章 激（湖北文理學院附屬醫(yī)院，湖北襄陽 441021）

HPLC法測定妥舒沙星環(huán)合物中的有關物質(zhì)

章 激＊（湖北文理學院附屬醫(yī)院，湖北襄陽 441021）

目的：建立測定妥舒沙星環(huán)合物中有關物質(zhì)的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為YMC-Pack ODS A-312，流動相為乙腈-水（5∶3，V/V），流速為1.2 ml/min，檢測波長為250 nm，柱溫為25℃，進樣量為10μl。結(jié)果：該色譜條件能將妥舒沙星環(huán)合物中主成分與有關物質(zhì)基線分離；妥舒沙星環(huán)合物檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.04～1.8 μg/ml（r＝0.999 9）；妥舒沙星環(huán)合物定量限為40.56 ng/ml，檢測限為6.3 ng/ml；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD＜3%；回收率為99.88%～100.68%（RSD＝0.29%，n＝9）；6批樣品總雜質(zhì)含量測定結(jié)果均＜0.1%。結(jié)論：該方法專屬性強，靈敏度、準確度和精密度高，可用于妥舒沙星環(huán)合物中有關物質(zhì)的測定。

妥舒沙星環(huán)合物；高效液相色譜法；有關物質(zhì)

妥舒沙星（Tosufloxacin）是日本富山化學工業(yè)公司于1990年開發(fā)上市的第三代廣譜氟喹諾酮類抗菌藥物，具有抗菌譜廣、抗菌活性強的特點，對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、厭氧菌的抗菌活性明顯強于環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星等同類藥物[1]。目前，妥舒沙星片劑已在國內(nèi)上市并廣泛應用于臨床治療中。國內(nèi)文獻[2-6]相繼報道了甲苯磺酸妥舒沙星分散片、包合物、凝膠、滴眼液、滴耳液的制備及質(zhì)量控制方法。

妥舒沙星環(huán)合物為妥舒沙星合成過程中的重要中間體，其質(zhì)量控制情況將直接影響原料藥的生產(chǎn)合格率，因此建立其中有關物質(zhì)的測定方法顯得尤為重要。國內(nèi)一些文獻[7-10]曾報道了妥舒沙星制劑含量或用藥后血液中藥物濃度測定的方法，卻鮮有關于其中間體妥舒沙星環(huán)合物中有關物質(zhì)測定的報道。因此，本試驗采用高效液相色譜法（HPLC），初步建立了測定妥舒沙星環(huán)合物中有關物質(zhì)的方法，為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A型HPLC儀，包括SPD-20A可變波長紫外檢測器、LCsolution色譜工作站等（日本島津公司）；Secura225D-1CN型電子天平（德國賽多利斯公司）；DHG-9240A型數(shù)顯真空干燥箱（上海和呈儀器制造有限公司）；YP-250SDP型綜合藥品穩(wěn)定性試驗箱（上海林頻儀器股份有限公司）。

1.2 藥品與試劑

妥舒沙星環(huán)合物樣品（批號：S-140702、140601、140602、140603、140604、140605、140606）、妥舒沙星環(huán)合物對照品（批號：R-140701，純度：97.1%）均為湖北某研究所藥物化學研究室提供，使用前干燥至恒質(zhì)量；乙腈（色譜純，美國Honey Well公司）；試驗用水為高純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：YMC-Pack ODS A-312（150 mm×6.0 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（5∶3，V/V）；流速：1.2 ml/min；檢測波長：250 nm；柱溫：25℃；進樣量：10μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 空白溶液 以流動相為空白溶液。

2.2.2 對照品溶液 精密稱取妥舒沙星環(huán)合物對照品約50 mg，置于50 ml量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液 精密稱取樣品約50 mg，置于50 ml量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.4 對照溶液 精密量取“2.2.3”項下供試品溶液1 ml，用流動相定容于100 ml量瓶中，搖勻，作為對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性與專屬性試驗

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗 取“2.2”項下空白溶液、對照品溶液、供試品溶液各適量，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。在該色譜條件下，妥舒沙星環(huán)合物與有關物質(zhì)能基線分離，主成分峰與相鄰成分峰的分離度＞1.5，理論板數(shù)以主成分峰計＞3 500。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗高效液相色譜圖A.空白；B.對照品；C.供試品；1.妥舒沙星環(huán)合物Fig 1 HPLC chromatograms of system suitability testA.blank；B.reference substance；C.test sample；1.tosufloxacin cyclizaton

2.3.2 專屬性試驗 精密稱取樣品（批號：S-140702）約50 mg，共3份，分別置于50 ml量瓶中，其中一份加入1 mol/L鹽酸溶液1 ml，室溫放置1 h后加入1 mol/L氫氧化鈉溶液1 ml中和；一份加入1 mol/L氫氧化鈉溶液1 ml，室溫放置1 h后加入1 mol/L鹽酸溶液1 ml中和；一份加入30%過氧化氫溶液1 ml，室溫放置1 h。以上3份經(jīng)處理后的樣品分別用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，待用。另取樣品適量，共2份，分別置于扁型稱量瓶中，一份于60℃的恒溫箱中放置15 d；一份于光照強度（4 500±500）lx的穩(wěn)定性試驗箱內(nèi)放置15 d。精密稱取上述2份經(jīng)處理后的樣品各50 mg，分別置于50 ml量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，待用。分別取上述5份破壞試驗溶液各適量，以0.45 μm微孔濾膜濾過后，分別取續(xù)濾液10μl，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖2。結(jié)果，樣品經(jīng)酸、堿、氧化、高溫、光照破壞試驗后，主成分峰均能與降解峰、雜質(zhì)峰有效分離，分離度＞1.5。

圖2 專屬性試驗高效液相色譜圖A.酸破壞樣品；B.堿破壞樣品；C.氧化破壞樣品；D.高溫破壞樣品；E.光破壞樣品；1.妥舒沙星環(huán)合物Fig 2 HPLC chromatograms of specificity testA.sample destroyed by acid；B.sample destroyed by alkali；C.sample destroyed by oxidation；D.sample destroyed by heat；E.sample destroyed by light；1.tosufloxacin cyclizaton

2.4 線性關系考察

分別精密量取“2.2.2”項下對照品溶液0.4、1.0 ml，置于100 ml量瓶中，0.3、0.7、1.0、1.5、1.8 ml置于10 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，制得系列線性工作貯備液。分別精密量取上述系列線性工作貯備液各1 ml，置于100 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，制得系列線性工作溶液，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以妥舒沙星環(huán)合物質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程y＝36.012x+994.56（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，妥舒沙星環(huán)合物檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.04～1.8 μg/ml。

2.5 定量限與檢測限考察

精密量取“2.2.2”項下對照品溶液適量，分別用流動相進行逐級稀釋，并按“2.1”項下色譜條件進樣測定，其測試范圍至少為半峰寬的5倍。當信噪比為10∶1時，測得的質(zhì)量濃度為定量限；當信噪比為3∶1時，測得的質(zhì)量濃度為檢測限。結(jié)果，妥舒沙星環(huán)合物定量限為40.56 ng/ml，檢測限為6.3 ng/ml。

2.6 精密度試驗

取“2.2.2”項下對照品溶液適量，分別按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，妥舒沙星環(huán)合物峰面積的RSD＝0.67%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.3”項下供試品溶液（批號：S-140702）適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、16、20、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，總雜質(zhì)峰面積的RSD≤2.87%（24 h時RSD＝2.87%，n＝7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗

精密稱取樣品（批號：S-140702）約50 mg，共6份，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.2.4”項下方法制備對照溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以自身對照法測定總雜質(zhì)的含量。結(jié)果，總雜質(zhì)含量的RSD＝2.56%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 回收率試驗

精密稱取妥舒沙星環(huán)合物對照品約40、50、60 mg，各3份，分別按“2.2.3”項下方法制得80%、100%、120%限度濃度的供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以外標法計算主成分含量并計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 1 Result of recovery test（n＝9）

2.10 樣品中有關物質(zhì)測定

分別稱取6批（除S-140702外）樣品約50 mg，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.2.4”項下方法制備對照溶液。分別取上述供試品溶液和對照溶液各10μl，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以自身對照法測定其中總雜質(zhì)及最大單個雜質(zhì)的含量，結(jié)果見表2。由表2可見，最大單個雜質(zhì)含量＜0.05%，總雜質(zhì)含量＜0.1%，符合質(zhì)控標準要求。

3 討論

本試驗通過對檢測波長進行考察，發(fā)現(xiàn)采用250 nm為檢測波長時，能有效檢出供試品溶液中的有關物質(zhì)，結(jié)果準確、可靠，信噪比符合要求。故最終選定了該檢測波長。

表2 樣品中有關物質(zhì)測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of determination of related substances in samples（n＝3）

本試驗前期曾比較了不同體積比（2∶1、2∶3、5∶3，V/V）的乙腈-水為流動相時的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈-水體積比為2∶1時，主峰出峰時間過快（約5 min出峰），與雜質(zhì)峰不能有效分離（分離度＜1.5），專屬性不佳；體積比為2∶3時，主峰出峰時間較慢，理論板數(shù)較低（＜3 000），不符合藥典標準；而當體積比為5∶3時，出峰時間適宜，主峰與雜質(zhì)峰能有效分離（分離度＞1.5），且理論板數(shù)較高（＞3 000）。故最終選定以乙腈-水（5∶3，V/V）為本試驗的流動相。

綜上所述，本方法專屬性強，靈敏度、準確度和精密度高，能有效分離主成分峰與雜質(zhì)峰及酸、堿、氧化、高溫、光照破壞條件下產(chǎn)生的降解峰，可用于妥舒沙星環(huán)合物中有關物質(zhì)的測定。

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（編輯：周 箐）

Determination of Related Substances in Tosufloxacin Cyclizaton by HPLC

ZHANG Ji（Hospital Affiliated to Hubei College of Arts and Sciences，Hubei Xiangyang 441021，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the determination of related substances in tosufloxacin cyclizaton.METHODS：HPLC was performed on the column of YMC-Pack ODS A-312 with mobile phase of acetonitrile-water（5∶3，V/V）at a flow rate 1.2 ml/min，detection wavelength was 250 nm，column temperature was 25℃ and injection volume was 10μl.RESULTS：The main component and related substances could be baseline separated by the conditions；the linear range was 0.04-1.8 μg/ml（r＝0.999 9）；the limit of quantification was 40.56 ng/ml and the limit of detection was 6.3 ng/ml；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 3%；recovery was 99.88%-100.68%（RSD＝0.29%，n＝9）；the result of total impurities of 6 batches of sample were less than 0.1%.CONCLUSIONS：The method is specific，sensitivity with high accuracy and precision，and can be used for the determination of related substances in tosufloxacin cyclizaton.

Tosufloxacin cyclizaton；HPLC；Related substance

R927

A

1001-0408（2016）33-4730-03

2016-07-06

2016-09-27）

＊副主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學及臨床藥學。E-mail：xfhost@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.33.41