李志得，張彩云，汪 霞（鄂州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖北鄂州 436099）

HPLC-ELSD法測(cè)定琥乙紅霉素片中琥乙紅霉素的含量

李志得＊，張彩云，汪 霞（鄂州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖北鄂州 436099）

目的：建立高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法測(cè)定琥乙紅霉素片中琥乙紅霉素含量的方法。方法：色譜柱為Dikma-C18，流動(dòng)相為乙腈-0.05%二乙胺（70∶30，V/V），流速為1.0 ml/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μl。結(jié)果：琥乙紅霉素檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍為1.216～7.296 μg（r＝0.999 2）；定量限為0.304 μg，檢測(cè)限為0.076 μg；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率為97.59%～104.19%（RSD＝1.71%，n＝6）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于測(cè)定琥乙紅霉素片中琥乙紅霉素的含量。

琥乙紅霉素片；高效液相色譜法；琥乙紅霉素；含量測(cè)定

琥乙紅霉素屬大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物，為紅霉素的琥珀酸乙酯，具有廣譜抗菌作用。2015年版《中國(guó)藥典》（二部）采用水解琥乙紅霉素后，用微生物檢定法測(cè)定其含量[1]，此試驗(yàn)過程復(fù)雜、操作煩瑣、影響因素多、重復(fù)性較差[2]。目前，現(xiàn)有文獻(xiàn)多采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定琥乙紅霉素的含量[3-6]，均采用紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm左右；而琥乙紅霉素僅在紫外末端有吸收，因此此試驗(yàn)靈敏度低。為盡量減小紫外末端吸收引起的基線干擾，筆者采用HPLC-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）法，建立了測(cè)定琥乙紅霉素片中琥乙紅霉素含量的方法，以期為控制該制劑的質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2695型HPLC儀，包括2424蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、e2695泵、Empower 2色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；KQ-3000型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：300 W，頻率：40 kHz）；BS21S型十萬分之一電子天平（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

琥乙紅霉素片（西安利君制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：1402052、1311474、1403016，規(guī)格：0.125 g/片）；琥乙紅霉素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130425-200002，純度＞98%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Dikma-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.05%二乙胺（70∶30，V/V）；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μl。.

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取琥乙紅霉素對(duì)照品0.030 40 g，置于25 ml量瓶中，加乙腈溶解并定容，制成每1 ml含琥乙紅霉素1.216 mg的溶液，作為對(duì)照品貯備液。精密量取上述對(duì)照品貯備液4.0 ml，置于10 ml量瓶中，加乙腈溶解并定容，制成每1 ml含琥乙紅霉素0.486 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品10片，精密稱定，研細(xì)，混勻，精密稱取適量（約相當(dāng)于琥乙紅霉素35 mg），置于100 ml量瓶中，加乙腈溶解，超聲處理10 min，放冷，加乙腈定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按樣品的處方工藝和配方比例，取不含琥乙紅霉素的輔料制備陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，琥乙紅霉素與其他雜質(zhì)峰均能達(dá)到基線分離，分離度＞2.0；理論板數(shù)以琥乙紅霉素峰計(jì)＞5 000，保留時(shí)間為10 min。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.琥乙紅霉素Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；C.negative control；1.erythromycin ethylsuccinate

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml，分別置于10 ml量瓶中，加乙腈定容，搖勻，即得系列對(duì)照品溶液。分別精密量取上述系列對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以琥乙紅霉素進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)（x）、峰面積的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得琥乙紅霉素對(duì)數(shù)值的回歸方程為y＝1.100 5x+6.606 1（r＝0.999 2）。結(jié)果表明，琥乙紅霉素峰面積的對(duì)數(shù)值與進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)值線性關(guān)系良好，琥乙紅霉素檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍為1.216～7.296 μg。

2.5 定量限與檢測(cè)限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測(cè)限。結(jié)果，琥乙紅霉素的定量限為0.304 μg，檢測(cè)限為0.076 μg。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，琥乙紅霉素峰面積的RSD＝0.92%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取同一供試品溶液（批號(hào)：1402052）適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、18、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，琥乙紅霉素峰面積的RSD＝1.08%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)：1402052）適量，精密稱定，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，琥乙紅霉素的平均含量為98.4%，RSD＝0.84%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號(hào)：1402052）6份，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于琥乙紅霉素9 mg），分別精密加入琥乙紅霉素對(duì)照品9 mg，置于50 ml量瓶中，加乙腈適量，超聲處理10 min，放冷，加乙腈定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.10 樣品含量測(cè)定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按兩點(diǎn)外標(biāo)法計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，%）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3，%）

3 討論

3.1 檢測(cè)方法的選擇

目前，琥乙紅霉素的測(cè)定方法主要有生物檢定法[1]、HPLC法[3-6]，紫外分光光度法[7-10]、電化學(xué)法[11-12]等。亦有用HPLC法測(cè)定琥乙紅霉素中游離紅霉素[13]、HPLC-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定琥乙紅霉素顆粒體內(nèi)活性代謝物的報(bào)道[14]，但上述方法靈敏度低。因此，筆者采用ELSD，可提高檢測(cè)的靈敏度。

3.2 溶劑和流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)中曾用流動(dòng)相作為溶劑溶解對(duì)照品和樣品，但穩(wěn)定性較差。筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[4]經(jīng)過多次試驗(yàn)比較，發(fā)現(xiàn)采用乙腈作為溶劑溶解樣品，在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。故本試驗(yàn)選擇乙腈作為溶劑。關(guān)于流動(dòng)相的選擇，筆者曾用乙腈-水、乙腈-乙酸銨緩沖液等作為流動(dòng)相，結(jié)果色譜不出峰或峰形極差，改用乙腈-0.05%二乙胺（70∶30，V/V）后，色譜峰形理想，保留時(shí)間合適，理論板數(shù)按琥乙紅霉素峰計(jì)達(dá)到5 000以上。因此，本試驗(yàn)最終選擇乙腈-0.05%二乙胺（70∶30，V/V）作為流動(dòng)相。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于測(cè)定琥乙紅霉素片中琥乙紅霉素的含量。

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（編輯：劉 柳）

Content Determination of Erythromycin Ethylsuccinate in Erythromycin Ethylsuccinate Tablet by HPLCELSD

LI Zhide，ZHANG Caiyun，WANG Xia（Ezhou Center for Food and Drug Control，Hubei Ezhou 436099，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the content determination of erythromycin ethylsuccinate in Erythromycin ethylsuccinate tablet.METHODS：The column of Dikma-C18with mobile phase of acetonitrile-0.05%diethylamine（70∶30，V/V）at a flow rate of 1.0 ml/min，column temperature was 30℃，and the sample size was 10 μl.RESULTS：The linear range of erythromycin ethylsuccinate was 1.216-7.296 μg（r＝0.999 2）；limit of quantitation was 0.304 μg，the limits of detection was 0.076 μg，respectively；the RSDs of precision，stability and reproducibility tests were no more than 2.0%，the average recoveries was 97.59%-104.19%（RSD＝1.71%，n＝6）.CONCLUSIONS：The method is simple and accurate with high sensitivity and reproducibility，and can be used for the content determination of Erythromycin ethylsuccinate tablet.

Erythromycin ethylsuccinate tablet；HPLC；Erythromylin ethyisuccinate；Content determination

R917

A

1001-0408（2016）33-4744-03

2015-11-30

2016-05-16）

＊副主任技師。研究方向：抗菌藥物及中藥檢驗(yàn)。電話：0711-3863027。E-mail：Lzd-5@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.33.46