L-異亮氨酸生產(chǎn)菌Corynebacterium glutamicum JHI3-156中突變酶TD1及AHAS1的初研究

吳錦榮，李西君，劉世周，薄文文，王玉杰

（1.新疆阜豐生物科技有限公司，新疆烏魯木齊830000；2.山東阜豐發(fā)酵有限公司，山東臨沂276600）

L-異亮氨酸生產(chǎn)菌Corynebacterium glutamicum JHI3-156中突變酶TD1及AHAS1的初研究

吳錦榮1，李西君1，劉世周2，薄文文2，王玉杰2

（1.新疆阜豐生物科技有限公司，新疆烏魯木齊830000；2.山東阜豐發(fā)酵有限公司，山東臨沂276600）

蘇氨酸脫水酶（TD）和乙酰羥基氨酸合酶（AHAS）是谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）合成L-異亮氨酸的關(guān)鍵酶。TD受L-異亮氨酸反饋抑制，AHAS受三支鏈氨基酸的反饋抑制。通過研究分析L-異亮氨生產(chǎn)菌C.glutamicum JHI3-156中突變型TD1及AHAS1，發(fā)現(xiàn)TD1有一個突變氨基酸，AHAS1有三個突變氨基酸；將TD，TD1，AHAS和AHAS1在Escherichia coli BL21(DE3)中過量表達，經(jīng)提取純化及酶活測定，發(fā)現(xiàn)相比野生型TD，突變型TD1體現(xiàn)較高的酶活水平，完全不再受L-異亮氨酸反饋抑制；相比野生型AHAS，突變型AHAS1對較高濃度的L-異亮氨酸更耐受。

突變型TD1；突變型AHAS1；酶活測定；L-異亮氨酸；抗反饋抑制

谷氨酸棒桿菌中，L-異亮氨酸合成代謝途徑中蘇氨酸脫水酶（TD）受L-異亮氨酸抑制[1]；乙酰羥基氨酸合酶（AHAS）受三支鏈氨基酸反饋抑制，且AHAS催化丙酮酸形成α-乙酰乳酸或者催化2-酮丁酸形成乙酰羥基丁酸（圖1），此反應決定著相關(guān)代謝流到不同的終產(chǎn)物[2]。因此找尋具有抗反饋抑制能力的突變型TD及AHAS對L-異亮氨酸生產(chǎn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株、質(zhì)粒及引物

試驗所用的菌株、質(zhì)粒如表1，2所示，重組載體構(gòu)建所需引物如表3所示。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.2.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母提取物，用于E.coli DH5α和E.coli BL21（DE3）菌株的培養(yǎng)。

表1 菌株

表2 質(zhì)粒

表3 引物

改良的LB培養(yǎng)基：1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母提取物，0.5%葡萄糖。用于C.glutamicum JHI3-156及C.glutamicum ATCC 13869的培養(yǎng)。

固體培養(yǎng)基瓊脂粉用量為1.8%；轉(zhuǎn)化子篩選及質(zhì)粒穩(wěn)定性的維持需添加30 μg/mL的卡那霉素；基因誘導表達加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）。

1.2.2培養(yǎng)條件

E.coli菌種培養(yǎng)條件：LB液體培養(yǎng)基（用移液槍吸取E.coli菌種甘油保藏液80 μL，接種至裝有8 mL LB液體的試管中），37℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)8.5 h。

C.glutamicum種子培養(yǎng)：改良LB液體培養(yǎng)基（用接種環(huán)挑取培養(yǎng)皿中肉眼可見的C. glutamicum菌種單菌落，接種至裝有20 mL改良LB液體的100 mL三角瓶中），30℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)13.5 h。

E.coli轉(zhuǎn)化細胞培養(yǎng)：用移液槍吸取700 μL轉(zhuǎn)化后菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)14 h；再用接種環(huán)挑取先前培養(yǎng)好的單個菌落接種至含有7 mL LB液體的試管中，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)11.5 h，用于重組質(zhì)粒驗證。

1.3 分子生物學實驗

1.3.1 C.glutamicum基因組DNA的提取

使用細菌基因DNA提取試劑盒提取C. glutamicum基因組，首先破壁處理，在I型溶液中加入5 μL質(zhì)量濃度為100 mg/mL的溶菌酶，37℃破壁處理30 min，后續(xù)提取均按照試劑盒中說明的步驟進行。

1.3.2 PCR擴增和產(chǎn)物的純化

以基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增體系為50 μL（5 μL 10×Ultra-Pfu PCR Buffer，4 μL dNTP mixtrure，正反向引物1 μL，模板1 μL，0.5 μL Ultra-Pfu DNA聚合酶，ddH2O補充至50 μL）。擴增程序為：98℃預變性5 min；98℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸（延伸時間按1 Kb/min計算），35個循環(huán)；72℃再延伸10 min；4℃保存。用1%的瓊脂糖凝膠對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，切割目的條帶，純化回收PCR產(chǎn)物。

1.3.3 PCR產(chǎn)物、質(zhì)粒酶切及純化

1）PCR產(chǎn)物酶切體系

酶切反應體系50 μL的單酶雙切：2 μL限制性內(nèi)切酶A，5 μL 10×Buffer酶A，5 μL PCR產(chǎn)物（由DNA濃度計算加入對應體積），ddH2O補充至50 μL，37℃酶切4 h。酶切反應體系50 μL的雙酶雙切：1 μL限制性內(nèi)切酶A，1 μL限制性內(nèi)切酶B，5 μL 10×Buffer酶A和酶B，5 μL PCR產(chǎn)物（由DNA濃度計算加入對應體積），ddH2O補充至50 μL，37℃酶切4 h。

2）質(zhì)粒酶切體系

酶切反應體系50 μL的單酶單切：1 μL限制性內(nèi)切酶A，5 μL 10×Buffer酶A，5 μL質(zhì)粒DNA（由DNA濃度計算加入對應體積），ddH2O補充至50 μL，37℃酶切2 h。酶切反應體系50 μL的雙酶雙切：1 μL限制性內(nèi)切酶A，1 μL限制性內(nèi)切酶B，5 μL 10×Buffer酶A和酶B，5 μL質(zhì)粒DNA（由DNA濃度計算加入對應體積），ddH2O補充至50 μL，37℃酶切2 h。純化回收質(zhì)粒DNA及酶切PCR產(chǎn)物。

1.3.4 PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒的連接

連接體系（20 μL）：依次在PCR管中加入2 μL 10×T4 ligase Buffer，50 ng（20～100 ng）酶切純化后質(zhì)粒，按摩爾比1∶10（單酶切）或1∶3（雙酶切）加入酶切純化后的PCR產(chǎn)物，1 μL T4 DNA連接酶，最后ddH2O補至20 μL，22℃連接1.5 h。

1.3.5 感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化

連接產(chǎn)物參照徐大慶等[3]的化學法轉(zhuǎn)化E.coli DH5α。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒按照徐大慶等的化學法轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）中。

1.3.6 陽性轉(zhuǎn)化子的鑒定

E.coli BL21（DE3）轉(zhuǎn)化子經(jīng)液體培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，進行單酶切和PCR驗證獲陽性轉(zhuǎn)化子。

1.4 重組E.coli BL21（DE3）菌種的蛋白表達分析

用IPTG對鑒定成功的E.coli BL21（DE3）工程菌進行誘導表達，同時分析目標基因的表達狀況。測定誘導培養(yǎng)重組菌的OD600nm，按1 mL OD600nm-1=2計算，取一定體積的該重組菌菌液，10 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加150 μL ddH2O重懸后，取15 μL重懸菌液，加入15 μL 2×Buffer混勻，沸水煮沸5 min，將處理好的樣品經(jīng)5%濃縮膠和12%分離膠的SDS-PAGE電泳分離，用考馬斯亮藍R-250染色，ddH2O慢搖脫色，獲得E.coli BL21（DE3）重組菌蛋白電泳圖譜。

1.5 E.coli BL21（DE3）工程菌中目標蛋白的Ni柱純化

當E.coli BL21（DE3）重組菌OD600nm值為0.6～0.7時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導表達4.5 h，8 500 r/min高速離心10 min后收集菌體，加入30 mL起始緩沖液（4.77 g/L HEPES，29.22 g/L NaCl及0.68 g/L咪唑，pH 8.0）洗滌3次后，再加入15 mL起始緩沖液重懸；然后用細胞破碎儀按照功率40%，超聲3 s，停2 s，共處理15 min進行超聲破壁，高速冷凍離心后取上清液，進行Ni柱純化：1）用150 mL經(jīng)冰浴的初始緩沖液平衡柱子；2）將紫外檢測儀的開關(guān)打開，待基線平直時，以0.8 mL/min的流速將過膜后的上清液上柱；3）用100 mL初始緩沖液洗滌雜蛋白，等基線平直后加入最終緩沖液（4.77 g/L HEPES，29.22 g/L NaCl及34.04 g/L咪唑，pH 8.0）進行洗脫；4）紫外檢測儀數(shù)值顯示大于180時，收集穿過液，進行SDS-PAGE試驗。

1.6 酶活測定分析

1.6.1 TD酶活檢測

TD酶活性的測定參考文獻[4]，酶反應體系為1 mL：40 mmol/L的L-蘇氨酸，pH 8.0的100 mmol/L磷酸鉀緩沖液，1 mmol/L的磷酸吡哆醛。向酶反應體系中加入一定體積的純酶液，22℃孵育15 min，加入1 mL 1%氨基脲鹽及0.9%醋酸鈉混合液終止酶學反應。用紫外分光光度計在254 nm條件下檢測氨基脲衍生物的OD值來確定2-酮丁酸的量。根據(jù)比爾定律：A=εbc，ε254nm=0.52 mmol/cm，計算氨基脲衍生物的生成量，從而間接確定2-酮丁酸的量。酶活單位定義為在22℃下，每分鐘形成1 mol 2-酮丁酸的量；比酶活定義為每毫克蛋白每分鐘生成氨基脲衍生物的μmol數(shù)。試驗重復測定3次。

1.6.2 AHAS酶活檢測

AHAS酶活測定參考文獻[5]，酶反應體系為1 mL：100 mmol/L的2-酮丁酸，100 mmol/L的丙酮酸鈉，10 mmol/L的MgCl2，0.2 mmol/L的焦磷酸硫胺素及100 mmol/L的磷酸鉀緩沖液（pH 7.8）。隨后加入一定體積純酶液，37℃孵育1 h后加入100 μL 3 mol/L H2SO4終止酶反應，該反應混合物12 000 r/min離心15 min，取上清液于干凈的EP管中65℃孵育15 min。然后加入1 mL 0.5%的肌酸，1 mL 5%的α-萘酚溶液（2.5 mol/L NaOH新鮮配制），65℃孵育20 min，冷卻至室溫。525 nm處測定反應產(chǎn)物的吸光度值，產(chǎn)物3-羥基-2-丁酮由標樣定量。酶活單位定義為37℃下每分鐘形成1 mol 3-羥基-2-丁酮所需的酶量，比酶活定義為每毫克蛋白每分鐘生成3-羥基-2-丁酮的量。試驗重復3次。

1.6.3 TD及AHAS對支鏈氨基酸的抗反饋抑制性

TD的抗反饋抑制性：將L-異亮氨酸加入TD酶學反應體系中，終濃度為0，0.3，0.6，1.2，4.5，18.4和50 mmol/L，測定不同濃度下的酶活。相對酶活定義為不同濃度L-異亮氨酸存在下的比酶活與初始酶活的百分比。

AHAS的抗反饋抑制性：L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸加入酶學反應體系中的方式有兩種：1）單個加入，終濃度分別為0，2，4，6，8和10 mmol/L；2）兩兩組合或三個組合加入。相對酶活定義為支鏈氨基酸添加下比酶活與初始比酶活的百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標蛋白表達載體構(gòu)建

根據(jù)C.glutamicum ATCC 13032[6]全基因組測序序列設(shè)計引物，既根據(jù)C.glutamicum ATCC 13032基因組中ilvA及ilvBN基因的上下游序列分別設(shè)計PCR引物（ilvA-F，ilvA-R，ilvBN-F，ilvBN-R）。選C.glutamicum ATCC 13869和C. glutamicum JHI3-156基因組為PCR擴增模板?；騣lvA及ilvA1用引物ilvA-F及ilvA-R進行擴增；基因ilvBN及ilvBN1用引物ilvBN-F及ilvBN-R進行擴增；四個PCR擴增產(chǎn)物用EcoRI及HindIII雙酶切，連接到相同酶酶切且攜帶組氨酸標簽的pET28a載體上，后轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細胞中。經(jīng)HindIII單酶切和PCR驗證，表明這四個重組質(zhì)粒構(gòu)建成功形成重組質(zhì)粒：pET28a-ilvA，pET28a-ilvA1，pET28a-ilvBN，pET28a-ilvBN1。圖2為蛋白表達載體構(gòu)建框架圖。

圖3為重組質(zhì)粒單酶切及目標基因PCR產(chǎn)物核酸電泳驗證結(jié)果。ilvA和ilvA1經(jīng)PCR擴增后的基因片段約1 311 bp，pET28a-ilvA，pET28ailvA1經(jīng)HindIII酶切后的片段長度約6 680 bp；同時ilvBN和ilvBN1經(jīng)PCR擴增后的基因片段約2 413 bp，pET28a-ilvBN，pET28a-ilvBN1經(jīng)HindIII酶切后的片段長度約7 782 bp，表明重組質(zhì)粒pET28a-ilvA，pET28a-ilvA1，pET28a-ilvBN，pET28a-ilvBN1在E.coli DH5α中構(gòu)建成功。蛋白表達菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-ilvA，E.coli BL21(DE3)/pET28a-ilvA1，E.coli BL21(DE3)/ pET28a-ilvBN及E.coli BL21(DE3)/pET28ailvBN1的獲得需將pET28a-ilvA，pET28a-ilvA1，pET28a-ilvBN，pET28a-ilvBN1四個重組菌轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞E.coli BL21（DE3）中，經(jīng)卡那霉素篩選及HindIII單酶切和PCR驗證后確認獲得上述蛋白表達菌。

2.2 基因突變點的檢出

來自于菌株C.glutmicum JHI3-156的基因ilvA1與來自于野生菌株C.glutmicum ATCC 13869的基因ilvA相比，前者顯示有一個突變位點T1147G，使得TD的383號氨基酸處有一F383V氨基酸替換。來自于菌株C.glutmicum JHI3-156的基因ilvBN1與來自于野生菌株C. glutmicum ATCC 13869的基因ilvBN相比，前者顯示有三個突變位點，分別為C526T，C1278G和T1724G，使得AHAS的大亞基上的三個氨基酸突變，分別為P176S，D426E和L575W。該L-異亮氨酸有效生產(chǎn)菌種中TD及AHAS兩個關(guān)鍵酶突變位點的發(fā)現(xiàn)對L-異亮氨酸高產(chǎn)起到重要作用。

2.3 SDS-PAGE分析重組蛋白表達情況

重組菌BL21（DE3）/pET28a-ilvA和BL21（DE3）/pET28a-ilvA1相比對照菌，兩者均有一條特異性蛋白條帶，分子量均為43 kDa，與TD的理論分子量大小基本一致。同理分析重組菌BL21（DE3）pET28a-ilvBN及BL21（DE3）/pET28ailvBN1均有兩條66 kDa和18 kDa的特異性蛋白條帶，基本與AHAS大小亞基的理論分子量一致。從而分析得出野生型和突變型的TD及AHAS在載體表達菌E.coli中表達很好。由于注意到在E.coli BL21（DE3）中表達的蘇氨酸脫水酶與乙酰羥合酶氨基酸序列N末端的6×His標簽，所以選用Ni-NTA進行蛋白純化。

2.4 突變型TD及AHAS的抗反饋抑制能力分析

考慮到胞內(nèi)物質(zhì)對酶活測定的干擾性，重組菌細胞經(jīng)IPTG誘導表達后超聲波破碎，并離心取上清液，利用Ni-NTA純化后獲得目標蛋白。實驗結(jié)果顯示（圖5）：BL21（DE3）/pET28a-ilvA重組菌中野生型TD酶活會隨著L-異亮氨酸濃度的增加而降低，當異亮氨酸的濃度達到1.2 mmol/L時，野生型TD酶活降低至15%。說明TD酶活受到L-異亮氨酸的嚴重抑制，表明野生型TD仍受L-異亮氨酸的反饋抑制，無抗反饋抑制能力。而BL21（DE3）/pET28a-ilvA1重組菌中突變型TD酶活不但不會受L-異亮氨酸抑制，反而增加突變型TD酶活。當異亮氨酸濃度達到0.3 mmol/L時，突變型TD酶活增加5倍，當L-異亮氨酸濃度逐漸增高時，該蛋白的比酶活迅速下降，但即使L-異亮氨酸濃度為50 mmol/L時，突變型TD酶活仍未受到L-異亮氨酸的反饋抑制。結(jié)果表明L-異亮氨酸不僅不會抑制突變型TD比酶活，反而激活了該酶活性，表明突變型TD具有抗反饋抑制能力。

實驗結(jié)果顯示（圖6）：重組菌BL21（DE3）/ pET28a-BN及BL21（DE3）/pET28a-BN1中野生型和突變型AHAS酶仍然受到三支鏈氨基酸的反饋抑制，因隨著支鏈氨基酸L-異亮氨酸、L-纈氨酸或L-亮氨酸的單獨添加及其組合添加，野生型和突變型AHAS酶活均下降。但突變型AHAS體現(xiàn)出與野生型AHAS不一樣的抑制程度，尤其表現(xiàn)出對異L-亮氨酸、L-纈氨酸及支鏈氨基酸任意兩兩組合或三個組合的更多耐受性。

3 結(jié)論

通過對L-異亮氨生產(chǎn)菌C.glutamicum JHI3-156中突變酶TD1及AHAS1初步研究得出，L-異亮氨酸激活了突變型TD1的酶活，TD1不再受L-異亮氨酸抑制，表現(xiàn)出對L-異亮氨酸的抗反饋抑制能力；突變型AHAS1酶活仍受支鏈氨基酸的反饋抑制，但表現(xiàn)出對較高濃度L-異亮氨酸的耐受性。本研究可為后續(xù)生產(chǎn)中提高L-異亮氨酸產(chǎn)量提供參考。

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[2]EPELBAUM S,LAROSSA R A,VANDYK T K,et al.Branchedchain amino acid biosynthesis in Salmonella typhimurium:a quantitative analysis[J].Journal of bacteriology,1998,180(16): 4056-4067.

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（責任編輯：朱小惠）

表3 連續(xù)運行物料平衡分析

5 結(jié)論

利用臥螺離心機可實現(xiàn)色氨酸陶瓷膜濃液的二次回收，進一步提高色氨酸成品收率。根據(jù)中試實驗結(jié)果，可以回收色氨酸陶瓷膜濃縮液中53%的色氨酸，成品收率在原有基礎(chǔ)上提高2%，同時各項成品單耗降低。每噸色氨酸成本下降約420元。同時，菌體經(jīng)提純后，蛋白飼料產(chǎn)品品質(zhì)會有所提升。但目前該工藝對臥螺離心機轉(zhuǎn)速、進料量要求較高，工藝設(shè)備投資回報率較長，后續(xù)需要作進一步的設(shè)備選型及工藝優(yōu)化、調(diào)整，以期獲得更大的利潤。

參考文獻：

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（責任編輯：朱小惠）

A primary research of mutant TD1 and AHAS1 in L-isoleucine producing strain Corynebacterium glutamicum JHI3-156

WU Jinrong1,LI Xijun1,LIU Shizhou2,BO Wengweng2,WANG Yujie2
(1.Xinjiang Fufeng Biotechnology Co.,Ltd.,Urumqi 830000,China; 2.Shandong Fufeng Fermentation Co.,Ltd.,Linyi 276600,China)

Threonine dehydratese(TD)and acetohydroxy acid synthase(AHAS)are key enzymes involved in L-isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicum.TD is inhibited by the feedback of L-isoleucine,and AHAS is inhibited by the feedback of three branched-chain amino acids.The investigation of TD1 and AHAS1 mutants in L-isoleucine producing strain Corynebacterium glutamicum JHI3-156 found that TD1 has one mutant amino acid,while AHAS1 has three mutant amino acids.TD,TD1,AHAS and AHAS1 were all over-expressed in Escherichia coli BL21(DE3)and purified for enzyme activity determination.The results showed that the mutant TD1 exhibited higher activity compared with the wild type TD and it was completely resistant to L-isoleucine.Compared with the wild type AHAS,the mutant AHAS1 was more resistant to higher concentration of L-isoleucine.

mutant TD1;mutant AHAS1;enzymatic activity determination;L-isoleucine;antifeedback inhibition

Q814

A

1674-2214（2016）04-0240-08

2016-09-22

吳錦榮（1985—），女，新疆博爾塔拉人，助理工程師，碩士，主要從事分子生物學方面的研究,E-mail:850640619@qq.com.