郭建華 ， 包美娟 ， 王 娟 ， 李前勇 ， 曹 政

(1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系 ， 重慶榮昌402460 ； 2.重慶澳龍生物制品有限公司 ， 重慶榮昌402460)

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幾種消毒劑對(duì)牛型結(jié)核分枝桿菌的殺菌效果試驗(yàn)

郭建華1， 包美娟1， 王 娟1， 李前勇1， 曹 政2

(1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系 ， 重慶榮昌402460 ； 2.重慶澳龍生物制品有限公司 ， 重慶榮昌402460)

為了研究復(fù)合酚、氫氧化鈉、聚維酮碘等消毒劑在不同濃度、不同作用時(shí)間對(duì)牛型結(jié)核分枝桿菌的殺菌效果；本研究以濃度為20%、10%、5%、2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.01%的消毒劑分別對(duì)牛型結(jié)核桿菌進(jìn)行處理，作用時(shí)間分別為10、20、30、60 min、1、2、6、12 h；結(jié)果顯示，濃度在0.2%及以上的復(fù)合酚在12 h內(nèi)可殺滅牛型結(jié)核分枝桿菌，1%以上聚維酮碘處理6 h以上可殺滅牛型結(jié)核分枝桿菌，而所有試驗(yàn)濃度的氫氧化鈉對(duì)牛型結(jié)核分枝桿菌沒(méi)有殺滅作用；本研究結(jié)果表明，復(fù)合酚和聚維酮碘可用于環(huán)境的牛型結(jié)核分枝桿菌的凈化。

消毒劑 ； 牛型結(jié)核分枝桿菌 ； 殺菌

結(jié)核病是由分支桿菌屬結(jié)核桿菌引起的一種人獸共患慢性消耗性傳染病。在家畜中，牛最易感染牛型結(jié)核分枝桿菌而發(fā)生結(jié)核病，特別是奶牛，其次是水牛和黃牛，不但造成經(jīng)濟(jì)損失，而且危害人畜健康。結(jié)核病是全球重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，在一些發(fā)達(dá)國(guó)家如德國(guó)、澳大利亞等國(guó)的人結(jié)核病患者中，約0.2%～0.3%是由牛型結(jié)核分枝桿菌引起的，而在埃塞俄比亞、尼日利亞、坦桑尼亞等不發(fā)達(dá)國(guó)家中，這個(gè)比例高達(dá) 17.0%～26.1%[1-2]，由此可見(jiàn)，控制牛結(jié)核病不僅對(duì)于動(dòng)物疫病防治，還是對(duì)人健康，都具有重大的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

由于動(dòng)物用藥的各種限制，合理、科學(xué)的消毒在動(dòng)物疫病防控中顯得非常重要性。消毒可有效地殺滅養(yǎng)殖場(chǎng)、交通工具等環(huán)境中病原微生物，清除傳染源，達(dá)到預(yù)防疾病，保證畜禽健康生長(zhǎng)的目的，同時(shí)也可以保護(hù)人的健康。畜禽業(yè)目前應(yīng)用較多的是各種化學(xué)消毒劑，主要分為鹵素類(氯制劑、碘制劑、溴制劑)、醛類、酚類、醇類、氧化劑類、表面活性劑類、酸堿類等。已有研究者在消毒劑對(duì)結(jié)核分枝桿菌的殺滅效果方面做了研究[3-8]，但對(duì)牛型結(jié)核分枝桿菌的消毒效果，未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)以牛型結(jié)核分支桿菌為研究對(duì)象，研究不同濃度的聚維酮碘、復(fù)合酚以及氫氧化鈉溶液，在不同的作用時(shí)間對(duì)牛型結(jié)核桿菌的殺滅作用，旨在研究這幾種消毒劑的殺菌效果濃度和作用時(shí)間，為牧場(chǎng)、動(dòng)物醫(yī)院等環(huán)境的凈化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 試驗(yàn)菌株牛型結(jié)核分枝桿菌由國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心提供。

1.2 培養(yǎng)基 改良羅氏培養(yǎng)基的制備參照中國(guó)防癆協(xié)會(huì)制定的“結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程”[9]。稱取磷酸二氫鉀 14 g，枸櫞酸鎂 0.6 g，硫酸鎂0.24 g，谷氨酸鈉7.2 g，以及量取丙三醇12 mL，溶解于大約600 mL水中，加馬鈴薯淀粉30g，混勻，沸水浴煮1 h成糊狀，待冷卻后加入2%無(wú)菌的孔雀綠水溶液20 mL中，用消毒紗布過(guò)濾的新鮮雞卵液定容至1 000 mL，混勻后分裝于無(wú)菌試管內(nèi)擺成斜面，90 ℃蒸汽加熱90 min滅菌。冷卻后隨機(jī)取數(shù)支于37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)24 h，確定無(wú)菌后4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管的配制 本試驗(yàn)所需為0.1和 0.5麥?zhǔn)蠁挝?。?.1 mL濃度為1.175%BaCl2溶液與99.9 mL濃度為1%H2SO4溶液混合均勻即為0.1麥?zhǔn)蠁挝弧Ｈ?.5 mL濃度為1.175%BaCl2溶液與99.5 mL濃度為1%H2SO4溶液混合均勻即為0.5麥?zhǔn)蠁挝弧?/p>

2.2 消毒液的配制 將氫氧化鈉、聚維酮碘、復(fù)合酚等依據(jù)衛(wèi)生部衛(wèi)生法制與監(jiān)督司2002年編制的《消毒技術(shù)規(guī)范》按照其主要的消毒成分進(jìn)行不同濃度稀釋[10]，分別用無(wú)菌生理鹽水配制成20%、10%、5%、2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.01%消毒液。

2.3 菌株的活化、增殖、抗酸染色 取凍干菌種管，在無(wú)菌操作下打開(kāi)，用無(wú)菌吸管加入0.3 mL～0.5 mL稀釋液(滅菌的含0.5% Tween-80 的生理鹽水)于安瓿瓶?jī)?nèi)，使凍干菌種溶解呈懸浮液，輕柔吹吸數(shù)次，使菌種融化分散?；靹蚝?，將少許菌種懸浮液接入改良羅氏斜面培養(yǎng)基中，置于37 ℃培養(yǎng)。接種后第3、7、14、21、30天分別觀察菌落生長(zhǎng)及污染情況。用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)物，接種于斜面培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)直至長(zhǎng)出典型培養(yǎng)物。挑取第2 代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于斜面培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)15 d以上，即為第3代培養(yǎng)物。

將培養(yǎng)物均勻涂抹于載玻片上，用齊-尼二氏染色法染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察，如可見(jiàn)紅色、抗酸性、短桿狀、微彎、團(tuán)狀聚集菌體，偶見(jiàn)分枝即為牛型結(jié)核分枝桿菌。

2.4 菌懸液的制備與接種 取菌種第3代～5代的改良羅氏培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物(72 h內(nèi))，用5.0 mL吸管吸取3.0 mL～5.0 mL稀釋液加入斜面試管內(nèi)，反復(fù)吹吸，洗下菌苔。隨后，用5.0 mL吸管將洗液移至另一無(wú)菌試管中，用混合器混合5min，以使細(xì)菌懸浮均勻，用稀釋液將菌懸液稀釋至0.5麥?zhǔn)蠁挝粋溆谩?/p>

用2.2.2配制好的9個(gè)不同濃度的消毒液分別將0.5麥?zhǔn)蠁挝坏慕Y(jié)核分枝桿菌稀釋為0.1麥?zhǔn)蠁挝?，稀釋的同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，分別在稀釋5、10、15、20、25、30、45、60、120 min、6、12、18、24 h各時(shí)刻加入生理鹽水，以3 000 r/min離心20 min，收集沉淀，棄上清，反復(fù)洗滌2次后，用生理鹽水配制成0.1麥?zhǔn)蠁挝痪?，?0 μL菌液接種在準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基上，試驗(yàn)設(shè)重復(fù)3個(gè)。37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d后，分別觀察結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)情況。

2.5 結(jié)果判定 14 d后開(kāi)始觀察，若培養(yǎng)基有黃色菌落的生長(zhǎng)，說(shuō)明該消毒劑對(duì)結(jié)核桿菌沒(méi)有殺滅作用，記為“+”；若沒(méi)有長(zhǎng)，說(shuō)明該消毒劑對(duì)結(jié)核桿菌有殺滅作用，記為“-”。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)合酚的殺菌試驗(yàn)結(jié)果 各濃度復(fù)合酚不同時(shí)間處理殺滅牛型結(jié)核桿菌試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。從表1中可以看出，0.1%及以下濃度的復(fù)合酚溶液對(duì)結(jié)核桿菌沒(méi)有殺滅效果。而0.2%濃度及以上的復(fù)合酚溶液在與結(jié)核桿菌作用12 h后能將其殺滅；0.5%濃度的復(fù)合酚溶液在與結(jié)核桿菌作用60 min后能殺滅結(jié)核桿菌；濃度在1%及以上的復(fù)合酚溶液與結(jié)核桿菌作用10 min后就會(huì)有殺菌效果。而0.5%以下的濃度的復(fù)合酚處理30 min以內(nèi)的菌株中，可以看見(jiàn)呈顆粒狀或菜花狀的黃色菌落。

3.2 聚維酮碘的殺菌試驗(yàn)結(jié)果 聚維酮碘的殺菌試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。表2顯示結(jié)果為：10 min至12 h，5%及以上濃度都沒(méi)有長(zhǎng)出結(jié)核桿菌，2%濃度的則是在殺菌試驗(yàn)處理2 h及其以上不長(zhǎng)出結(jié)核桿菌，2 h以內(nèi)均長(zhǎng)出結(jié)核桿菌；1%濃度在殺菌試驗(yàn)進(jìn)行6 h后不長(zhǎng)出結(jié)核桿菌；0.5%以下濃度在殺菌試驗(yàn)進(jìn)行的每個(gè)時(shí)間段后均長(zhǎng)出結(jié)核桿菌。

表1 復(fù)合酚對(duì)牛型結(jié)核分枝桿菌的殺菌效果

+：有菌落生長(zhǎng)；-：沒(méi)有菌落的生長(zhǎng)，下表同

表2 聚維酮碘對(duì)牛型結(jié)核分枝桿菌的殺菌效果

3.3 氫氧化鈉的試驗(yàn)結(jié)果 接種14 d后開(kāi)始觀察試驗(yàn)結(jié)果并記錄結(jié)果，發(fā)現(xiàn)各濃度氫氧化鈉處理結(jié)核桿菌沒(méi)有殺滅效果。

4 討論

結(jié)核桿菌細(xì)胞壁的脂類多為磷脂、蠟質(zhì)和脂肪酸，它們與細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)和多糖結(jié)合，使細(xì)胞壁的密度增大，增強(qiáng)細(xì)胞壁的保護(hù)效果，防止多種殺菌藥液滲入，導(dǎo)致結(jié)核桿菌對(duì)化學(xué)消毒劑的抵抗力較其他細(xì)菌強(qiáng)，從而消毒難度更大[3]。

本試驗(yàn)中表明，復(fù)合酚對(duì)牛型結(jié)核分支桿菌的殺滅效果較好，只是濃度較低且作用時(shí)間較短的條件下復(fù)合酚溶液對(duì)結(jié)核桿菌沒(méi)有殺滅作用。正常情況下濃度在0.2%及以上的復(fù)合酚在12 h內(nèi)能將結(jié)核桿菌殺滅，而濃度為1%及以上的復(fù)合酚在10 min后就可殺滅結(jié)核桿菌。

聚維酮碘是碘和1-乙烯基-2-吡咯烷酮結(jié)合形成的絡(luò)合物，是中效消毒劑，通過(guò)接觸細(xì)菌細(xì)胞，釋放游離碘直接鹵化鹵體蛋白質(zhì)，產(chǎn)生沉淀，破壞細(xì)胞膜，從而達(dá)到殺滅細(xì)菌的作用。在本試驗(yàn)中，2%聚維酮碘處理2 h以上才能徹底殺死牛型結(jié)核分枝桿菌，而要在較短時(shí)間殺滅菌株，需要5%以上的濃度。

本試驗(yàn)的氫氧化鈉各濃度中，均未能殺死試驗(yàn)菌株，說(shuō)明牛型結(jié)核分枝桿菌的耐堿性極強(qiáng)。在“結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程”中，規(guī)定在分離牛型結(jié)核分枝桿菌的試驗(yàn)中，常用2%氫氧化鈉處理樣品來(lái)除去雜菌[9]，我們發(fā)現(xiàn)20%氫氧化鈉處理12 h仍然不能有效殺死牛型結(jié)核分枝桿菌。

從本試驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，消毒劑的作用效果不但取決于消毒劑的濃度，也跟作用時(shí)間有關(guān)，我們?cè)趯?shí)踐中不但要保證消毒劑的濃度，也要確保消毒時(shí)間充足。這點(diǎn)對(duì)于養(yǎng)殖場(chǎng)人員進(jìn)出的消毒間尤為重要。

當(dāng)然消毒劑具有一定的腐蝕性，特別是高濃度的消毒液，對(duì)人的皮膚、黏膜、口腔、眼等有損害[3]，對(duì)人表面消毒時(shí)，要在消毒劑濃度和作用時(shí)間之間做出選擇，盡量選擇低濃度并且作用時(shí)間短的、對(duì)人損傷小的消毒劑。

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Study on the Germicidal Efficacy of Several Disinfectant onMycobacteriumBovis

GUO Jian-hua1， BAO Mei-juan1， WANG Juan1， LI Qian-yong1， CAO Zheng2

(1.Department of Veterinary Medicine，Southwest University，Chongqing 402460，China；2.Chongqing Auleon Biologicals Company Limited，Chongqing 402460，China)

In this study,we investigated the germicidal efficacy of compound phenol，sodium hydroxide and povidone-iodine onMycobacteriumbovisunder various concentration and incubation time.The isolates cultures were incubated with different concentration of the disinfectant(with the concentrations 20%，10%，5%，2%，1%，0.5%，0.2%，0.1% and 0.01% respectively).The incubation time were 10，20，30，60 min，1，2，6 h and 12 h respectively.The results showed that 0.2% Compound phenolic and above sterilized theMycobacteriumboviswith 12h incubation.1% povidone-iodine and above sterilized theMycobacteriumboviswith incubation time at least 6 h.However even 20% sodium hydroxide had no role in killingMycobacteriumboviswith 12 h.The results showed that compound phenolic and povidone-iodine could be used as disinfectant to purify the environment forMycobacteriumbovis.

Disinfectant ；Mycobacteriumbovis； Germicidal efficacy

CAO Zheng

2015-07-14

西南大學(xué)科研基金資助(08BSr04)

郭建華(1977-)，男，副教授，博士，從事微生物資源開(kāi)發(fā)與分子生物學(xué)研究工作，E-mail：guo0619@swu.edu.cn

曹政，E-mail：maodenghu@163.com

R 187.1

A

0529-6005(2016)10-0074-03