田永芝，王亞麗，孫茹，趙婧，劉群，王晨曉，馬艷，蔡梅超

山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355

·中藥研究與開發(fā)·

響應(yīng)面法優(yōu)化川楝子總黃酮的提取工藝

田永芝，王亞麗，孫茹，趙婧，劉群，王晨曉，馬艷，蔡梅超

山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355

目的 優(yōu)化川楝子總黃酮提取工藝。方法 以總黃酮提取率為響應(yīng)值，考察料液比、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)3個(gè)因素對(duì)川楝子總黃酮提取率的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法中的Box-Behnken模式對(duì)川楝子總黃酮的提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化分析。結(jié)果 川楝子總黃酮提取的最優(yōu)工藝條件為料液比1∶35、提取時(shí)間3.0 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%。在此條件下總黃酮的提取率為0.587 3%。結(jié)論 實(shí)測(cè)值與響應(yīng)面法回歸模型高度擬合，使用該方法能合理優(yōu)化川楝子總黃酮的提取工藝。

川楝子；總黃酮；響應(yīng)面法；提取工藝

川楝子為楝科植物川楝Melia toosendan Sieb. et Zucc的干燥果實(shí)，具有舒肝、行氣止痛、驅(qū)蟲作用，常用于治療胸脅、脘腹脹痛、疝痛、蟲積腹痛等癥[1]。主要產(chǎn)于四川、貴州、陜西、湖北、湖南等地。有報(bào)道表明，川楝子含有黃酮類化合物[2]，而天然植物中的黃酮類化合物具有極為廣泛的生理活性。本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化川楝子總黃酮的提取工藝，為進(jìn)一步開發(fā)川楝子藥用資源提供參考。

1 儀器與試藥

川楝子（購(gòu)自四川，干燥，粉碎，過(guò)40目篩，備用），經(jīng)馬艷老師鑒定為楝科植物川楝Melia toosendan Sieb. et Zucc的果實(shí)。蘆丁對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)10080-200707），無(wú)水乙醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），蒸餾水。UV9100B型紫外可見光光度計(jì)（萊伯泰科），賽多利斯BT25S型分析天平等。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

取干燥的蘆丁對(duì)照品11 mg，精密稱定，用適量70%乙醇，在超聲波下使其溶解，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)至25 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，即得0.44 g/L的對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

將川楝子用石油醚回流脫脂2次，每次2 h，抽濾，將石油醚揮干，稱取一定量脫脂后的川楝子，按一定料液比加一定濃度的乙醇，回流提取一定時(shí)間，濾渣重復(fù)提取1次，合并提取液，旋蒸乙醇至近干，用70%乙醇溶液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，定容，抽濾，濾液旋干，用70%乙醇定容至50 mL容量瓶中，備用。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.5、0.7、1.0、1.2、1.5 mL于10 mL比色管中，各加70%乙醇溶液，使之成為5.0 mL，先加5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再加10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再加4%NaOH溶液4.0 mL，最后加70%乙醇溶液至10.0 mL，放置15 min顯色。用分光光度計(jì)于510 nm波長(zhǎng)分別測(cè)定吸光度[3]，經(jīng)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，分析得回歸方程A＝11.325C＋0.000 3，r2＝0.998，表明在0.017 6～0.061 8 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法顯色，測(cè)定，并計(jì)算總黃酮提取率（Y）。Y＝C×10÷V1× V÷1000 m×100%。式中：V1為吸取體積（mL），V為提取液體積（mL），m為川楝子樣品質(zhì)量（g），C為顯色的總黃酮濃度（mg/mL）。結(jié)果RSD＝1.89%。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法顯色，分別在0、1、2、3、4 h，測(cè)定并計(jì)算總黃酮提取率，結(jié)果RSD＝2.36%。

2.4.3 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的供試品溶液6份，分別加入已知量的對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下方法顯色，測(cè)定，并計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為98.75%，RSD＝2.85%。

2.5 單因素試驗(yàn)

2.5.1 料液比 取5.0 g脫脂后的川楝子5份，精密稱定，按料液比1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45，用70%乙醇溶液回流提取2.0 h，按“2.2”項(xiàng)下方法提取定容后，按“2.3”項(xiàng)下方法顯色測(cè)定吸光度并計(jì)算提取率，結(jié)果見圖1?？芍?，在乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間一定的條件下，料液比為1∶25～1∶35時(shí)提取率逐漸上升，在1∶35時(shí)達(dá)到最大值，隨后出現(xiàn)下降趨勢(shì)，故料液比以1∶35為宜。

2.5.2 乙醇體積分?jǐn)?shù) 取5.0 g脫脂后的川楝子5份，精密稱定，按料液比1∶25，分別用60%、65%、70%、75%、80%乙醇回流提取2.0 h，按“2.2”項(xiàng)下方法提取定容后，按“2.3”項(xiàng)下方法顯色測(cè)定吸光度并計(jì)算提取率，結(jié)果見圖2?？芍?，在料液比和提取時(shí)間一定的條件下，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，川楝子總黃酮提取量先增后減，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)70%時(shí)黃酮提取量最大，故最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.5.3 提取時(shí)間的選擇 取5.0 g脫脂后的川楝子5份，精密稱定，按料液比1∶25、70%乙醇溶液回流提取時(shí)間分別為1.5、2、2.5、3、3.5 h，按“2.2”項(xiàng)下方法提取定容后，按“2.3”項(xiàng)下方法顯色測(cè)定吸光度并計(jì)算提取率，結(jié)果見圖3?？芍?，在乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比一定的條件下，提取率隨提取時(shí)間的增加而增加，在提取時(shí)間為3.0 h時(shí)，川楝子總黃酮提取率最高，故提取時(shí)間以3.0 h為宜。

圖1 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

圖3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

2.6.1 模型建立及顯著性試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以液料比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、提取時(shí)間（C）為自變量，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，通過(guò)Design Expert 8.0.3軟件設(shè)計(jì)3因素3水平的二次回歸分析，預(yù)測(cè)川楝子總黃酮提取的最佳工藝[4]。響應(yīng)面分析因素與水平見表1，響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，響應(yīng)面回歸模型的方差分析見表3。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

表2 響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 響應(yīng)面回歸模型的方差分析

采用響應(yīng)面法分析試驗(yàn)結(jié)果，得到以總黃酮提取率為響應(yīng)值的回歸方程：總黃酮提取率＝0.61＋0.012A＋7.712E-003B－6.312E-003C＋0.014AB＋0.013AC＋2.075E-003BC－0.018A2－0.035B2－0.038C2。對(duì)二項(xiàng)式進(jìn)行計(jì)算，得出川楝子總黃酮的最佳提取條件：料液比1∶37，乙醇體積分?jǐn)?shù)70.95%，提取時(shí)間3.0 h?？紤]到實(shí)際因素，提取條件為料液比1∶35、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取時(shí)間3.0 h。

由方差分析可知，以總黃酮提取率為響應(yīng)值時(shí)，模型P＝0.029 99＜0.05，表明該二次方程模型顯著。而失擬項(xiàng)P＝0.155 4表示失擬項(xiàng)不具顯著性[5]。

2.6.2 響應(yīng)曲面分析 利用Design Expert軟件得到二次回歸方程的等高線及響應(yīng)面圖（見圖4～圖6），根據(jù)二次模型得到的等高線及響應(yīng)曲面可以評(píng)價(jià)試驗(yàn)因素之間的交互強(qiáng)度，以確定因素最佳提取范圍。

由圖4可知，當(dāng)提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)保持不變時(shí)，提取率隨料液比的增大而先緩慢增大后減小，這是因?yàn)楫?dāng)擴(kuò)散達(dá)到平衡時(shí)，提取劑增量不會(huì)促進(jìn)黃酮的提取，反而使之后的濃縮更為困難。等高線呈橢圓形說(shuō)明料液比與乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用明顯。

圖4 料液比和體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖

圖5 料液比和提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖

圖6 體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖

由圖5可知，當(dāng)料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)保持不變時(shí)，提取率隨提取時(shí)間的增加先增后減。提取時(shí)間的延長(zhǎng)則使大量水溶性物質(zhì)溶出，提取液變黏稠而對(duì)黃酮產(chǎn)生吸附作用，導(dǎo)致黃酮不能快速擴(kuò)散析出，在大約3 h時(shí)達(dá)到最大值，與單因素試驗(yàn)結(jié)果相同，等高線呈橢圓形說(shuō)明料液比與提取時(shí)間交互作用明顯。

由圖6可知，當(dāng)提取時(shí)間和料液比不變時(shí)，提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大先增后減，由于乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時(shí)黃酮類物質(zhì)溶解度較低，而蛋白質(zhì)、糖類等易溶于水的物質(zhì)會(huì)被提取出來(lái)，導(dǎo)致提取率降低，乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高而產(chǎn)生較大滲透壓，使黃酮溶解性降低。曲線平滑說(shuō)明提取時(shí)間對(duì)得率影響較小，等高線呈圓形說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間交互作用不明顯。

2.6.3 模型驗(yàn)證 通過(guò)軟件分析計(jì)算得出理論最佳提取工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)70.95%，料液比1∶37，提取時(shí)間3.0 h，在此條件下的黃酮提取率為0.611 0%。

2.7 樣品測(cè)定

精密量取待測(cè)液1.0 mL于10 mL比色管中按“2.3”項(xiàng)下方法顯色，測(cè)定，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算得出總黃酮含量為0.587 3%，見表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法考察了料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間對(duì)川楝子總黃酮提取率的影響，建立了川楝子總黃酮提取率的多元回歸模型，模型擬合度良好。確定了黃酮最佳提取條件：料液比1∶35，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時(shí)間3.0 h。在此條件下，黃酮得率可達(dá)0.611%。單因素影響順序?yàn)榱弦罕龋倔w積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間。黃酮提取率的實(shí)際值與預(yù)測(cè)值相差僅0.023%，說(shuō)明運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化川楝子總黃酮提取工藝條件是有效的，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，為川楝子總黃酮的提取提供了一定的參考。

響應(yīng)面法雖然試驗(yàn)次數(shù)相對(duì)較多，但能把各影響因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系函數(shù)化，建立連續(xù)變量曲面模型，考察因素不局限于所限制的水平，比傳統(tǒng)正交試驗(yàn)方法更直觀、更精確。因此，該優(yōu)化提取方法可在川楝子黃酮提取工藝研究及生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

[1] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典(上)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1993：232-233.

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Optimization of Extraction Process of Flavonoids from Toosendan Fructus by Response

Surface Methodology

TIAN Yong-zhi, WANG Ya-li, SUN Ru, ZHAO Jing, LIU Qun, WANG Chen-xiao,

MA Yan, CAI Mei-chao (College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China)

Objective To optimize extraction process of flavonoids from Toosendan Fructus. Methods Three parameters that significantly affect the extraction rate of flavonoids, ratio of material to water, extraction time and ethanol concentration, were taken into consideration for extraction ratio of flavonoids from Toosendan Fructus. Based on the results of single-factor experiment, the extraction parameters of flavonoids from Toosendan Fructus were optimized by Box-Behnken of response surface methodology (RSM). Results The optimum extraction conditions were as follow: material to water ratio was 1:35; extraction time should be 3 h; ethanol concentration was 70%. The extraction ratio was up to 0.587 3% in the optimum extraction conditions. Conclusion The actual value is highly matching the theoretically value of RSM model. The results indicated that this method can rationally optimize extraction process of flavonoids from Toosendan Fructus.

Toosendan Fructus; flavonoids; response surface methodology; extraction process

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.020

R284.2

A

1005-5304(2016)04-0076-04

2015-05-14）

（

2015-06-10；編輯：陳靜）

山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2011-016）；山東中醫(yī)藥大學(xué)SRT項(xiàng)目（2015125）

馬艷，E-mail：sdutcmyaohua@163.com