李萍，樊毅，毛汐語(yǔ)，殷玥，趙軍，徐志文，2，朱玲，2

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物生物技術(shù)中心，四川成都611130；2.動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都611130）

豬鏈球菌感染病原的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

李萍1，樊毅1，毛汐語(yǔ)1，殷玥1，趙軍1，徐志文1，2，朱玲1，2

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物生物技術(shù)中心，四川成都611130；2.動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都611130）

2016年3月，四川省南充市某規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)仔豬出現(xiàn)被毛粗亂、眼瞼水腫、關(guān)節(jié)腫大、呼吸困難等癥狀，隨即大量死亡。剖檢可見(jiàn)心包腔積液，肝臟表面有大量白色纖維素性滲出物，并與胸膜、腹膜粘連。使用氟苯尼考、恩諾沙星治療無(wú)效。根據(jù)臨床癥狀、剖檢病理變化及抗生素使用情況可初步判斷主要病原為豬鏈球菌。無(wú)菌采集心包積液、關(guān)節(jié)積液、肺臟及脾臟進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定，并將分離菌株進(jìn)行常規(guī)抗生素藥物敏感性試驗(yàn)以指導(dǎo)豬場(chǎng)科學(xué)用藥，有效控制疫情。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源

無(wú)菌采集疑似感染豬鏈球菌的病豬心包積液、關(guān)節(jié)積液、肺臟及脾臟。

1.2 試驗(yàn)試劑和試驗(yàn)動(dòng)物

主要培養(yǎng)基：胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）等購(gòu)自青島日水生物技術(shù)有限公司，兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基自行配制。

生化試劑微量發(fā)酵管：葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、菊糖、棉籽糖、水楊苷、明膠、吲哚、枸櫞酸鈉等均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

藥敏紙片：氟苯尼考、恩諾沙星、強(qiáng)力霉素、丁胺卡那霉素、四環(huán)素、林可霉素、環(huán)丙氟哌酸、阿莫西林、苯唑西林、氨芐西林、頭孢噻肟及頭孢氨芐共12種藥敏紙片（直徑6 mm），均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

試驗(yàn)動(dòng)物：20 g/只健康小鼠，購(gòu)自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)。

1.3 直接染色鏡檢

取病豬的肺、脾、心包積液及關(guān)節(jié)積液進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。

1.4 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

用燃燒的酒精棉球?qū)⑺蜋z病料進(jìn)行表面消毒，將剪刀和鑷子消毒冷卻后剪取病料病變與健康區(qū)域交界處的深層組織，劃線接種于兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基及TSA培養(yǎng)基，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～36 h。觀察菌落形態(tài)，挑取單個(gè)針尖大小、半透明且邊緣整齊的菌落劃線接種于TSA培養(yǎng)基進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)12～24 h后，置4℃保存，待鑒定。

1.5 細(xì)菌的鑒定

1.5.1 細(xì)菌形態(tài)觀察將上述純培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色，通過(guò)染色鏡檢，對(duì)可疑菌進(jìn)行初步判斷。

1.5.2 生化鑒定挑取純培養(yǎng)物的單個(gè)菌落，分別接種于蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖等生化微量發(fā)酵管中，培養(yǎng)24～48 h后觀察結(jié)果。

1.5.3 核酸檢測(cè)將分離得到的可疑菌用16S rRNA通用引物27F/1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳后將PCR產(chǎn)物送往上海生工公司測(cè)序。將測(cè)得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表菌株序列進(jìn)行比對(duì)，從核酸角度對(duì)病原做出最終診斷，并分析其與不同菌株的同源性。

1.6 生物學(xué)特性測(cè)定

1.6.1 致病性試驗(yàn)將細(xì)菌純培養(yǎng)物挑取單個(gè)菌落接種到TSB肉湯中，37℃恒溫培養(yǎng)8～12 h。取菌液按0.2 mL/只劑量腹腔注射接種5只健康小鼠，接種后正常飼喂，觀察其精神狀態(tài)及死亡狀況。并在小鼠死亡1 h內(nèi)無(wú)菌取其肺及心臟等接種兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基以驗(yàn)證并回收病原菌。另取5只健康小鼠接種等量TSB肉湯作為空白對(duì)照。

1.6.2 藥敏試驗(yàn)采用常規(guī)藥敏紙片法測(cè)定分離菌株對(duì)臨床常用抗生素的敏感性。取上述TSB肉湯純培養(yǎng)產(chǎn)物100 μL，用L形玻璃棒均勻涂布于TSA培養(yǎng)基表面，室溫放置10 min，待菌體固定后，用無(wú)菌鑷子夾取選用的藥敏紙片緊貼于瓊脂表面，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～36 h，測(cè)量抑菌圈的直徑，判斷分離菌株的耐藥性。

2 結(jié)果

2.1 直接染色鏡檢

通過(guò)對(duì)病變組織的革蘭氏染色，可見(jiàn)組織間主要分布有一種革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體呈球形或卵圓形，多成對(duì)存在，部分呈較短的鏈狀排列。

2.2 細(xì)菌的培養(yǎng)特性

挑取單個(gè)菌落劃線接種于TSA培養(yǎng)基及兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基，置于37℃溫箱中培養(yǎng)24～36 h后，TSA培養(yǎng)基上可見(jiàn)菌落呈單個(gè)針尖大小的灰白色半透明菌，兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基上可見(jiàn)與TSA培養(yǎng)基上相似且呈α溶血的菌落。

2.3 純培養(yǎng)物染色鏡檢

將TSA培養(yǎng)基及兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基上的純培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，可見(jiàn)排列成鏈狀的陽(yáng)性球菌（圖1），初步判斷為鏈球菌。

圖1 純培養(yǎng)物染色鏡檢（400倍）

2.4 生化鑒定結(jié)果

挑取TSA培養(yǎng)基及兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基上的純培養(yǎng)物進(jìn)行生化鑒定，結(jié)果如表1。根據(jù)分離菌株的培養(yǎng)特性、染色鏡檢形態(tài)以及生化鑒定結(jié)果可初步判斷為豬鏈球菌。

表1 生化鑒定結(jié)果

2.5 核酸檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)PCR擴(kuò)增成功得到1 500 bp左右的目的條帶（圖2），將測(cè)得序列與NCBI上已發(fā)表序列通過(guò)BLAST比對(duì)可判斷該菌株為豬鏈球菌，該序列與CP003993.1、AB071339.1、AB071340.1、AB071340.1、AF009506.1、HM590020.1、JQ975903.1等同源性均為99%。

2.6 致病性試驗(yàn)

5只健康小鼠在接種后12 h左右即表現(xiàn)精神沉郁、行動(dòng)緩慢、被毛粗亂等癥狀，在接種18 h后開(kāi)始出現(xiàn)死亡，36 h后全部死亡。對(duì)照組小鼠無(wú)異常反應(yīng)。及時(shí)剖檢死亡小鼠可見(jiàn)肝臟、腎臟腫大充血，肺充血。取上述組織無(wú)菌涂布于兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12～24 h后，培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出較均一的菌落，染色鏡檢與鏈球菌相一致，表明該菌株具有較強(qiáng)的致病力。

圖2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.7 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)分離豬鏈球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，該菌對(duì)阿莫西林、氨芐西林、頭孢噻肟及頭孢氨芐敏感，對(duì)其余8種受試抗生素均表現(xiàn)耐藥（表2）。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

豬鏈球菌病是一種重要的人畜共患急性、熱性傳染病，嚴(yán)重威脅著公共衛(wèi)生安全。該病主要表現(xiàn)為急性出血性敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肺炎、淋巴結(jié)化膿、哺乳仔豬下痢和孕豬流產(chǎn)等癥狀，具有較高的發(fā)病率和死亡率，呈世界范圍流行。該病可通過(guò)呼吸道、生殖道和消化道傳播，也可經(jīng)皮膚、黏膜創(chuàng)傷感染，同時(shí)還可經(jīng)母豬分娩傳染給仔豬。傳播方式的多樣性對(duì)飼養(yǎng)管理?xiàng)l件提出了嚴(yán)苛要求。細(xì)菌性疾病往往表現(xiàn)為混合感染，豬鏈球菌感染發(fā)病癥狀與副豬嗜血桿菌具有一定的相似性，均會(huì)表現(xiàn)呼吸困難、關(guān)節(jié)腫脹等臨床癥狀，病理剖檢均可見(jiàn)肺臟、肝臟損傷及心包積液、纖維素性滲出物，且常表現(xiàn)為混合感染；二者在抗生素耐藥譜上具有較大差異，為疫病的治療與防控帶來(lái)困難。因而對(duì)病原的準(zhǔn)確判斷需要進(jìn)行較完善的鑒定分析。

根據(jù)對(duì)病原的分離及進(jìn)一步鑒定可確診該病例為豬鏈球菌感染。且該分離株具有較強(qiáng)的致病性，對(duì)臨床常用抗生素氟苯尼考、恩諾沙星、強(qiáng)力霉素、丁胺卡那霉素、四環(huán)素、林可霉素、環(huán)丙氟哌酸及苯唑西林表現(xiàn)耐藥，而對(duì)多數(shù)β-內(nèi)酰胺類及頭孢類抗生素表現(xiàn)較為敏感。針對(duì)該病的治療，早期常用抗生素包括四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、β-內(nèi)酰胺類及頭孢類等，由于抗生素的長(zhǎng)期使用，四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類及氟喹諾酮類抗生素已經(jīng)出現(xiàn)較嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象[1-3]，給臨床防治該病帶來(lái)了難度。目前常見(jiàn)的細(xì)菌耐藥機(jī)制主要包括：細(xì)菌整合子系統(tǒng)，通過(guò)捕獲外源抗性基因并接合質(zhì)粒使之在細(xì)菌間傳播；產(chǎn)生滅活酶或鈍化酶破壞抗生素結(jié)構(gòu)使之失去作用[4]；降低細(xì)菌外膜通透性，使抗生素不易進(jìn)入靶位點(diǎn)[5]；生物被膜（菌膜）的物理屏障及細(xì)菌群體感應(yīng)作用，前者通過(guò)黏性胞外基質(zhì)抵御抗生素進(jìn)入[6]，后者通過(guò)激活細(xì)菌群體感應(yīng)協(xié)同完成感染[7]；改變抗生素作用靶位點(diǎn)結(jié)構(gòu)，降低細(xì)菌細(xì)胞的親和力；產(chǎn)生能量依賴性主動(dòng)外排蛋白，將進(jìn)入菌體的抗生素泵出體外等。細(xì)菌耐藥機(jī)制復(fù)雜多樣，其進(jìn)化速度遠(yuǎn)快于抗生素的研發(fā)速度，對(duì)于畜禽養(yǎng)殖及醫(yī)療衛(wèi)生的威脅可想而知。因此，在合理使用抗生素的同時(shí)，還需加強(qiáng)各地細(xì)菌耐藥情況的監(jiān)測(cè)，掌握細(xì)菌耐藥情況對(duì)于擬定控制措施具有重要作用。

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（編輯：富春妮）

S858.282.61+1

A

1002-1957(2016)03-0108-03

2016-04-24

四川省科技支撐計(jì)劃（2014NZ0043）

李萍（1990-），女，四川眉山人，在讀碩士研究生，主要從事病原分子生物學(xué)研究.E-mail:lipinga104@163.com

朱玲，教授，博士，主要從事病原分子生物學(xué)研究. E-mail:abtczl@126.com