述癥狀，疊加量化評分為（1.9±1.3）。兩組的行為學(xué)評分比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。

2.2 PCA反應(yīng)

模型組PCA反應(yīng)（+），對照組PCA反應(yīng)（-）

2.3 HE染色

模型組中除去PCA試驗已用去的3只大鼠，剩余9只中有3只可見鼻粘膜嗜酸性粒細(xì)胞增多，杯狀細(xì)胞增多，部分粘膜上皮脫落（如圖1所示）。對照組鼻粘膜均未見嗜酸性粒細(xì)胞及杯狀細(xì)胞增多，粘膜上皮排列整齊。

圖1 鼻粘膜HE染色（40×）模型組鼻粘膜大量嗜酸性粒細(xì)胞增多，杯狀細(xì)胞增多,部分粘膜上皮脫落

3 討論

目前國內(nèi)外復(fù)制、評價AR動物模型尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[9]。Wistar大鼠是常見的模型動物，通常以O(shè)VA作為變應(yīng)原致敏，所建的AR模型常以行為學(xué)評分作為評價標(biāo)準(zhǔn)，不夠客觀[10，11]。因此嘗試建立了此模型，并用人類的AR診斷標(biāo)準(zhǔn)對其進(jìn)行了初步評價。

AR是機體暴露于變應(yīng)原后主要由IgE介導(dǎo)的鼻粘膜非感染性慢性炎性疾病，其確診需要檢測針對變應(yīng)原（與病人病史有關(guān)的）的IgE反應(yīng)或檢測血清中的 IgE，臨床常用的方法有皮膚針刺試驗(skinpricktest，SPT)[12]。本試驗采用PCA反應(yīng)作為檢測IgE的手段，其原理與SPT相同，都是利用抗原與注射部位的肥大細(xì)胞上的抗體起反應(yīng)，導(dǎo)致組胺釋放而出現(xiàn)局部過敏反應(yīng)。因此可準(zhǔn)確的判斷出I型變態(tài)反應(yīng)的標(biāo)志IgE的產(chǎn)生。

嗜酸性粒細(xì)胞升高是人類AR診斷的重要客觀指標(biāo)[13-14]常使用無創(chuàng)的鼻分泌物涂片為手段，在高倍顯微鏡下觀察嗜酸性粒細(xì)胞比例>5%作為診斷標(biāo)準(zhǔn)。由于大鼠鼻腔容積小，提取鼻分泌物較困難，因此我們選用經(jīng)典的病理學(xué)診斷方法——鼻粘膜病理切片HE染色，來評價鼻粘膜嗜酸性粒細(xì)胞的變化。經(jīng)過與對照組比較，清晰的觀察到模型組鼻粘膜嗜酸性粒細(xì)胞增多，從而作出AR的診斷，這也是臨床上最為可靠、常用的診斷方法。

參閱以往關(guān)于建立變應(yīng)性鼻炎動物模型的文獻(xiàn)，此次研究以人類變應(yīng)性鼻炎診斷標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，在Wistar大鼠上再現(xiàn)了變應(yīng)性鼻炎發(fā)作時的臨床癥狀及診斷指標(biāo)--IgE和嗜酸性粒細(xì)胞增高，且所選用的評價手段簡便易行、成本低廉、可操作性及特異性好，但成模率仍有待提高。

[1] Bousquet J,Schunemann HJ,Samolinski B,et al.Allergic rhinitis and its impact on asthma(ARIA):Achievements in 10 years and future needs[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology,2012,130(5): 1049-1062.

[2] Greiner AN,Hellings PW,Rotiroti G,et al.Allergic rhinitis [J].Lancet,2011,378(9809):2112-2122.

[3] 趙秀杰,董震,楊占泉.鼻超敏反應(yīng)實驗?zāi)Ｐ偷慕J].中華耳鼻咽喉科雜志,1993,28(1):17-18.

[4] 馬毅,桂巖,王有虎,等.18β-甘草次酸對變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻粘膜上皮細(xì)胞緊密連接的影響[J].2014,28(20):1590-1594.

[5] Mota I.The mechanism of anaphylaxis.I.production and biological properties of' mast cell sensitizing' antibody[J].Immunology,1964,7:681-699.

[6] Skoner DR.Allergic rhinitis:Definition,epidemiology,detection,and pathophysiology,diagnosis[J].J Allergy ClinImmunol, 2001,108(1):S2-S8.

[7] 趙宇,C.AndrewvanHasselt,吳港生,etal.卵白蛋白經(jīng)鼻致敏建立變應(yīng)性鼻炎動物模型[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志, 2005,40(3):175-180.

[8] Mota I.Passive cutaneous anaphylaxis induced with mast cell sensitizing antibody.The role of histamine and 5-hydrox ytryptamine[J].Life Sciences,1963,2(12):917-927.

[9] 李萌,魏肖云,戴啟剛,等.變應(yīng)性鼻炎動物模型的研究現(xiàn)狀[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2013,22(12):1360-1363.

[10]李欽,李玉芬,陳彥林,等.白細(xì)胞介素5和13受體對變應(yīng)性鼻炎大鼠血管細(xì)胞黏附分子1及干擾素的影響[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2012,47(8):638-641.

[11] 江英,席克虎,陳小婉,等.18β-甘草次酸對變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜纖毛超微結(jié)構(gòu)的影響[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2015,36 (1):26-33.

[12] 中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志編輯委員會鼻科組,中華醫(yī)學(xué)會耳鼻咽喉頭頸外科分會鼻科學(xué)組.變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南（2015年，天津）[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志, 2016,51(1):6-19.

[13]Naclerio,Robert M.Allergic Rhinitis[J].New England Journal of Medicine325(12):860-869.

[14]Stone K D,Prussin C,Metcalfe DD(2010)IgE,mastcells,basophils, andeosinophils.JAllergyClinImmunol125(2):S73-S80.doi:10. 1016/j.jaci.2009.11.017.

R246.81

國家自然科學(xué)基金資助項目（81160449）。