趙智穎, 李良秋, 馬連營, 游雪嬌

廣東省微生物研究所, 省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室; 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室, 廣州 510070

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生物膜定量分析方法研究進(jìn)展

趙智穎, 李良秋*, 馬連營, 游雪嬌

廣東省微生物研究所, 省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室; 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室, 廣州 510070

生物膜因具有強(qiáng)致病性、耐藥性和抗逆性，已成為全球關(guān)注的重大難題。介紹了生物膜生物量、細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)、大分子物質(zhì)和結(jié)構(gòu)的定量分析方法，以期為深入研究生物膜提供更豐富的手段，推動生物膜定量分析方法的改進(jìn)與提高，從而更好地預(yù)防、控制及開發(fā)生物膜。

生物膜; 定量; 檢測

生物膜是指微生物粘附于接觸表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白和脂質(zhì)蛋白等，將其自身包繞其中而形成的大量菌體聚集膜樣物，是微生物在自然界的普遍存在方式之一[1]。生物膜廣泛存在于工業(yè)管道、通風(fēng)設(shè)備、食品生產(chǎn)設(shè)備、自來水管道、醫(yī)療器械甚至病理狀態(tài)下的人體組織器官中，絕大多數(shù)微生物在一定的條件下都可以形成生物膜[2]。生物膜在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化特征、對環(huán)境因子的敏感性等方面都與浮游狀態(tài)存在顯著的差異，造成其致病性、耐藥性、抗逆性大大增強(qiáng)[3]。從而導(dǎo)致了生物膜在醫(yī)療、食品、工業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)等諸多領(lǐng)域給人類社會帶來了嚴(yán)重危害，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時也嚴(yán)重威脅著人類健康。目前，生物膜已成為全球關(guān)注的重大難題之一，越來越受到各國學(xué)者的重視，在近30年的研究中也取得了很大的進(jìn)展。對生物膜的研究，首先要依賴于快速、靈敏、特異的分析檢測方法。目前針對生物膜的檢測方法不再局限于單純定性的層面，大量針對生物膜定量檢測的方法被報道。而生物膜生物量、細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)、大分子物質(zhì)和結(jié)構(gòu)是生物膜研究中的重要指標(biāo)，常應(yīng)用于生物膜活性、耐藥性、抗性、成膜能力等研究中。本文就生物膜生物量、細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)、大分子物質(zhì)和結(jié)構(gòu)的定量分析方法作一綜述，以期為更加深入研究生物膜提供更豐富的手段。

1 生物膜生物量的定量分析方法

生物膜生物量包含了菌體和細(xì)胞外多聚物(EPS)，通過結(jié)晶紫染色法、稱量生物膜干重/生物膜揮發(fā)性干重、測定生物膜總有機(jī)碳含量等方法，均可對生物膜生物量進(jìn)行檢測。

1.1 結(jié)晶紫(crystal violet,CV)染色法

結(jié)晶紫是一種堿性三苯甲烷染料，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)和細(xì)菌學(xué)等方面，是一種優(yōu)良的染色劑。其苯環(huán)上帶有發(fā)色基團(tuán)和助色基團(tuán)，發(fā)色基團(tuán)使化合物在紫外及可見光區(qū)域內(nèi)有吸收，助色基團(tuán)在溶液中可發(fā)生電離，其分子的染色部分為帶正電荷的陽離子，因而很容易與通常帶負(fù)電荷的細(xì)菌結(jié)合使細(xì)菌著色[4]。生物膜內(nèi)細(xì)菌和胞外多聚物可與結(jié)晶紫結(jié)合[5]，因此可通過結(jié)晶紫染色對生物膜進(jìn)行半定量檢測。該方法由Christensen等[6]首次提出，研究者們在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了修改，以期提高其精確度與擴(kuò)大其應(yīng)用范圍[7]。Monteiro等[8]研究了納米銀對白色念珠菌(Candidaalbicans)和光滑念珠菌(Candidaglabrata)生物膜形成的影響，結(jié)晶紫染色結(jié)果表明念珠菌生物膜經(jīng)納米銀作用5 h后，生長過程中(24 h)和成熟(48 h)的生物膜生物量均顯著降低，而不同階段生物膜的生物量無顯著差異。另外，番紅染色、剛果紅染色也可用于生物膜的半定量檢測[9, 10]，其檢測方法與結(jié)晶紫染色類似。

1.2 干重(dry mass,DM)/揮發(fā)性干重(ash-free dry mass,AFDM)

采用機(jī)械、超聲等物理方法將生物膜剝落后，經(jīng)0.4 μm濾膜過濾，將濾膜置于105℃烘箱內(nèi)干燥至恒重，干燥前后的重量差為生物膜干重。生物膜干重是生物膜研究中較為常用的定量分析指標(biāo)[11]。

生物膜干重反映的是生物膜總量，而生物膜揮發(fā)性干重可以反應(yīng)生物膜中有機(jī)組分的含量。在測量生物膜干重后，將樣品550℃灼燒至恒重，重量的差值為揮發(fā)性生物膜干重。在生物膜研究中，為獲得更準(zhǔn)確的生物量信息，常常選用生物膜揮發(fā)性干重作為測量指標(biāo)[12]。

1.3 總有機(jī)碳含量(total organic carbon,TOC)

細(xì)胞骨架主要由有機(jī)碳組成，測定生物膜總有機(jī)碳含量(TOC)可間接反映生物膜量的變化。特別是對于硝化生物膜等增長緩慢、生物膜量較少、不便用干重法進(jìn)行測量的微生物，生物膜TOC分析更具準(zhǔn)確性。TOC測定的基本原理是先將總有機(jī)碳氧化成二氧化碳，然后由檢測器測定氧化生成的二氧化碳含量，再由數(shù)據(jù)處理把二氧化碳?xì)怏w含量換算成TOC值。目前，TOC的分析已經(jīng)儀器化，按工作原理不同，可分為濕法氧化(過硫酸鹽)-非色散紅外探測(NDIR)、高溫催化燃燒氧化-非色散紅外探測(NDIR)、紫外氧化(UV)-濕法(過硫酸鹽)氧化-非色散紅外探測(NDIR)、電阻法、紫外法、電導(dǎo)法、臭氧氧化法、超聲空化聲致發(fā)光法等[13]。生物膜會導(dǎo)致納濾膜(NF)和反滲透膜(RO)性能的下降，Dreszer等[14]通過測定生物膜TOC值發(fā)現(xiàn)高水流流速和原水導(dǎo)流網(wǎng)可導(dǎo)致生物膜生物量的增加。

2 生物膜細(xì)胞總數(shù)的定量分析方法

2.1 SYTO9染色法

SYTO9染料是可穿透原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的細(xì)胞膜，與DNA或RNA結(jié)合的核酸熒光染料。它對死細(xì)胞和活細(xì)胞均可進(jìn)行染色[15]，因而結(jié)合激光共聚焦掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscope，CLSM)可對細(xì)菌和酵母生物膜菌體總數(shù)進(jìn)行定量檢測。其最大激發(fā)波長為483 nm，最大發(fā)射波長為503 nm，激發(fā)后發(fā)綠色熒光。SYTO9染色法操作簡單，檢測時間短，且不受細(xì)菌類群的影響。Goncalves等[16]利用SYTO9對添加不同碳源進(jìn)行培養(yǎng)的白色念珠菌生物膜進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)碳源對生物膜生物量有顯著影響，添加蔗糖或葡萄糖作為碳源后，白色念珠菌菌體總量顯著增加。

2.2 吖啶橙(acridine orange)染色法

吖啶橙是一種三環(huán)芳香類陽離子型堿性熒光染料，它可嵌入雙鏈DNA的雙鏈堿基對，也可與單鏈核酸發(fā)生靜電吸引而堆積在其磷酸根上[17]。吖啶橙最大激發(fā)波長為492 nm，當(dāng)其與DNA或RNA結(jié)合時，最大發(fā)射波長分別為530 nm(綠色)和640 nm(紅色)。細(xì)菌經(jīng)吖啶橙染色后，在熒光顯微鏡或CLSM下觀察，處于靜止期或不活躍狀態(tài)的細(xì)菌，由于其核酸主要為雙鏈DNA，因而產(chǎn)生綠色熒光；死菌核酸被破壞為單鏈DNA，因而發(fā)出橙紅色熒光；而處于高速生長期的活菌的核酸主要為RNA，也呈現(xiàn)出紅色熒光[18]。因此，吖啶橙不能準(zhǔn)確區(qū)分死活細(xì)菌，但可用于細(xì)菌總數(shù)的定量測定。Stiefel等[19]比較了6種清潔劑對綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和金黃色葡萄球菌生物膜的清除作用，通過吖啶橙染色對其細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行測定，其中一種新型清潔劑X對生物膜的清除作用最為顯著。

2.3 實時熒光定量PCR技術(shù)(Real-time quantitative PCR, RT-qPCR)

RT-qPCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)中加入熒光基團(tuán)，根據(jù)熒光信號的累積，對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化進(jìn)行實時檢測，通過循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct值)和標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始模板進(jìn)行定量分析的方法[20]。RT-qPCR技術(shù)克服了結(jié)晶紫染色法、XTT減低法等傳統(tǒng)方法不能區(qū)分復(fù)合生物膜中不同種細(xì)菌的缺點，其可對生物膜進(jìn)行種特異性的定量分析，并且可以用于生物膜變化過程中相關(guān)基因的研究，具有靈敏度高、精確性高、重復(fù)性好等特點。Karched等[21]對6種牙周細(xì)菌分別進(jìn)行了單一菌株生物膜、復(fù)合生物膜和浮游狀態(tài)的培養(yǎng)。RT-qPCR結(jié)果表明：6種牙周細(xì)菌培養(yǎng)8 d后均可在缺乏先鋒細(xì)菌的情況下形成生物膜；大部分菌株的單一菌株生物膜和混合生物膜的生物量比浮游狀態(tài)下的生物量少；而在混合生物膜中，牙齦卟啉單胞菌的生物量比其他牙周細(xì)菌的生物量高。

3 生物膜活細(xì)胞數(shù)的定量分析方法

3.1 平板菌落計數(shù)法

平板菌落計數(shù)法是將生物膜經(jīng)超聲或震蕩，使其充分分散成單個細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮液稀釋到合適濃度，取一定量的稀釋液接種到平板上，經(jīng)培養(yǎng)，每個單細(xì)胞均可生長繁殖形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應(yīng)代表樣品中的一個單細(xì)胞。統(tǒng)計菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和接種量即可換算出樣品中的活菌數(shù)。Hyun等[22]研究了不同大氣狀態(tài)對阪崎腸桿菌(Cronobactersakazakii)生物膜細(xì)胞活性的影響，平板菌落計數(shù)法結(jié)果表明，在N2、CO2環(huán)境下阪崎腸桿菌生物膜活細(xì)胞數(shù)顯著減少。

值得注意的是，自然界中大部分微生物都處于有活性但不可培養(yǎng)狀態(tài)(viable but non-cultural， VBNC)，只有很少種類和數(shù)量的細(xì)菌可被培養(yǎng)，而且具有一定選擇性的人工培養(yǎng)實際上已經(jīng)不同于微生物的自然生活環(huán)境，不適合人工培養(yǎng)的細(xì)菌在與優(yōu)勢菌種競爭時會處于劣勢；而且生物膜往往不易完全分散成單個細(xì)胞，因此平板菌落計數(shù)的結(jié)果往往偏低，只具有相對意義。

3.2 三磷酸腺苷(ATP)生物發(fā)光法

ATP是一種高能磷酸化合物，廣泛存在于細(xì)胞中，通過與ADP相互轉(zhuǎn)化實現(xiàn)能量的貯存和釋放，在細(xì)胞各項生命活動中起到能量傳遞的作用。James等[23]在1983年提出細(xì)胞內(nèi)源性ATP 的含量可以反映細(xì)胞活性和活細(xì)胞數(shù)量。研究表明，活體微生物在一定生長時期內(nèi)的ATP含量基本恒定，使得ATP含量與活細(xì)胞生物量存在較好的線性關(guān)系。當(dāng)微生物死亡后，其體內(nèi)的ATP迅速降解，不會影響活細(xì)胞的檢測。ATP在生物體內(nèi)的廣泛性、與活細(xì)胞生物量之間的線性關(guān)系和易降解性，使其成為較好的活細(xì)胞檢測指標(biāo)。螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase)在Mg2+的存在下，以D-熒光素(D-luciferin)、ATP和O2作為反應(yīng)底物，將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能，發(fā)出光量子，其發(fā)光強(qiáng)度和ATP含量成線性關(guān)系，根據(jù)發(fā)光強(qiáng)度可對ATP的含量進(jìn)行定量分析[24]。ATP生物發(fā)光法的優(yōu)點主要是反應(yīng)快速、操作簡便、重現(xiàn)性好。

大腸桿菌DH5α生物膜可作為混凝土表面的保護(hù)層抵抗微生物造成的混凝土劣化。Soleimani等[25]對大腸桿菌DH5α生物膜在灰漿表面的生長情況和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，其利用ATP生物發(fā)光法對灰漿樣品上分別培養(yǎng)了3 d、5 d、8 d的生物膜活菌數(shù)進(jìn)行測定，結(jié)果表明活菌數(shù)隨時間的增加呈現(xiàn)漸進(jìn)式增長的趨勢，該結(jié)果與濾膜法測定結(jié)果一致。

3.3 四唑鎓鹽(tetrazolium, XTT)減低法

XTT[2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulphenyl)-(2H)-tetrazolium-5-carboxanilide]是一種與MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetra-zolium bromide]類似的四唑氮衍生物，活細(xì)胞線粒體中脫氫酶可將外源性XTT還原成水溶性的棕黃色甲臜，與電子耦合劑如硫酸酚嗪甲酯(PMS)、甲萘醌(MEN)、輔酶Q(CQ)等共同使用時，甲臜的產(chǎn)生量與活細(xì)胞數(shù)成正相關(guān)，用酶標(biāo)儀在波長近450 nm處檢測其光吸收值，可反映活細(xì)胞的相對數(shù)量和相對活性[26]。XTT減低法現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌和真菌生物膜活性的研究中。Nostro等[27]用XTT減低法對基于乙烯-醋酸乙烯共聚物(ethylene-vinyl acetate copolymer，EVA)薄膜的抗菌精油測定了李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的抗菌活性。

3.4 熒光染料染色法

DAPI、SYTO9、Hoechst等熒光染料可對活細(xì)胞進(jìn)行染色，使生物膜的觀察具有選擇性，結(jié)合熒光顯微鏡或CLSM進(jìn)行觀察及數(shù)據(jù)分析，可對生物膜中活細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定量。

DAPI即4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole)，是一種能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料。它可結(jié)合到雙鏈DNA小溝的AT堿基對處，熒光強(qiáng)度可提高約20倍。DAPI可穿透完整的細(xì)胞膜，因此它可用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色，用熒光顯微鏡或CLSM進(jìn)行觀測，根據(jù)熒光強(qiáng)度可確定DNA量，繼而反映活細(xì)胞量。單獨(dú)DAPI的最大激發(fā)波長為340 nm，最大發(fā)射波長為488 nm；當(dāng)DAPI與雙鏈DNA結(jié)合時，最大吸收波長為364 nm，最大發(fā)射波長為454 nm，發(fā)散光為藍(lán)色。DAPI也可以和RNA結(jié)合，但產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度只有與DNA結(jié)合的1/5，其發(fā)射波長在500 nm左右[28]。Gressler等[29]用DAPI對113株從臨床樣品和馬糞樣品中分離的馬紅球菌(Rhodococcusequi)進(jìn)行染色，驗證形成生物膜的能力，并評價了阿奇霉素、克拉霉素和紅霉素對馬紅球菌生物膜的抑制能力。

碘化丙啶(propidium iodide，PI)是一種溴化乙啶的類似物，在嵌入雙鏈DNA后發(fā)出紅色熒光，熒光強(qiáng)度和雙鏈DNA的量成正比，最大激發(fā)和最大發(fā)射波長分別為535 nm和615 nm[30]。盡管PI不能通過活細(xì)胞膜，但卻能穿過破損的細(xì)胞膜對DNA染色。PI與SYTO9一起使用，可同時對活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行染色，因此可區(qū)分生物膜中的死活細(xì)胞，得出生物膜活細(xì)胞量及細(xì)胞死活比。Park等[31]合成了一種一氧化氮(NO)釋放材料，并用SYTO9/PI染色研究其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)生物膜的抗菌作用。

Hoechst染料為非嵌入型熒光染料，可與DNA雙鏈中的小溝結(jié)合，且更傾向于富含A/T(腺嘌呤/胸腺嘧啶)的DNA鏈。Hoechst可穿過細(xì)胞膜，對活細(xì)胞或固定細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行染色，因此可用于活細(xì)胞標(biāo)記。類似的染料有Hoechst 33258、Hoechst 33342和Hoechst 34580 3種。Hoechsr-DNA的最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長分別350 nm和460 nm，發(fā)藍(lán)色熒光[32]。Peyyala等[33]評價了包括Hoechst 33258在內(nèi)的多種細(xì)胞核酸染料對口腔細(xì)菌形成單一生物膜和復(fù)合生物膜細(xì)胞活性研究的能力。

3.5 磷脂法

磷脂存在于所有活細(xì)胞的細(xì)胞膜中，是生物膜的主要組分，其在細(xì)胞中的含量較穩(wěn)定；當(dāng)細(xì)胞衰亡時，磷脂會很快被分解[34]，所以死細(xì)胞中磷脂含量很低。因此，磷脂含量可近似表示生物膜的活性生物量，即通過測定與脂結(jié)合的磷的方法來定量表示生物膜的活性生物量。磷脂法已經(jīng)被證明是一種可以測定生物膜活性生物量的好方法。磷脂法首先要以一系列濃度KH2PO4標(biāo)準(zhǔn)溶液測定吸收值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；對生物膜內(nèi)磷脂進(jìn)行萃??；然后用消化劑將以上萃取液中有機(jī)磷脂中的磷轉(zhuǎn)化為無機(jī)磷；按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定消解液中的磷酸鹽濃度，換算得出生物膜活性生物量。熊正為等[35]采用懸掛鏈曝氣式接觸氧化工藝在3個時段內(nèi)處理城市河道污水，采用磷脂法研究載體表面生物膜特性，驗證了裝置的水質(zhì)凈化效果。

4 生物膜中大分子物質(zhì)的定量分析方法

4.1 生物膜中蛋白質(zhì)的定量分析方法

4.1.1 異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)染色法 FITC本身性質(zhì)穩(wěn)定，能與蛋白質(zhì)結(jié)合，是檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)最常用的熒光探針。當(dāng)FITC在堿性溶液中與蛋白質(zhì)反應(yīng)時，主要是蛋白質(zhì)上賴氨酸的r氨基與熒光素的硫碳胺鍵結(jié)合，形成FITC-蛋白質(zhì)復(fù)合物。FITC最大吸收光波長為490～495 nm，最大發(fā)射光波長為520～530 nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，通過CLSM進(jìn)行觀察及熒光強(qiáng)度的測定，可對蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定。Feldman等[36]結(jié)合FITC染色法評價了蔓越莓原花青素抑制白念珠菌生物膜黏附的能力。

4.1.2 考馬斯亮藍(lán)顯色法(bradford法) 1976年Bradford[37]利用考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合的原理，建立了迅速而準(zhǔn)確的定量蛋白質(zhì)的分析方法。考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合后，其對可見光的最大吸收峰從465 nm變?yōu)?95 nm，吸光度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系。蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物具有高的消光系數(shù)，因此大大提高了蛋白質(zhì)測定的靈敏度。Jain等[38]探討了不同碳源和生理條件對銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)生物膜生長的影響，其中對蛋白質(zhì)含量的分析采用了Brandford法。

4.1.3 Folin-酚試劑法(lowry法) Folin-酚試劑法是Lowry等[39]于1951年提出的，它是在雙縮脲法的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的測定蛋白質(zhì)含量的經(jīng)典方法。Lowry法所用的試劑由兩部分組成，蛋白質(zhì)中的肽鍵與試劑A中的堿性硫酸銅反應(yīng)形成銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與試劑B中磷鉬酸-磷鎢酸發(fā)生氧化還原反應(yīng)，致使溶液顏色變成藍(lán)色，通過分光光度計在650～750 nm檢測吸光值，使用選定的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，可估算樣品的蛋白含量。此法操作簡單、迅速、靈敏度高。Moryl等[40]分析了不同營養(yǎng)狀態(tài)和脅迫條件(氨噻肟頭孢菌素、低pH、營養(yǎng)耗竭)對奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)生物膜多糖合成的影響，其中Lowry法被應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)含量的變化。

4.1.4 二喹啉酸法(BCA法) BCA法是Smith等[41]于1985年發(fā)明的，該方法是基于雙縮脲反應(yīng)，即Cu2+在堿性條件下可轉(zhuǎn)換為Cu+，該反應(yīng)受4個氨基酸(半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸和色氨酸)殘基，以及多肽主鏈的影響。BCA 是Cu+的一種特定顯色劑，在反應(yīng)的第二步，2個BCA分子和1個Cu+離子發(fā)生反應(yīng)。Cu2+被還原的數(shù)量是蛋白質(zhì)濃度的函數(shù)，樣品溶液的顏色變成紫色，可以通過分光光度計測量在562 nm處的吸光度。吸光度與溶液中蛋白質(zhì)的量成正比，通過與已知蛋白標(biāo)準(zhǔn)，例如牛血清白蛋白(BSA)相比較，可估算出蛋白含量[42]。何智妍等[43]采用Bradford法、Lowry法和BCA法評價了不同超聲條件下超聲破碎法提取糞腸球菌生物膜總蛋白含量的效果，確定了最佳超聲時間、間隔時間和振幅等參數(shù)。

4.2 生物膜中多糖的定量分析方法

4.2.1 苯酚-硫酸法 苯酚-硫酸法是Dubois等[44]在1951年建立的一種用于多糖含量測定的方法，也被稱為苯酚-硫酸分光光度法或苯酚-硫酸比色法。其原理是利用多糖在濃硫酸的作用下水解成單糖，并迅速脫水生成糠醛衍生物，然后和苯酚縮合成橙黃色化合物，在490 nm處進(jìn)行比色測定[45]。該法操作簡便，靈敏度高，應(yīng)用廣泛。但其準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性受實驗條件影響較大，因此，許多學(xué)者從不同角度對苯酚-硫酸法進(jìn)行了研究改進(jìn)[46]。Moryl等[40]采用苯酚-硫酸法分析了不同營養(yǎng)狀態(tài)和脅迫條件對奇異變形桿菌生物膜多糖合成的影響。

4.2.2 蒽酮法 糖類在較高溫度下可被濃硫酸脫水生成糠醛或其衍生物，糠醛或羥甲基糠醛進(jìn)一步與蒽酮試劑縮合產(chǎn)生藍(lán)綠色物質(zhì)，其在可見光區(qū)波長620～630 nm處有最大吸收，且其光吸收值在一定范圍內(nèi)與糖的含量成正比[47]。蒽酮法可用于單糖、寡糖和多糖含量的測定，因此可用于生物膜多糖含量的測定，該方法具有靈敏度高、簡便快捷、適用于微量樣品的測定等優(yōu)點。Zhang等[48]對抗菌牙膠抑制多物種生物膜[變形鏈球菌(Streptococcusmutans)、戈登鏈球菌(Streptococcusgordonii)和血鏈球菌(Streptococcussanguinis)]形成的效果進(jìn)行了研究，蒽酮法表明加入了抗菌劑(dimethylaminododecyl methacrylate, DMADDM)后牙膠形成的生物膜多糖含量顯著降低。

4.2.3 植物細(xì)胞壁鈣熒光(calcofluor white, CFW)染色法 CFW是一種二苯乙烯類的非特異性的熒光染料，可與纖維素、幾丁質(zhì)或肽聚糖通過β-1,3-或β-1,4-糖苷鍵非特異性的結(jié)合。CFW可與生物膜中β糖苷鍵連接的多糖結(jié)合，最大激發(fā)波長為300～440 nm，最大發(fā)射波長為355 nm，發(fā)亮藍(lán)色熒光[49]。Brackman等[50]發(fā)現(xiàn)肉桂醛和肉桂醛衍生物通過降低群體感應(yīng)反映調(diào)節(jié)蛋白LuxR的DNA結(jié)合能力可減少弧菌毒性，CV染色、CFW染色等結(jié)果表明肉桂醛和肉桂醛衍生物可在不影響弧菌生長的情況下，抑制其生物膜的形成，減少其胞外多糖的形成，進(jìn)而降低其對饑餓條件和抗生素的抗性。

4.2.4 凝集素標(biāo)記法 凝集素是一種從各種植物或動物中提純的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白，具有一個以上與糖結(jié)合的位點。凝集素對某種特異性糖基的結(jié)合具有專一性，如刀豆蛋白A(ConA)與α-D-吡喃糖基甘露糖(α-D-Mannopyranosy)結(jié)合；麥胚凝集素(WGA)與N-乙酰糖胺(N-acetyl glucosamine)結(jié)合；菜豆凝集素(PHA)與N-乙酰乳糖胺(N-acetyl lactosamine)結(jié)合[51]。同時，凝集素具有多價結(jié)合能力，能被熒光染料標(biāo)記。結(jié)合熒光染料標(biāo)記的凝集素被越來越廣泛地應(yīng)用于生物膜形成和胞外多糖的研究中。FITC、TRITC、Alexa Fluor、Texas Red、Orange Green等熒光染料特異性標(biāo)記刀豆蛋白或麥胚凝集素等凝集素，結(jié)合CLSM及相關(guān)分析軟件，可對生物膜多糖含量進(jìn)行測定。Wang等[52]結(jié)合顯微鏡和光譜方法對肉類加工過程中沙門氏菌生物膜進(jìn)行原位表征和分析，其中運(yùn)用了FITC-ConA染色及CLSM對不同基質(zhì)下生物膜多糖成分進(jìn)行了分析。

5 生物膜結(jié)構(gòu)的定量分析方法

生物膜在形成過程及成熟后，其結(jié)構(gòu)具有特異性。成熟的生物膜是由大量胞外聚合物包裹菌體的三維立體結(jié)構(gòu)，一般由多個蘑菇樣或柱樣的亞單位組成。利用熒光染料對生物膜進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)合CLSM，不僅可對生物膜結(jié)構(gòu)直接觀察，進(jìn)一步結(jié)合圖像分析軟件，還可對圖像堆數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)定量化分析，使直觀的圖像轉(zhuǎn)變成可以統(tǒng)計分析的數(shù)據(jù)，獲得生物膜生物量、厚度、基質(zhì)覆蓋率、比表面積等相關(guān)信息[53]。常用于結(jié)合CLSM對生物膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析的軟件有：COMSTAT、Image Structure Analyzer(ISA)、PHLIP、Image J、BioImage L等，其中，以COMSTAT和ISA應(yīng)用最為廣泛。

5.1 COMSTAT

COMSTAT分析軟件是由丹麥技術(shù)大學(xué)Arne Heydorn團(tuán)隊[54]于2000年針對生物膜分析自主開發(fā)的一款計算機(jī)軟件。該軟件可將由CLSM獲得的三維圖像堆數(shù)據(jù)化，進(jìn)行生物膜空間結(jié)構(gòu)定量分析，從而更加直觀的了解不同生物膜的空間構(gòu)造。COMSTAT可以對生物膜的生物量、平均厚度、基質(zhì)覆蓋率、分形維數(shù)、粗糙系數(shù)、平均擴(kuò)散距離、均一性、比表面積等十幾個參數(shù)進(jìn)行測定[55,56]。Larimer等[57]對惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)生物膜進(jìn)行熒光染色，結(jié)合CLSM和COMSTAT軟件對生物膜進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明其精度與傳統(tǒng)的細(xì)胞計數(shù)方法一致，且具有操作簡單、快速，同時可原位、實時、無損的分析生物膜空間結(jié)構(gòu)等優(yōu)點。Yang等[58]將COMSTAT分析軟件應(yīng)用于雙環(huán)溴代呋喃酮抑制銅綠假單胞菌生物膜形成的研究中，分析了雙環(huán)溴代呋喃酮作用后銅綠假單胞菌生物膜結(jié)構(gòu)、生物量、平均厚度、基質(zhì)覆蓋率等參數(shù)的變化。

5.2 圖像結(jié)構(gòu)分析(image structure analyze,ISA)

ISA是美國Montana州立大學(xué)生物膜工程中心Hlauk Beyenal團(tuán)隊[59]專門為生物膜空間結(jié)構(gòu)研究開發(fā)的圖像結(jié)構(gòu)分析軟件，通過對生物膜的二維和三維結(jié)構(gòu)參數(shù)運(yùn)算而實現(xiàn)對生物膜的結(jié)構(gòu)定量化分析，為更深入研究生物膜空間結(jié)構(gòu)提供了新的平臺，逐漸被研究者們結(jié)合應(yīng)用到生物膜研究中[60]。ISA可分析的參數(shù)包括：①結(jié)構(gòu)參數(shù)：如結(jié)構(gòu)熵、結(jié)構(gòu)能、均一性；②平面參數(shù)：如區(qū)域孔率、平均擴(kuò)散距離、最大擴(kuò)散距離、分形維數(shù)、平均水平/垂直延伸距離、平均X/Y/Z軸延伸距離、周邊等指標(biāo)；③其他參數(shù)：如生物量、比表面積、單位面積生物膜體積等[59]。Khajotia等[61]對變異鏈球菌(Streptococcusmutans)生物膜核酸、蛋白質(zhì)和胞外多糖同時進(jìn)行熒光染料的標(biāo)記，結(jié)合CLSM和ISA分析軟件評價了漱口水BIO和LTO對生物膜成分及結(jié)構(gòu)的作用。

6 方法比較

目前已形成針對于生物膜生物量、細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)、大分子物質(zhì)和結(jié)構(gòu)的一系列定量分析方法，由于每種方法都是根據(jù)一定的對象和條件發(fā)展起來的，因此各有其優(yōu)缺點，現(xiàn)將生物膜多種指標(biāo)的各種定量分析方法的優(yōu)缺點及適用范圍列于表1。研究者可以根據(jù)實驗的具體情況選擇合適的分析方法。

7 展望

生物膜是地球生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，它與人類健康、食品安全、工業(yè)生產(chǎn)甚至環(huán)境穩(wěn)定息息相關(guān)。生物膜與浮游狀態(tài)相比，結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜、信息交流更加廣泛、調(diào)控機(jī)制更加精細(xì)、社會效應(yīng)更加完善。隨著近年來生物膜研究的不斷深入，經(jīng)典的定性分析方法已不能滿足生物膜研究的需求，因此生物膜定量分析方法的建立尤為重要。近年來越來越多針對生物膜的定量分析方法被報道，但仍然缺乏被廣泛認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)方法。有些方法操作復(fù)雜，靈敏度低、特異性差，不能滿足快速檢測的需要。因此，提高生物膜的檢測水平，建立簡便、快捷、靈敏、精確的定量檢測方法，研制出標(biāo)準(zhǔn)、快速、特異的檢測商品試劑盒，也是今后生物膜研究的重要內(nèi)容之一。另外，生物膜定量檢測多局限于生物量、活性和形態(tài)結(jié)構(gòu)，對起關(guān)鍵作用的細(xì)胞間信息傳遞研究還很有限，報告基因在生物膜研究中的應(yīng)用有望對細(xì)胞間信息傳遞機(jī)制的研究帶來突破性的進(jìn)展。隨著儀器的改進(jìn)和方法的創(chuàng)新，以及多種方法的聯(lián)合使用，必將推動生物膜定量分析方法的改進(jìn)與提高。隨著相關(guān)定量分析方法的不斷發(fā)展和完善，人們對生物膜的研究將更加深入和透徹，從而更好地預(yù)防、控制和開發(fā)生物膜。

表1 生物膜多種指標(biāo)定量分析方法的比較

Table 1 Comparion of quantification analysis methods for multiple index of biofilm.

指標(biāo)技術(shù)方法優(yōu)點缺點生物量結(jié)晶紫染色法適用于大量樣本的定量分析;操作簡便檢測限高;靈敏度較低干重/揮發(fā)性干重直接;操作簡單;適用范圍廣檢測限高;靈敏度低總有機(jī)碳含量靈敏度高;檢測限低;精確度高需要特殊儀器細(xì)胞總數(shù)SYTO9染色法精確度高;操作簡便;檢測時間短試劑成本高;線性關(guān)系只存在于相對窄的范圍內(nèi)吖啶橙染色法靈敏度高;精確度較高;價格相對低廉洗滌劑處理后會造成信號的稍微增加實時熒光定量PCR技術(shù)靈敏度高;精確度高;重復(fù)性好;特異性強(qiáng);同時可用于生物膜變化過程中相關(guān)基因的研究干擾因素較多;操作較繁瑣活細(xì)胞數(shù)平板菌落計數(shù)法應(yīng)用廣泛;較準(zhǔn)確;經(jīng)濟(jì)實用耗時較長;測定結(jié)果受多種因素的影響;人為誤差大;結(jié)果只具有相對意義;不適用于不可培養(yǎng)的微生物三磷酸腺苷生物發(fā)光法反應(yīng)快速;操作簡便;重現(xiàn)性好;應(yīng)用范圍廣影響因素較多;靈敏度低四唑鎓鹽減低法靈敏度高;檢測快速;重復(fù)性好;應(yīng)用廣泛試劑穩(wěn)定性差熒光染料染色法精確度高;操作簡便;檢測時間短試劑成本高;線性關(guān)系只存在于相對窄的范圍內(nèi)磷脂法靈敏度較高;準(zhǔn)確度較高影響因素較多大分子物質(zhì)蛋白質(zhì)多糖異硫氰酸熒光素染色法精確度高;操作簡便檢測限高;結(jié)果受洗滌劑影響考馬斯亮藍(lán)顯色法靈敏度高;操作簡便;重復(fù)性好;精確度高;干擾物質(zhì)少受蛋白質(zhì)內(nèi)氨基酸組成影響較大;標(biāo)準(zhǔn)曲線有輕微的非線性;仍受一些去污劑的干擾Folin-酚試劑法靈敏度較高;操作簡便,不需特殊儀器設(shè)備費(fèi)時;要精確控制操作時間;標(biāo)準(zhǔn)曲線不是嚴(yán)格的直線形式;專一性較差;干擾物質(zhì)較多二喹啉酸法靈敏度高;操作簡便、快速;反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定;線性范圍寬;經(jīng)濟(jì)實用;抗試劑干擾能力較強(qiáng)受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響苯酚-硫酸法靈敏度較高;經(jīng)濟(jì)實用準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性受實驗條件影響較大;試劑危險性高蒽酮法靈敏度高;檢測限較低;標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好;線性范圍較寬干擾因素較多;操作較繁瑣;試劑危險性高植物細(xì)胞壁鈣熒光染色法原位、實時、無損觀察;操作簡便洗滌劑影響染色結(jié)果凝集素標(biāo)記法原位、實時、無損觀察;操作簡便靈敏度不高;價格較昂貴生物膜結(jié)構(gòu)COMSTAT非破壞性;無損傷;原位、實時、無損、三維觀察;形成生物膜的動態(tài)過程中各種量化數(shù)據(jù)某些菌株對染料不敏感圖像結(jié)構(gòu)分析非破壞性;無損傷;原位、實時、無損、三維觀察;形成生物膜的動態(tài)過程中各種量化數(shù)據(jù);數(shù)據(jù)稍多于COMSTAT某些菌株對染料不敏感

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Review on the Quantification Analysis Methods of Biofilm

ZHAO Zhi-ying, LI Liang-qiu*, MA Lian-ying, YOU Xue-jiao

StateKeyLaboratoryofAppliedMicrobiologySouthernChina;GuangdongProvincialKeyLaboratoryofMicrobialCultureCollectionandApplication,GuangdongInstituteofMicrobiology,Guangzhou510070,China

Because of strong pathogenicity, drug resistance and stress resistance, biofilm has become a major problem of global concern. In this paper, a review was made on the quantitative analysis methods of biofilm biomass, total cell count, living cell number, macromolecular substance and structure, which was expected to provide abandant methods for biofilm research. We are also looking forward to provide theory reference to promote biofilm quantitative analysis method, thereby we can better prevent, control and exploit biofilm.

biofilm; quantification; detection

2016-06-02; 接受日期：2016-06-30

廣東省科學(xué)院分析測試基金項目(Sf201502)資助。

趙智穎，助理工程師，研究方向為微生物資源學(xué)。 E-mail:crystal23200@163.com。*通信作者：李良秋，教授級高級工程師，研究方向為微生物資源與發(fā)酵工程。E-mail: liliangqiu1010@163.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.05.03