?夏愛(ài)蓮，金晨鐘,2,3，胡一鴻,2,3，劉 宵，鄒婷婷，王 艷,2,3?

（1.湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，湖南 婁底 417000；

2.湖南省農(nóng)田雜草防控技術(shù)與應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 婁底 417000；3.農(nóng)藥無(wú)害化應(yīng)用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 婁底 417000）

草甘膦脅迫對(duì)馬唐抗氧化酶系及丙二醛含量的影響研究

夏愛(ài)蓮1，金晨鐘1,2,3，胡一鴻1,2,3，劉 宵1，鄒婷婷1，王 艷1,2,3

（1.湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，湖南 婁底 417000；

2.湖南省農(nóng)田雜草防控技術(shù)與應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 婁底 417000；3.農(nóng)藥無(wú)害化應(yīng)用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 婁底 417000）

研究了在不同濃度草甘膦脅迫下，馬唐（Digitaria sanguinalis L.）體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）等3種抗氧化酶活性及其丙二醛（MDA）含量隨時(shí)間的變化情況。結(jié)果表明：馬唐在草甘膦脅迫初期，3種酶活性和MDA含量較對(duì)照值有所提高；草甘膦處理6 d后，各指標(biāo)均達(dá)到最高值；第9天后，各指標(biāo)開(kāi)始下降；至第12天后，450、900和1 800 g/hm2草甘膦處理馬唐的SOD、POD、CAT活性及MDA含量均降至對(duì)照水平。這表明草甘膦對(duì)馬唐的傷害在經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的生長(zhǎng)發(fā)育后可恢復(fù)，說(shuō)明馬唐對(duì)草甘膦較易產(chǎn)生抗藥性。

草甘膦；馬唐；抗氧化酶系統(tǒng)；丙二醛

全球廣泛分布的各種雜草已嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，極大危害了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展?；瘜W(xué)除草劑是防治雜草的主要方法，草甘膦理化性質(zhì)穩(wěn)定，具有低毒、低殘留、高效、廣譜、滅生性等優(yōu)點(diǎn)，是目前全世界除草劑使用量最大的品種之一[1]。但隨著草甘膦用量持續(xù)增加，選擇壓也在增加，抗草甘膦雜草也日益增多，到目前為止已經(jīng)公布了28種雜草對(duì)草甘膦產(chǎn)生抗性[2]，抗草甘膦雜草問(wèn)題日益嚴(yán)重，急需解決。馬唐（Digitaria sanguinalis L.）屬禾本科一年生草本植物，廣布全國(guó)各地，是旱秋作物田地、果園、苗圃的惡性雜草，發(fā)生數(shù)量、分布范圍在旱地雜草中均居首位，以作物生長(zhǎng)的前中期危害為主[3]。近年來(lái)，在中國(guó)南方地區(qū)，許多旱秋作物田地及果園等使用草甘膦頻繁，導(dǎo)致其對(duì)馬唐的防除效果變差，給果園和農(nóng)田管理帶來(lái)極大不便。

據(jù)已有研究表明，雜草對(duì)草甘膦的抗性機(jī)制至少有3種：靶標(biāo)酶5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）的改變、除草劑在植物體內(nèi)的吸收和傳導(dǎo)以及除草劑代謝速率的改變[4-5]。除草劑對(duì)植物產(chǎn)生毒害的過(guò)程中往往會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧等自由基，有研究表明：噴施樂(lè)果可促使菠菜葉片中POD、CAT活性增強(qiáng)以及MDA含量明顯增加[6]；不同時(shí)期草甘膦處理引起了銅綠微囊藻的氧化損傷，加藥組的MDA含量顯著增加[7]；不同濃度的草甘膦脅迫導(dǎo)致鐵皇冠葉片SOD、CAT、POD活性提高，MDA含量逐漸增加[8]。

據(jù)湖南地區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣機(jī)構(gòu)和農(nóng)民反映，草甘膦在防除旱秋作物田地、田埂、果園的馬唐時(shí)用量加大、效果變差，但目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有關(guān)馬唐對(duì)草甘膦抗性的研究報(bào)道。因此，試驗(yàn)以馬唐的葉片為材料，從植物生理生化角度研究馬唐的抗氧化酶活性、脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)與馬唐抗藥性之間的關(guān)系，旨在為我國(guó)抗草甘膦雜草研究和馬唐等抗性雜草的防除提供理論依據(jù)，提高人們對(duì)抗藥性植物的認(rèn)識(shí)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與儀器

供試馬唐種子于2015年9月在婁底市思塘村的彩色水泥廠(chǎng)對(duì)面菜地采集，種子經(jīng)自然風(fēng)干，3周后置于紙袋內(nèi)室溫存儲(chǔ)備用。實(shí)驗(yàn)用土壤于湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)樓下挖取，烘干后碾碎，與基質(zhì)按1∶1混勻，移至花盆備用；草甘膦異丙胺胺鹽（41%）購(gòu)自于湖南婁底農(nóng)科所農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)廠(chǎng)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。主要儀器為：賽多利斯電子天平、754紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)及Conviron探入式植物生長(zhǎng)箱。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1種子萌發(fā) 取若干馬唐種子置于培養(yǎng)皿中的濾紙上，加入適量蒸餾水浸泡24 h，去掉蒸餾水后加入適量52 g/L KNO3浸泡48 h，用蒸餾水洗凈后置入生長(zhǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)萌發(fā)（白天：溫度28℃，光照14.5 h，相對(duì)濕度65%；夜間：溫度24℃，光照9.5 h，相對(duì)濕度55%）。待發(fā)芽后，移入事先裝好土壤的花盆中。繼續(xù)放入生長(zhǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2草甘膦處理 當(dāng)馬唐長(zhǎng)至15～20葉期時(shí)，用手持壓縮噴霧器給馬唐均勻噴霧不同濃度的草甘膦，對(duì)水量為450 L/hm2。每個(gè)處理1桶，面積約0.2 m2，設(shè)置草甘膦為5個(gè)濃度梯度：有效成分分別為0、450、900（推薦劑量）、1 800和3 600 g/hm2。

1.2.3指標(biāo)測(cè)定及方法 在草甘膦處理第3、6、9和12天后的上午，取草甘膦處理的馬唐葉片于冰盒，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，取0.1 g葉片，用0.8 mL PBS（0.2 mol/L，pH值7.8）研磨，定容到1 mL，在12 000 r/min的條件下離心15 min，所得上清液可用于SOD、POD、CAT活性、MDA含量的測(cè)定。

馬唐葉片SOD活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑光化還原法；POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定；CAT活性用分測(cè)定采用分光光度法；MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[9-10]。各指標(biāo)的測(cè)定重復(fù)3次，取其平均值。

1.2.4數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)顯著性分析（ANOVA法）和作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1草甘膦脅迫對(duì)馬唐葉片SOD活性的影響

由圖1可知，隨著不同濃度草甘膦處理馬唐時(shí)間的延長(zhǎng)，其馬唐葉片SOD活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，且其SOD活性隨草甘膦劑量的增加而增加，均在第6天達(dá)到最高。草甘膦處理后第3、6和9天，除了0和450 g/hm2處理的SOD活性無(wú)顯著性差異外，其他各組均有顯著性差異；處理第12天，除了1 800和3 600 g/hm2處理SOD活性顯著高于對(duì)照外，其他各劑量之間無(wú)顯著性差異，且各濃度草甘膦處理的SOD活性均有所下降，尤其450和900 g/hm2處理的SOD活性基本恢復(fù)至對(duì)照水平。這可能是由于馬唐通過(guò)提高SOD活性來(lái)抵御草甘膦可能帶來(lái)的氧化損傷，到脅迫后期低濃度（450～900 g/hm2）草甘膦處理馬唐的SOD活性才恢復(fù)至對(duì)照水平。

圖1　草甘膦脅迫對(duì)馬唐葉片SOD活性的影響

2.2草甘膦脅迫對(duì)馬唐葉片POD活性的影響

由圖2可知，POD活性隨著草甘膦脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)和劑量的增加而增加，第6天達(dá)到峰值，然后POD活性開(kāi)始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在第3和6天，除了450 g/hm2處理外，其他各處理的POD活性均顯著高于對(duì)照，且在第6天各處理間有顯著性差異。在第12天，除了3 600 g/hm2處理的POD顯著高于其他各組和對(duì)照外，其他各劑量之間無(wú)顯著性差異，且450～1 800 g/hm2處理的POD活性恢復(fù)至對(duì)照水平，這說(shuō)明低劑量（450～1 800 g/hm2）草甘膦脅迫馬唐的影響基本消除。

圖2　草甘膦脅迫對(duì)馬唐葉片POD活性的影響

2.3草甘膦脅迫對(duì)馬唐葉片CAT活性的影響

從圖3可知，馬唐葉片CAT活性隨草甘膦脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì)。隨脅迫濃度升高而升高。均在草甘膦處理第6天達(dá)峰值。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，1 800和3 600 g/hm2處理的CAT活性均顯著高于其它各處理，且在第6、9和12天他們之間CAT活性無(wú)顯著性差異，此時(shí)，0和450 g/hm2草甘膦處理的CAT活性也無(wú)顯著性差異；第12天，450和900 g/hm2處理的CAT活性降至接近對(duì)照水平，且他們均與對(duì)照無(wú)顯著性差異，這與本研究中SOD、POD活性的變化基本一致。

圖3　草甘膦脅迫對(duì)馬唐葉片CAT活性的影響

2.4草甘膦脅迫對(duì)馬唐葉片MDA含量的影響

如圖4所示，900～3 600 g/hm2草甘膦劑量處理的MDA含量隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增加后降低的趨勢(shì)，且均是第6天 MDA含量達(dá)到最大，然后緩慢下降，其中3 600 g/hm2草甘膦處理的MDA含量從實(shí)驗(yàn)第6～12天均顯著高于其他各處理。這說(shuō)明草甘膦濃度愈高脅迫導(dǎo)致馬唐體內(nèi)膜質(zhì)過(guò)氧化受損愈嚴(yán)重；草甘膦處理12 d，除3 600 g/hm2草甘膦外，其他各處理的MDA含量均降至對(duì)照水平，且他們之間與對(duì)照均無(wú)顯著性差異，這說(shuō)明450～1 800 g/hm2草甘膦引起馬唐質(zhì)膜受損的情況基本消除，這與本研究中SOD、POD、CAT活性的變化基本一致。

圖4　草甘膦脅迫對(duì)馬唐葉片MDA含量的影響

3　結(jié)論與討論

植物在正常代謝中會(huì)產(chǎn)生O2-、·OH、H2O2等活性氧。通常情況下，SOD是細(xì)胞內(nèi)清除活性氧（O2-）系統(tǒng)中的重要酶，對(duì)維持植物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡起著重要的作用，從而使植物細(xì)胞免受傷害[11]。POD可有效地清除各種逆境脅迫下植物體內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)氧化產(chǎn)物（H2O2），以降低其對(duì)植物自身的毒害，維持質(zhì)膜透性及自由基之間的動(dòng)態(tài)平衡，保證植物進(jìn)行正常生長(zhǎng)代謝[12]。SOD活性的升高，導(dǎo)致葉片細(xì)胞內(nèi)積累了大量的H2O2，此時(shí)通過(guò)增加POD活性將H2O2進(jìn)行分解，以提高其在逆境下的適應(yīng)能力。CAT與SOD、POD協(xié)同作用，能有效地清除體內(nèi)的活性氧，維持植物體活性氧代謝的平衡，保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)不受到傷害。

正常情況下，植物體活性氧的產(chǎn)生和清除兩者處于平衡狀態(tài)；但在逆境脅迫下，這種平衡被打破，從而引起膜受損[13]。植物器官在衰老或逆境條件下，受自由基的毒害會(huì)發(fā)生膜脂的過(guò)氧化作用，MDA是生物膜中不飽和脂肪酸分解后的一種產(chǎn)物，是反應(yīng)植物遭受逆境傷害程度的良好指標(biāo)。草甘膦是一種廣譜性的除草劑，它能在綠色植物組織內(nèi)從光系統(tǒng)中產(chǎn)生O2-，且能轉(zhuǎn)化成H2O2和·OH等一系列活性氧，而這些活性氧對(duì)細(xì)胞本身就有毒害，而SOD、POD和CAT是植物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)中最重要的3種酶。因此，POD、SOD和CAT活性以及MDA含量的變化，能反映植物細(xì)胞受傷害的程度以及抗氧化脅迫能力的大小[14]，從而反映植物抗性的強(qiáng)弱。相關(guān)研究表明，植物SOD、POD、CAT活性和MDA含量隨草甘膦的加強(qiáng)或時(shí)間的延長(zhǎng)，表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)[8,10]。也有研究表明，草甘膦處理下，MDA含量隨草甘膦濃度的增大而降低[15]。

研究表明，不同濃度的草甘膦脅迫均增大馬唐葉片SOD、POD和CAT活性以及MDA的含量，第6天達(dá)最大值，然后又緩慢下降，至第12天時(shí)，450、900和1 800 g/hm2草甘膦處理的 MDA含量和POD活性均降至對(duì)照水平，且各處理之間無(wú)顯著性差異，這說(shuō)明草甘膦的脅迫使馬唐受到了抗氧化損傷，進(jìn)而大大誘發(fā)其保護(hù)酶活性的升高從而增強(qiáng)其對(duì)逆境的適應(yīng)能力，尤其是高濃度組。與對(duì)照組相比，所有草甘膦處理組的MDA含量都有所增加，說(shuō)明馬唐確實(shí)受到草甘膦引起的氧化損傷，但草甘膦脅迫后第12天，草甘膦處理各組的MDA含量均已下降，且450～1 800 g/ hm2草甘膦處理馬唐的MDA含量與對(duì)照無(wú)顯著性差異。這說(shuō)明馬唐對(duì)草甘膦有一定的抗性，馬唐經(jīng)過(guò)一定時(shí)間能自行修復(fù)，緩解了其質(zhì)膜過(guò)氧化程度，尤其低濃度草甘膦處理馬唐所受到的氧化損傷較小且已恢復(fù)至正常水平，這與原向陽(yáng)等[10]的研究結(jié)果基本一致。

綜上所述，草甘膦脅迫提高了馬唐葉片的SOD、POD、CAT活性，增加了MDA的含量；正常條件下，450、900和1 800 g/hm2草甘膦對(duì)馬唐的傷害可以經(jīng)過(guò)馬唐一段時(shí)間的生長(zhǎng)發(fā)育而恢復(fù)，進(jìn)而說(shuō)明馬唐對(duì)草甘膦較易產(chǎn)生耐藥性。

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（責(zé)任編輯：夏亞男）

Influences?of?Herbicide?Glyphosate?on?Antioxidant?Enzyme?System?and?MDA?Content?of?Digitaria sanguinalis

XIA Ai-lian1，JIN Chen-zhong1,2,3，HU Yi-hong1,2,3，LIU Xiao1，ZOU Ting-ting1,2，WANG Yan1,2,3
（1.College of Agriculture and Biotechnology, Hunan University of Humanities, Science and Technology, Loudi 417000, PRC; 2.Hunan Provincial Collaborative Innovation Center for Field Weeds Control, Loudi 417000, PRC; 3.Key Laboratory of Pesticide Harmless Application, Hunan University of Humanities, Science and Technology, Loudi 417000, PRC）

The time-dependent changes of the activities of three antioxidant enzymes and the content of malonaldehyde in Digitaria sanguinalis were studied byspraying different concentrations of glyphosate.The three antioxidant enzymes mentioned above include superoxide dismutase, peroxidase and Catalase.The results showed that compared with the control value, the activities of three antioxidant enzymes and the content of malonaldehyde are somewhat increased during the initial stage after spraying glyphosate.All the indexes peak 6 days after spraying glyphosate.After the ninth day, all the indexes decreased.After the twelfth day, when the glyphosate concentration was 400, 90 and 1 800 g/hm2, the activities of SOD, POD and CAT and the content of MDA in Digitaria sanguinalis decreased to the control level.Under normal circumstances, Digitaria sanguinalis damaged by glyphosate continued to grow over a period of time.At the same time, it also suggested that Digitaria sanguinalis has certain resistance to glyphosate.

glyphosate; Digitaria sanguinalis; antioxidant enzyme system; malondialdehyde

S451

A

1006-060X（2016）11-0024-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.011.008

2016-08-05

湖南省教育廳青年項(xiàng)目（16B137）；婁底市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201304）；湖南人文科技學(xué)院產(chǎn)學(xué)研合作引導(dǎo)項(xiàng)目（2014CXY06，2013CXY04）；湖南省高校產(chǎn)業(yè)化培育項(xiàng)目（13CY030）；湖南省高校創(chuàng)新平臺(tái)基金（15K066）

夏愛(ài)蓮（1996-），女，湖南婁底市人，本科生，生物技術(shù)專(zhuān)業(yè)。

王 艷