朱彩艷,江世貴,楊其彬,2,張殿昌,蘇天鳳,王 雨,2

(1中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所,廣州 510300;2中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心,海南 三亞 572018)

?

海南4個野生地理群體長肋日月貝AFLP分析

朱彩艷1,江世貴1,楊其彬1,2,張殿昌1,蘇天鳳1,王 雨1,2

(1中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所,廣州 510300;2中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心,海南 三亞 572018)

為了解長肋日月貝(Amusiumpleuronectes)種群遺傳結(jié)構(gòu),本研究應用6對引物,采用AFLP分子標記技術(shù)對中國海南4個野生群體(共134個個體)的長肋日月貝進行遺傳結(jié)構(gòu)分析.結(jié)果顯示,6對引物組合共擴增出203條擴增帶,平均每對引物組合產(chǎn)生33.8條擴增帶;擴增帶中的多態(tài)性位點共97條,多態(tài)位點所占比例為47.78%.統(tǒng)計分析了4個野生群體的多態(tài)性位點、群體Nei氏遺傳多樣性指數(shù)和Shannon’s 信息指數(shù)等,并進行了UPGMA聚類分析.結(jié)果表明,4個群體的群體Nei氏遺傳多樣性指數(shù)在0.0957～0.1 135之間,Shannon’s 信息指數(shù)均在0.1 493～0.1 769之間,4個群體的遺傳多樣性均偏低.陵水群體(LS)和三亞群體(SY)的多態(tài)性位點的比率均為40.89%,潭門群體(TM)的多態(tài)性位點比率最低,為34.4 8%;4個不同群體間遺傳距離都不大,SY與白馬井群體(BMJ)間遺傳距離最大,為0.0162,TM與BMJ間的遺傳距離最小,為0.0049;沒有發(fā)現(xiàn)群體特異性條帶.分析了各群體內(nèi)部的個體間遺傳距離,結(jié)果表明,BMJ、TM、LS和SY群體內(nèi)部的遺傳距離分別為0.1 217、0.1 065、0.1 212和0.1 179.AMOVA分析結(jié)果顯示,種群間的分化系數(shù)(Fst)為0.06834,基因流水平(Nm)為3.4 08.表明野生長肋日月貝的遺傳變異主要來自群體內(nèi)部,群體間的遺傳分化程度不大.另外,在長肋日月貝的種質(zhì)資源保護和良種繁育方面提出了建議.

長肋日月貝;AFLP;遺傳多樣性

0 引言

長肋日月貝(Amusiumpleuronectes)是扇貝科(Pectinidae)的一種經(jīng)濟貝類,是中國南方海區(qū)特有的優(yōu)質(zhì)食用貝類[1].其主要優(yōu)點在于個體較大,生長迅速,殼薄、閉殼肌發(fā)達.相對于殼重、生殖腺重等其他重量性狀,長肋日月貝的閉殼肌重與體重的相關關系最大,其對體重有極顯著的正相關關系[2].其出肉率高,甚至都超過了海灣扇貝(Argopectensirradias)優(yōu)質(zhì)品種“中科紅”[3].近年來長肋日月貝的資源量越來越少[4],已經(jīng)引起人們的重視.國外對于長肋日月貝的研究主要集中在繁殖發(fā)育生物學等方面[5-6].有學者研究了泰國長肋日月貝的線粒體DNA的多樣性[7],為長肋日月貝的育種提出了建議.近年來,我國已經(jīng)在長肋日月貝的人工繁殖技術(shù)取得了成功[4],但是很少有長肋日月貝種群遺傳結(jié)構(gòu)方面的研究,制約了長肋日月貝的種質(zhì)資源保護和良種繁育.

AFLP是一種高效分子標記技術(shù),已廣泛用于水產(chǎn)生物的遺傳育種研究[8-10],可為水產(chǎn)生物的種質(zhì)資源保護和優(yōu)良性狀品種的選育提供有力的技術(shù)指導.佟廣香等利用AFLP技術(shù)分析了我國野生哲羅魚(Huchotaimen)種質(zhì)資源的遺傳多樣性,認為增殖放流可以提高哲羅魚的資源量,增加其遺傳多樣性[11].潘潔等也利用AFLP技術(shù)分析了3個櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)群體的遺傳多樣性,指出可以通過引種提高我國櫛孔扇貝的遺傳多樣性[12].本研究采集了中國海南島的東部、西部和南部總共4個野生群體的長肋日月貝,利用AFLP分子標記技術(shù)對其種群遺傳結(jié)構(gòu)進行了分析.這對于摸清長肋日月貝野生種群的遺傳結(jié)構(gòu)有重要的意義,對于長肋日月貝的種質(zhì)資源保護和今后大規(guī)模開發(fā)提供有用的理論參考.

1 材料和方法

1.1 材料

實驗用4個野生長肋日月貝群體均來自中國海南島,分別為白馬井群體(BMJ)、潭門群體(TM)、陵水群體(LS)和三亞群體(SY). 4個群體采樣時間均為2008年3月，樣品規(guī)格相近,殼長平均7.8±1.2 cm,殼高平均8.0±1.3 cm.每個群體隨機選取31～37個個體(表1),采閉殼肌組織于-80℃冷凍保存.

表1 用于實驗分析的4個群體

1.2 基因組DNA提取

使用Tiangen公司生產(chǎn)的試劑盒,參照說明書進行DNA的提取.將獲得的DNA標準化為50 ng/μl,-20 ℃下保存?zhèn)溆?

1.3 AFLP分析方法

1.3.1 基因組DNA雙酶切

試驗中用于AFLP分析的內(nèi)切酶是EcoR I和MseI,均為NEB公司生產(chǎn).反應體系為300ng DNA中加入10 U EcoR I酶和2 U Mse I酶,酶切反應在37 ℃下進行4.5 h.

1.3.2 接頭的制備及連接

接頭序列和擴增引物序列見表2. EcoR I的兩條接頭和Mse I的兩條接頭在使用前分別兩兩混合,95 ℃變性5 min,室溫下自然冷卻,以形成雙鏈結(jié)構(gòu),供連接使用.連接反應在1 U T4 DNA連接酶(TAKARA公司生產(chǎn))的催化下,于16℃反應18 h.

表2 AFLP分析用的接頭與引物序列

1.3.3 PCR擴增

預擴增反應體系為,10× rTaq buffer 2.5 μl,連接產(chǎn)物4μl,EcoRI和MseI預擴增引物各0.2 μl(250 ng/μl), dNTPs(2mM each) 3μl,rTaq 酶 (5U/μl )0.3 μl,補足ddH2O至25μl;反應中反應條件為, 94℃ 預變性3 min, 94℃ 變性30 s, 56℃ 退火30 s,72℃ 延伸30 s,循環(huán)24次,72℃終止延伸10 min, 4℃ 保存.將預擴增產(chǎn)物稀釋5倍作為選擇性擴增的模板.選擇性擴增反應體系為, 10× rTaq buffer 2.0μl,稀釋后的預擴增產(chǎn)物1μl,EcoRI和MseI選擇性擴增引物各2.0μl(100ng/μl), dNTPs(2mM each) 1.5 μl, rTaq 酶 (5U/μl )0.1 μl,補足ddH2O至20μl;反應條件為94℃預變性3 min, 94℃變性30 s, 65℃ 退火30 s, 72℃延伸1 min,循環(huán)9次,每個循環(huán)退火溫度降低0.9℃;94℃ 變性30 s, 56℃ 退火30s, 72℃ 延伸1 min,循環(huán)24次, 72℃終止延伸10 min, 4℃ 保存. 2%瓊脂糖電泳,120 V,15 min檢測PCR產(chǎn)物.

1.3.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳

取5μl選擴產(chǎn)物與等體積的2×上樣緩沖液充分混勻,95℃變性5 min后,迅速置于冰上.點樣2μl,在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳,儀器為BioRad3000型電泳儀,電泳前進行30 min預電泳,之后120W恒功率電泳80 min.銀染法染色,室溫下自然干燥,數(shù)碼相機拍照并保存圖像.

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)所獲得的AFLP聚丙烯酰胺凝膠電泳膠圖,統(tǒng)計多樣性位點比率,并采用POPGENE3.2 軟件計算該種群內(nèi)部平均觀測等位基因數(shù)、平均有效等位基因數(shù)、平均基因多樣性指數(shù)以及Shannon’s多樣性信息指數(shù),分析種群內(nèi)遺傳距離.然后根據(jù)遺傳距離表,采用MEGA軟件構(gòu)建遺傳距離聚類圖,方法為不加權(quán)成對算術(shù)平均法[9].對4個群體的數(shù)據(jù)用Arlequin軟件進行分子方差分析(AMOVA分析).

2 結(jié)果

2.1 AFLP擴增多態(tài)性

圖1 E6-M6引物組合在三亞群體中擴增(最右一列為marker)

6對引物組合的擴增片段大小主要在50～400bp左右(圖1).使用的6對引物組合共產(chǎn)生了203條擴增帶,平均每對引物組合產(chǎn)生33.8條擴增帶,擴增帶中的多態(tài)性位點97條,多態(tài)位點占擴增帶比例為47.78%.多態(tài)位點百分率最高的一對引物組合是E8-M8(64.9%).見表3.

表3 六對AFLP引物組合的擴增

2.2 各群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性

長肋日月貝4個群體內(nèi)的遺傳多樣性參數(shù)見表4.結(jié)果表明,4個群體的群體Nei氏遺傳多樣性指數(shù)在0.0957～0.1 135之間,Shannon’s信息指數(shù)均在0.1 493～0.1 769之間,4個群體的遺傳多樣性均偏低.

陵水群體(LS)和三亞群體(SY)的多態(tài)性位點的比率均為40.89%,潭門群體(TM)的多態(tài)性位點比率最低,為34.4 8%.研究中沒有發(fā)現(xiàn)群體特異性條帶.

表4 長肋日月貝4個群體內(nèi)遺傳多樣性參數(shù)

2.3 群體間遺傳相似度和遺傳距離

統(tǒng)計結(jié)果表明,BMJ群體和SY群體的遺傳距離最大,為0.0162,遺傳相似度為0.9840; BMJ群體和TM群體的遺傳距離最小,為0.0049,遺傳相似度為0.9952(表5).而LS和SY群體的遺傳相似度為0.9925,遺傳距離也較小.

對各群體內(nèi)部的個體間遺傳距離進行了分析,結(jié)果表明,BMJ、TM、LS和SY群體內(nèi)部的遺傳距離分別為0.1 217、0.1 065、0.1 212和0.1 179,均高于群體間的遺傳距離.這表明野生長肋日月貝的遺傳變異主要來自群體內(nèi)部,群體間的遺傳分化程度不大.

表5 長肋日月貝4個群體的群體間相似度和遺傳距離矩陣

注:對角線以上數(shù)值為遺傳相似度;對角線以下數(shù)值為遺傳距離.

圖2 長肋日月貝4個群體的UPGMA聚類圖(標尺為遺傳距離)

4個群體的聚類分析見圖2.從圖2中也可以看出,BMJ和TM群體的遺傳距離最小,聚在一起;LS和SY群體聚在一起,表明遺傳相似度較高.總的看來,4個群體的分化不明顯,群體間的遺傳相似度均較高,其差異明顯處于種內(nèi)地理群水平.

對4個群體的數(shù)據(jù)進行AMOVA分析,結(jié)果顯示,種群間的分化系數(shù)(Fst)為0.06834,基因流水平(Nm)為3.4 08.同樣說明長肋日月貝4個群體的變異主要來自群體內(nèi)部,群體間的基因交流較為頻繁,未形成明顯分化.

3 討論與結(jié)論

培育貝類新品種、新品系和保護現(xiàn)有的優(yōu)良種質(zhì)資源是目前擺在我國貝類育種方面的重要課題.海南近年來海域污染對生物多樣性也造成了一定的影響[13].了解貝類新品種的遺傳多樣性狀況,種群遺傳結(jié)構(gòu),有助于建立清晰的親體管理策略,做到對現(xiàn)有的種質(zhì)資源進行合理、有效、可持續(xù)性地開發(fā)利用.

王雨等分析了野生長肋日月貝形態(tài)性狀和重量性狀的內(nèi)在關系,結(jié)果表明,殼高與長肋日月貝的體重和閉殼肌重關系密切.在日月貝的人工育苗或者育種時,不需要測量殼長、殼寬、體重等其他形態(tài)和重量指標,只要選擇殼高較大的個體,就可以快捷方便挑選出具有較大閉殼肌等主要食用部分的優(yōu)良性狀個體,便于親本的選擇[3].

目前,我國長肋日月貝的人工繁殖尚未大規(guī)模開展,天然捕撈到的長肋日月貝可以認定為野生種.本研究利用AFLP分子標記技術(shù),采用6對引物,從多態(tài)位點、Nei氏遺傳多樣性指數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)、遺傳距離和遺傳相似度等方面對中國海南4個野生群體進行了遺傳多樣性分析.結(jié)果表明,多態(tài)位點百分率最高的是LS和SY群體(均為40.89%),多態(tài)位點百分率最低的是TM群體(34.4 8%).研究中沒有發(fā)現(xiàn)群體特異性條帶.4 個野生群體之間的遺傳相似度均高于0.98,說明4個群體之間的基因流動比較頻繁,特別是SY和LS群體以及BMJ和TM群體之間的遺傳相似度超過0.99,說明他們?nèi)后w之間的基因流動更加頻繁.

Hare等(1996)在對美洲牡蠣(Crassostreavirginica)的研究中發(fā)現(xiàn),幼蟲浮游生活時間較長的貝類,不同地理群體間會有一定幅度的基因流動[14].長肋日月貝從D形幼蟲發(fā)育至眼點期幼蟲需要11～15 d,從眼點期到附著完畢最多10 d[4],也就是說,長肋日月貝的浮游期最長可達25 d.而海南島受到季風等的影響,周圍海流復雜而多變,部分浮游幼體可隨海流產(chǎn)生地理漂移,因而造成基因的流動,這可能是造成群體間遺傳相似性較高的原因之一.

長肋日月貝4個群體的群體Nei氏遺傳多樣性指數(shù)在0.0957～0.1 135之間,Shannon’s信息指數(shù)均在0.1 493～0.1 769之間,4個群體的遺傳多樣性均偏低.據(jù)調(diào)查,近年來長肋日月貝的資源量越來越少[4],這可能是導致各群體遺傳多樣性偏低的另一個原因.較低的遺傳多樣性,使得種群結(jié)構(gòu)趨向單一化,物種的適應能力也降低,大大增加種群面臨滅絕的危險.

雜交是育種中最為簡便、有效的途徑之一.一般地說,不同群體之間,由于地理距離較遠或者存在某些天然屏障,種群之間的某些基因存在表達差異.因此,不同種群之間進行物種雜交可以獲得較大的雜種優(yōu)勢.有研究表明,3個野生種群的馬氏珠母貝(Pinctadamartensii)在繁育過程中,雜交子一代的遺傳多樣性高于各種群自繁子一代[15].本研究表明,長肋日月貝的群體間遺傳距離小于群體內(nèi)部的遺傳距離,因此,今后在長肋日月貝的育種方面,可以采用分子標記和優(yōu)良性狀的篩選(如殼高等)相結(jié)合的方法進行優(yōu)質(zhì)苗種的繁育.首先利用分子標記技術(shù)掌握不同地理群體之間個體的遺傳多樣性水平,進而嘗試利用不同地理群體間具有優(yōu)良性狀的個體進行雜交,以提高后代的遺傳多樣性,獲得較大的雜種優(yōu)勢.

今后,還需要對國內(nèi)外長肋日月貝種質(zhì)資源的遺傳多樣性進行評估,以期找出遺傳距離較大的種群,進行引種雜交,提高本地種群的遺傳多樣性.另外,加強長肋日月貝的育種技術(shù)研究,并建立長肋日月貝的原種場和種質(zhì)庫,也是保護種質(zhì)資源的重要措施.一方面可以維持長肋日月貝的遺傳多樣性,另外還能利用分子生物學手段選擇雜合度較高的個體進行苗種繁殖,避免群體自繁引起遺傳多樣性的降低.

[1]王禎瑞.中國動物志[M].北京:中國科學出版社, 2002.

[2]王雨,葉樂,陳旭等.海南野生長肋日月貝形態(tài)性狀與重量性狀的通徑分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學, 2009, 37(8):3570-3572.

[3]朱彩艷,王雨,張殿昌,等.長肋日月貝的營養(yǎng)成分分析及評價[J]. 海洋科學, 2011,35(3):87-91

[4]王雨,葉樂,楊其彬,等.長肋日月貝個體發(fā)生觀察及人工育苗初步試驗[J].南方水產(chǎn), 2009, 5(1):36-41.

[5]Belda C A, Del Norte A G C. Notes on the Induced Spawning and Larval Rearing of the Asian Moon Scallop,Amusiumpleuronectes(Linne), in the laboratory[J]. Aquaculture, 1988(72):173-179．

[6]Rice M A, Rheault R B, Perez M S, Perez V S. Experimental Culture and Particle Filtration by Asian Moon Scallops,Amusiumpleuronectes[J]. Asian Fisheries Science, 1994(7):179-185.

[7]Mahidol C, Na-Nakorn U, Sukmanomon S, et al. Mitochondrial DNA Diversity of the Asian Moon Scallop,Amusiumpleuronectes(Pectinidae), in Thailand[J]. Marine Biotechnology, 2007(9):352-359.

[8]赫崇波,叢林林,葛隴利,等.文蛤養(yǎng)殖群體和野生群體遺傳多樣性的AFLP分析[J].中國水產(chǎn)科學, 2008, 15(2):215-221.

[9]張東,隋正紅,易恒,等.青島裙帶菜孢子體野生種群遺傳多樣性的AFLP分析[J].中國海洋大學學報, 2009, 39(4):664-668.

[10]許志強,葛家春,曹廷,等.江蘇3個秀麗白蝦野生群體遺傳多樣性的AFLP分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)學報, 2009, 25(1):160-164.

[11]佟廣香,匡友誼,尹家勝.野生哲羅魚種質(zhì)資源遺傳多樣性的AFLP分析[J].中國水產(chǎn)科學, 2009, 16(6):833-841.

[12]潘潔,包振民,趙洋,等.櫛孔扇貝不同地理群體的遺傳多樣性分析[J].高技術(shù)通訊, 2002(12):78-82.

[13]賀立靜,周述波,李曉梅,等.海南近岸海域污染現(xiàn)狀及對生物多樣性影響[J].瓊州學院學報,2014, 21(5):99-103.

[14]Hare M P and Avise J C.. Molecular Genetic Analysis of a Stepped Multilocus Cline in the American Oyster (Crassostreavirginica) [J]. Evolution, 1996, 50(6):2305-2315.

[15]呂林蘭,杜曉東,王嫣,等.馬氏珠母貝3個野生種群及種群間雜交后代遺傳多樣性的ISSR分析[J].水生生物學報, 2008, 32(1):26-32.

(編校：何軍民)

Genetic Diversity of Four Hainan WildAmusiumpleuronectesPopulations Revealed by AFLP Markers

ZHU Cai-yan1, JIANG Shi-gui1, YANG Qi-bin1,2, ZHAGN Dian-chang1, SU Tian-feng1, WANG Yu1,2

(1 South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China;2 Tropical Fishery R&D Center, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences,Sanya Hainan, 572018, China)

The genetic diversity ofAmusiumpleuronectesin China is not clear at present. By using AFLP markers, the current research investigated the genetic diversity of four wild populations (Baimajing (BMJ), Tanmen (TM), Lingshui (LS), Sanya (SY)) ofAmusiumpleuronectesin Hainan Province of China. A total of 203 bands were detected with 6 primers combinations, and there were 97 polymorphic loci among them (percentage:47.78%). The Nei’s gene diversity index and Shannon’s information index of the 4 populations were analyzed. Results showed that, Nei’s gene diversity index and Shannon’s information index of the 4 populations are among 0.0957～0.1 135 and 0.1 493～0.1 769 respectively, indicating low genetic diversity of the 4 populations. The ratio of polymorphic loci is high in LS and SY populations (both were 40.89%) and low in TM population (34.4 8%). The genetic distances between the 4 populations are not more than 0.0162 (max:SY-BMJ 0.0162; min:TM-BMJ 0.0049). No population-specific bands were investigated. The genetic distances within populations in BMJ, TM, LS and SY populations are 0.1 217, 0.1 065, 0.1 212 and 0.1 179, respectively. Result of AMOVA analysis showed Fst=0.06834 and Nm=3.4 08. It indicated that the genetic differentiations between populations are lower than those within populations. Some suggestions in germplasm conservation and breeding were discussed in this paper.

Amusiumpleuronectes; AFLP; genetic diversity

2016-03-09

海南省社會發(fā)展科技專項(2011SF014);國家科技基礎平臺建設項目(2005DKA30470-007);中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資助項目(2007TS06)

朱彩艷(1979-),女,山東省青島市人,中國水產(chǎn)科學院南海水產(chǎn)研究所助理研究員,碩士,研究方向為水產(chǎn)動物遺傳育種研究.

王雨(1967-),女,湖南省衡陽市人,中國水產(chǎn)科學院南海水產(chǎn)研究所副研究員,研究方向為海水養(yǎng)殖與生態(tài)學.

S917

A

1008-6722(2016) 02-0099-06

10.1 3307/j.issn.1 008-6722.2 016.02.2 0