詹建東,邱前輝,張水興,陳少華,蘇小妹廣東省人民醫(yī)院//廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院耳鼻喉頭頸外科,放射科,廣東 廣州 50080
基礎(chǔ)研究
小干擾RNA沉默HIF-1α基因表達對對人鼻咽癌細胞系CNE1凋亡的影響
詹建東1,邱前輝1,張水興2,陳少華1,蘇小妹1
廣東省人民醫(yī)院//廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院1耳鼻喉頭頸外科,2放射科,廣東 廣州 510080
目的 探討CNE1對人鼻咽癌細胞系CNE1凋亡的影響。方法 利用陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染入CNE13細胞中。WB法測定CNE1細胞內(nèi)HIF-1α的表達。流式細胞儀及Hochest熒光染色測定細胞凋亡率的變化。WB法測定CNE1細胞內(nèi)BCL-2的表達。結(jié)果 干擾HIF-1α能有效地促進CNE1細胞的凋亡,同時可下調(diào)BCL-2的表達。結(jié)論體外實驗初步證明HIF-1α基因在人鼻咽癌細胞系CNE1凋亡方面扮演重要角色,可通過下調(diào)BCL-2的表達來誘導(dǎo)凋亡。
HIF-1α;凋亡;CNE1
實體腫瘤增大到約1~2 mm3時,內(nèi)部會出現(xiàn)乏氧的微環(huán)境,此時惡性腫瘤細胞將產(chǎn)生一系列生物學(xué)行為的變化來適應(yīng)低氧狀態(tài)。缺氧誘導(dǎo)因子-lα(HIF-1α)通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞能量代謝、凋亡、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移等使腫瘤細胞適應(yīng)缺氧微環(huán)境,促使腫瘤進展[1-2]。HIF-lα在這些過程中起著中心介導(dǎo)作用,在多種腫瘤細胞中降低HIF-lα的表達可能有抗腫瘤的作用[3-8]。已有研究表明,HIF-lα在鼻咽癌組織中高表達,并與鼻咽癌的病理特征和腫瘤血管生成密切相關(guān)[9]。而HIF-lα與鼻咽癌增殖凋亡有無關(guān)系尚未有文獻報道。本研究通過小干擾RNA(siRNA)沉默人鼻咽癌細胞系CNE1的HIF-lα基因,檢測細胞凋亡的變化及凋亡相關(guān)蛋白表達情況,觀察沉默HIF-lα基因?qū)θ吮茄拾┘毎礐NE1細胞生物學(xué)行為的影響。
1.1細胞培養(yǎng)
人類鼻咽癌細胞系CNE1(采購于美國標準生物品收藏中心),胎牛血清(采購于杭州四季清公司),DMEM培養(yǎng)基(采購于美國Gibco)。
1.2主要試劑
CCK8試劑盒(采購于碧云天生物技術(shù)公),雙染熒光標記凋亡檢測試劑盒(采購于羅氏公司),碘化丙啶與膜聯(lián)蛋白-V(Annexin V-PI)。
1.3實驗方法
1.3.1RNA的干擾 HIF-1αsiRNA與陰性對照siRNA通過上海吉瑪公司設(shè)計與合成,篩選出的有效HIF-lα-siRNA靶向HIF-lαmRNA的位點為792-812,正義鏈為5'-GUGAUGAAAGAAUUACCGAAUTT-3',NC-siRNA片段正義鏈序列為5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3'。Opti-MEM從美國Gibco購買,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒從廣州英偉創(chuàng)津有限公司購買。轉(zhuǎn)染前的24 h人鼻咽癌細胞CNE1按1×105/孔接種到培養(yǎng)板內(nèi),37℃培養(yǎng)過1夜。具體轉(zhuǎn)染操作步驟按轉(zhuǎn)染的操作手冊進行,轉(zhuǎn)染6 h以后將更換低血清(0.5%)DMEM培養(yǎng)液進一步培養(yǎng),轉(zhuǎn)染后48 h消化濃集細胞。
1.3.2WesternBlot測試HIF-1α蛋白質(zhì)的表達 收集空白對照組、陰性對照組與轉(zhuǎn)染HIF-lα-siRNA 48 h的CNE1細胞1×105,用PBS液清洗2遍,將溶解于裂解緩沖液,Triton-X-100 0.5 mL,NaCL 0.438 g,pH8.0的HCL 2.5 mL,1 mol/LTris,加蒸餾水到50 mL。使用時,將0.87 mL裂解液加入1.74/LPMSF50 μL,提取總蛋白質(zhì)。BCA法測定各種樣品種總蛋白質(zhì)的濃度,并調(diào)節(jié)至濃度一致。樣品加10%SDS-PAGE(濃縮膠80V;分離膠120 V)大約2.5 h,恒流200 mA 2 h轉(zhuǎn)印在PVDF膜。封閉液(pH 7.6,0.05%Tween 20,5%脫脂奶粉)室溫封閉2 h后,于一抗(稀釋比例1:500)孵育4℃過夜。二抗體(稀釋比例1:2000)孵育2 h。用TBS洗滌3次,通過超敏發(fā)光液顯光,經(jīng)X感光片感光并顯影定影。內(nèi)參蛋白為GAPDH。
1.3.3AnnexinV-PI雙染流式細胞儀檢測凋亡細胞收集轉(zhuǎn)染后48 h的細胞,PBS清洗以后,用預(yù)冷75%乙醇固定過夜,離心去除上清,PBS清洗以后加Rnase溶液,放置室溫避光保存,加入0.06 L的PI,置室溫避光30 min,用流式細胞儀測定細胞凋亡率。
1.3.4Hochest熒光染色將對數(shù)生長期細胞接種在6孔板,藥物作用48 h用PBS洗滌3次,5 min/次,加入多聚甲醛溶液室溫固定30 min,用PBS洗滌3次,5 min/次,加入hochest33342溶液,在37℃下孵育15 min,使用激光共聚焦顯微鏡觀察并攝像,正常的細胞核會呈現(xiàn)出彌散均勻的淡藍色熒光,凋亡的細胞核則會呈現(xiàn)致密濃染的強藍色熒光。
1.4統(tǒng)計學(xué)方法
結(jié)果用均數(shù)±標準差表述,采用獨立樣本t檢驗比較兩組間的差別。由SPSS l3.0軟件進行統(tǒng)計分析,顯著性水平是P<0.05。
2.1轉(zhuǎn)染后HIF-1α基因蛋白表達情況
使用HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染CNE1細胞在24 h時HIF-1α基因蛋白未受到顯著影響,48、72 h后表達量明顯降低。HIF-1αsiRNA組表現(xiàn)明顯時間依賴性,隨著觀察時間的延長,后一個觀察時間點都較前一個觀察時間點細胞中HIF-1α表達量出現(xiàn)明顯下降。
2.2流式細胞術(shù)檢測CNE1細胞的凋亡
研究干擾HIF-1α對細胞凋亡的影響,使用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。經(jīng)獨立樣本t檢驗分析的結(jié)果表明,通過血清饑餓48 h,干擾組的凋亡率為38.8%;血清血清饑餓72 h,凋亡率為60.1%。相應(yīng)對照組分別為5.6%、10.2%(P<0.05)。這些數(shù)據(jù)提示干擾HIF-1α將使CNE1細胞對血清饑餓誘導(dǎo)凋亡變得更加敏感。
2.3活細胞染色結(jié)果
使用Hochest 33258熒光染料對活細胞染色,通過波長365 nm的熒光顯微鏡進行觀察,發(fā)現(xiàn)對照組細胞核邊界清晰,呈均勻淡藍色的圓形或橢圓形。經(jīng)血清饑餓48 h后都能觀察到細胞具有典型凋亡特征,細胞核邊界清晰,呈亮藍色的半月形、馬蹄形,凋亡細胞染色質(zhì)的邊集、核濃縮或聚集;有的細胞核甚至有3個或以上的熒光碎塊。各組分別隨機計數(shù)200個細胞,轉(zhuǎn)染組凋亡細胞為56.2%,對照組凋亡細胞為12.5%。
2.4轉(zhuǎn)染后HIF-1α基因蛋白對凋亡相關(guān)基因的影響
為進一步研究HIF-1α對CNE1細胞凋亡分子的機制,我們在不同時間段檢測HIF-1α的凋亡相關(guān)蛋白Bcl2的變化情況。結(jié)果顯示干擾HIF-1α后Bcl2表達下降,且呈時間依賴性。
本實驗用經(jīng)證實有效的人工化學(xué)合成的HIF-lα-siRNA轉(zhuǎn)染CEN1細胞可以沉默HIF-lα基因的表達,轉(zhuǎn)染CNE1細胞在48 h,72 h后HIF-lα表達量明顯降低。從而為研究HIF-lα與鼻咽癌的關(guān)系提供了合適的模型。
HIF-1α是1992年由Semenza等最先在缺氧誘導(dǎo)的細胞核抽提物中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子,廣泛存在于哺乳動物和人體內(nèi)[10]。近年來研究在大多數(shù)人類正常組織細胞中未檢測到HIF-1α蛋白的表達,但在許多腫瘤細胞中卻存在,且與預(yù)后密切相關(guān)[11-14]。HIF-1α表達與肺癌T分期、有無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)表達可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[15]。HIF-1α在正常食管黏膜細胞不會表達,而食管鱗癌細胞的陽性表達率為61.7%,且其陽性表達率隨食管癌腫瘤體積呈正相關(guān),隨組織分化程度降低而增高[16]。HIF-1α在鼻咽癌組織中的表達顯著高于鼻咽慢性炎性組織,與T分期、臨床分期和有無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[17]。HIF-lα在細胞凋亡中的調(diào)控作用存在著兩個不同方面的影響:一方面是抗凋亡作用,HIF-lα可增加無氧代謝、糖酵解和一些凋亡前基因的表達,同時還能與人端粒末端逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因相互作用,誘導(dǎo)活化hTERT,增加端粒酶的活性,延長端粒;另一方面是促凋亡作用,HIF-lα能阻斷P53降解與穩(wěn)定P53、上調(diào)Bcl-2家族促凋亡基因BNIP3等途徑。本研究通過沉默鼻咽癌中HIF-lα的表達來檢查細胞凋亡的情況。在本研究中,我們觀察到:干擾組CNE1細胞在轉(zhuǎn)染HIF-lα-siRNA后48、72 h,凋亡率高于對照組,提示沉默HIF-lα基因能誘導(dǎo)CNE1細胞凋亡,發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。
為了進一步研究沉默HIF-lα基因誘導(dǎo)CNE1細胞凋亡的機制。在本研究中,我們觀察到干擾組Bcl-2的表達下降,且呈時間依賴性,干擾48 h后開始顯著下降。有證據(jù)表明BCL-2必須與其它蛋白如Bax形成異二聚體才能發(fā)揮其生理作用。BCL-2還可以和抑癌基因p53相互作用,間接調(diào)控程序性細胞死亡[18]。因此,我們的研究發(fā)現(xiàn),HIF-lα在人鼻咽癌細胞生長過程中起著重要作用。干擾HIF-lα的表達,可通過下調(diào)BCL-2的表達從而誘導(dǎo)細胞凋亡。
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2016-05-15
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