王永會(huì), 郭宸昱, 王文婧, 蔣 嵐, 李 熠, 吳紅梅, 姚一建

1.中國科學(xué)院微生物研究所, 真菌學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100101;2.中國科學(xué)院大學(xué), 北京 101408;3.北京市第八中學(xué), 北京 100033;4.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 福州 350002

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不同蟲花棒束孢菌株固體培養(yǎng)提取物抗氧化和抗菌活性初步測定

王永會(huì)1,2§, 郭宸昱3§, 王文婧1*, 蔣 嵐1,2, 李 熠4, 吳紅梅1,2, 姚一建1*

1.中國科學(xué)院微生物研究所, 真菌學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100101;2.中國科學(xué)院大學(xué), 北京 101408;3.北京市第八中學(xué), 北京 100033;4.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 福州 350002

蟲花棒束孢(Isariafarinosa)是一種常見的土棲昆蟲病原真菌，在害蟲生物防治方面有著廣泛研究和應(yīng)用，其對(duì)人體保健、藥效和活性成分等方面也有一定的研究。為了揭示不同菌株之間的差異，選擇7個(gè)來源不同的菌株，經(jīng)形態(tài)和分子鑒定后，通過大米固體培養(yǎng)和乙酸乙酯提取，進(jìn)行了抗氧化和抗菌活性測定。研究結(jié)果表明不同來源的蟲花棒束孢菌株，經(jīng)相同條件的培養(yǎng)和提取得到的產(chǎn)物在抗氧化和抗菌活性方面呈現(xiàn)明顯的差異，以菌株2142表現(xiàn)最佳，在抗菌實(shí)驗(yàn)中尤其突出。菌株2142乙酸乙酯粗提物(200 mg/mL)對(duì)蠟樣芽胞桿菌的抗菌活性達(dá)到與陽性對(duì)照氨芐西林鈉(80 μg/mL)相似的水平。該菌株具有較好的應(yīng)用前景，有待進(jìn)一步深入研究。利用蟲花棒束孢菌株研發(fā)保健產(chǎn)品或醫(yī)藥產(chǎn)品具有很好的潛力，但其菌株來源需要十分關(guān)注；篩選對(duì)人體安全可靠，并有利于產(chǎn)品開發(fā)利用的優(yōu)良菌株是一項(xiàng)非常重要的工作。

蟲花棒束孢；蝙蝠蛾擬青霉；乙酸乙酯粗提物；抗氧化活性；抗菌活性；菌株差異

蟲花棒束孢 [Isariafarinosa(Holmsk.) Fr.]，常見異名為“粉擬青霉”[Paecilomycesfarinosus(Holmsk.) A. H. S. Br. & G. Sm. ]，在分類學(xué)上屬于肉座菌目(Hypocreales),蟲草菌科(Cordycipitaceae),棒束孢屬(IsariaPers.)。蟲花棒束孢是一種世界廣泛分布的土棲真菌，寄生于鱗翅目、鞘翅目、半翅目、雙翅目、同翅目及膜翅目等6目，并可能侵染幾乎所有目的昆蟲，是常見的蟲生真菌[1,2]，具有廣泛的生物防治應(yīng)用前景[3]。研究也表明該菌對(duì)人體也具有多重藥效作用，包括抗菌、抗氧化、抗腫瘤和增強(qiáng)免疫力等功效[3～5]。

有關(guān)蟲花棒束孢的藥效研究主要集中在多糖、水提取物和極性較大的成分等方面[3～5]，對(duì)其小極性成分的研究較少，而這一類代謝產(chǎn)物往往有更多不同的藥效作用。如采用乙酸乙酯提取內(nèi)生真菌Phomasp. 的固體培養(yǎng)物，獲得的小極性成分具有明顯的抑菌作用[6]；用各種有機(jī)溶劑提取藥用擬層孔菌(Fomitopsisofficinalis(Vill.) Bondartsev & Singer)子實(shí)體，獲取的小極性成分對(duì)腫瘤細(xì)胞有不同程度的抑制作用[7]；多孔菌(Polyporusvarius(Pers.)Fr.)發(fā)酵液乙酸乙酯提取的小極性成分對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草桿菌(Bacillussubtilis)和大腸桿菌(Escherichiacoli)有顯著抑制作用[8]；此外有研究發(fā)現(xiàn)藥用真菌斑褐層孔菌[Fuscoporiapunctata(P. Karst.) G. Cunn]和苦白蹄[Fomitopsisofficinalis(Vill.) Bondartsev & Singer]小極性成分對(duì)肺癌A-549細(xì)胞具有明顯的體外抑制增殖活性[9]。這些研究表明蟲花棒束孢的小極性成分有待系統(tǒng)和深入的研究。

真菌的不同菌株和不同培養(yǎng)方式在代謝產(chǎn)物方面有所不同，在生物活性上也具有差異。對(duì)不同來源的擬青霉屬(Paecilomyces)11種的29株菌株進(jìn)行抗白色念珠菌(Candidaalbeicans)活性研究表明，菌株間的抑菌活性差異明顯[10]；楊焱等[11]采用液體發(fā)酵、木屑固體發(fā)酵和米飯固體發(fā)酵3種培養(yǎng)方式培養(yǎng)桑黃(Inonotussanghuang)菌絲體，在體外抗氧化實(shí)驗(yàn)中表明，米飯固體發(fā)酵獲得的提取物的活性明顯高于其他兩種方法。

本研究在可靠的分類鑒定基礎(chǔ)上選擇不同來源的蟲花棒束孢菌株，通過大米固體培養(yǎng)和乙酸乙酯提取，進(jìn)行抗氧化和抗菌活性測定比較，以揭示菌株之間的差異，為篩選具有應(yīng)用前景的優(yōu)良菌株和產(chǎn)品開發(fā)提供可靠信息。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本研究采用來源不同的7個(gè)蟲花棒束孢菌株，包括分離自蟲花棒束孢解釋模式的菌株CBS111113(購自丹麥CBS公司)和國內(nèi)分離自罹病昆蟲或土壤的菌株。國內(nèi)的菌株主要來自青藏高原和北京(表1)。實(shí)驗(yàn)菌株采用PDA培養(yǎng)基在4℃下保藏。

表1 本研究所用蟲花棒束孢菌株信息

Table 1 Strains ofIsariafarinosaused in this study.

菌株編號(hào)來源來源地備注1705昆蟲北京本實(shí)驗(yàn)室分離1785昆蟲青海本實(shí)驗(yàn)室分離2138昆蟲四川本實(shí)驗(yàn)室分離2140冬蟲夏草菌核云南本實(shí)驗(yàn)室分離2142土壤青海本實(shí)驗(yàn)室分離2185*冬蟲夏草菌核云南本實(shí)驗(yàn)室分離CBS111113**昆蟲丹麥購自CBS

注：*菌種來自蝙蝠蛾擬青霉新模式(蝙蝠蛾擬青霉已被證明與蟲花棒束孢為同一物種，結(jié)果另文發(fā)表)；**菌種分離自蟲花棒束孢解釋模式。

供試病原指示菌株為金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，CGMCC1.89)、蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus，CGMCC1.1846)、大腸桿菌(Escherichiacoli，CGMCC1.2385)及銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，CGMCC1.2031)，均由中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心提供。

1.2 菌株培養(yǎng)及樣品制備

蟲花棒束孢菌株在PDA培養(yǎng)基上經(jīng)25℃黑暗培養(yǎng)14 d，用無菌水洗脫培養(yǎng)基表面的菌絲，制成106/mL的孢子懸浮液。將3 mL孢子懸浮液加入到含有150 mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液的500 mL三角瓶中，在25℃下黑暗搖床振蕩120 r/min培養(yǎng)5 d得到菌種液。取5 mL種子液接種于滅菌后大米固體培養(yǎng)基上(250 mL三角瓶中含30 g大米和40 mL蒸餾水)，于黑暗中25℃培養(yǎng)45 d。

各菌株各取8瓶大米培養(yǎng)物，搗碎成小塊，每瓶加入200 mL乙酸乙酯浸泡，室溫下提取過夜，收集提取液，剩余殘?jiān)欣^續(xù)加入200 mL乙酸乙酯浸泡，共提取4次，合并提取液。在39℃下減壓濃縮，吹干獲得乙酸乙酯提取物，稱重后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 體外抗氧化活性測定

1.3.1 清除DPPH自由基能力測定 菌株固體培養(yǎng)物乙酸乙酯提取物自由基清除能力用DPPH測定法測定[12]。采用二倍稀釋法，配置0.125～10 mg/mL系列濃度梯度的樣品溶液。取一定濃度的150 μL樣品溶液，加入2.85 mL DPPH溶液(0.1 mmol/L)并立即混勻，室溫避光放置24 h，波長515 nm處測定吸光值。相同體積的乙酸乙酯溶液為空白，相同濃度的BHT作為陽性對(duì)照。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，按下式計(jì)算清除率：

第二，在歷史人物形象和性格塑造上，民間口承敘事可以拋開正史中片面、單一的刻板記錄，從多側(cè)面豐富人物性格和人物形象，使歷史人物更為飽滿真實(shí)。以努爾哈赤的傳說為例，在遼寧滿族民間口承敘事中，將收錄到的罕王傳說按講述內(nèi)容的縱向時(shí)間羅列，可以清晰地勾畫出努爾哈赤從出生、童年、歷練，一直到成為一代帝王、建功立業(yè)的生命周期和“英雄式”敘事程式。

式中，Ab：空白吸光度；As：加入樣品后的吸光度；Asb：樣品本身的吸光度(不加DPPH溶液)。

式中，Ab：空白吸光度；As：加入樣品后的吸光度。

1.4 抗菌實(shí)驗(yàn)

抗細(xì)菌活性測定采用濾紙片法。取活化后的受試菌液1 mL轉(zhuǎn)至裝有60 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在37℃下，180 r/min搖床培養(yǎng)5～6 h，取處于對(duì)數(shù)期的受試細(xì)菌，血球計(jì)數(shù)板調(diào)整細(xì)菌濃度為106CFU/mL。用移液槍吸取受試菌液100 μL于LB平板表面，用涂布器將菌液涂布均勻，靜置1 h。

無菌條件下將干燥無菌的圓形濾紙片(d=6 mm)，分別放在陰性對(duì)照(乙酸乙酯)、受試樣品(200 mg/mL)和陽性對(duì)照(革蘭氏陽性受試菌株使用氨芐西林鈉，濃度80 μg/mL；革蘭氏陰性受試菌株使用鏈霉素，濃度80 μg/mL)中浸泡至充分吸收，再將其放置于均勻涂布受試菌液的培養(yǎng)基表面，濾紙片距平皿邊緣1.5 cm以上，各濾紙片間距2.5 cm以上，每個(gè)平板3次重復(fù)。在37℃下培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長情況，并記錄抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈直徑大小判斷樣品對(duì)供試菌株的抗菌活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0處理。重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。單因素試驗(yàn)在方差分析的基礎(chǔ)上經(jīng)Duncan’s多重檢驗(yàn)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙酸乙酯粗提物產(chǎn)量

經(jīng)45 d固體培養(yǎng)之后，每個(gè)菌株從240 g(30 g/瓶× 8瓶)大米培養(yǎng)物所獲得的乙酸乙酯粗提物得率差異很大，以菌株2142的得率最高，達(dá)大米培養(yǎng)基重量的1.031 1%，約為其他菌株的2倍；其次為菌株CBS111113，達(dá)0.618 1%，最低為菌株2138，僅0.397 3%(表2)。

表2 蟲花棒束孢大米固體發(fā)酵物的乙酸乙酯粗提物產(chǎn)量

Table 2 The production of crude ethyl acetate extracts from inIsariafarinosarice medium.

菌株乙酸乙酯粗提物總量(g)粗提物得率(%)17050.97020.404317851.32560.552321380.95360.397321401.24580.519121422.47471.031121851.06230.4426CBS1111131.48340.6181

粗提物得率=粗提物總量/大米培養(yǎng)基用量

2.2 抗氧化活性研究

大米固體培養(yǎng)乙酸乙酯提取物清除能力(IC50值)(即對(duì)DPPH、超氧陰離子自由基清除率達(dá)50%時(shí)的提取物濃度，與清除率呈反比)均以菌株2142的提取物最低，而菌株2185 在DPPH自由基清除體系中的IC50值最高，菌株2138次之；且后兩者的超氧陰離子自由基清除率均未達(dá)50%(表3)。

從具有IC50的乙酸乙酯提取物來看，不同菌株的培養(yǎng)物清除DPPH自由基的IC50值均小于清除超氧陰離子自由基的結(jié)果，即在兩種抗氧化體系中，提取物對(duì)DPPH自由基有較好的清除作用。在7個(gè)不同來源的菌株大米固體培養(yǎng)的乙酸乙酯提取物中，1785、2142、CBS111113清除DPPH自由基的IC50值最低，三者之間沒有顯著差異，但與其他菌株相比差異顯著(P<0.05)，擁有較強(qiáng)的清除能力；且2142在清除超氧陰離子自由基上與其他菌株相比具有顯著性差異(P<0.05)，擁有較強(qiáng)的清除能力。

2.3 抗菌實(shí)驗(yàn)

乙酸乙酯提取物抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各菌株對(duì)革蘭氏陰性菌均未表現(xiàn)出明顯的抗菌活性，而對(duì)革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌)表現(xiàn)出一定的抗菌活性，但不同菌株之間差異明顯，其中以菌株2142抗菌活性最為突出，尤其是對(duì)蠟樣芽胞桿菌的抑菌圈直徑與陽性對(duì)照相似；菌株2138未表現(xiàn)出任何明顯的抗菌活性(表4)。

表3 不同蟲花棒束孢菌株大米培養(yǎng)乙酸乙酯粗提物在兩種抗氧化體系中的IC50值

Table 3 IC50values of crude ethyl acetate extracts fromIsariafarinosain antioxidant properties.

提取物IC50(mg/mL)DPPH自由基清除能力超氧陰離子自由基清除能力BHT0.086±0.000016f0.4734±0.00012e17052.50±0.19d6.35±0.09b17851.38±0.01e4.56±0.13c21385.26±0.05b—21404.51±0.07c7.93±0.18a21421.08±0.02e3.91±0.08d21856.0±0.81a—CBS1111131.23±0.02e5.02±0.10c

注：每一列的不同字母表示差異顯著(P<0.05)；“—”表示最大清除能力未超過50 %，未參加方差分析。

表4 不同蟲花棒束孢菌株大米培養(yǎng)乙酸乙酯粗提物抗菌活性

Table 4 Antimicrobial activity of crude ethyl acetate extracts from different strains ofIsariafarinosaon rice medium.

受試細(xì)菌抑菌圈直徑(mm)#陽性對(duì)照陰性對(duì)照170517852138214021422185CBS111113革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)21.3±0.3a—9±1d8.6±0.26d—11.5±0.25c13.9±0.65b9.5±0.25d9.8±0.58d蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)12.7±0.3a—8.7±0.3b8±0b—8±0b12±1a8.3±0.3b8.7±0.3b革蘭氏陰性菌大腸桿菌(Escherichiacoli)21±0.3————————銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)11±0.5————————

注：#抑菌圈直徑包括濾紙片直徑(6 mm), 乙酸乙酯供試樣品濃度為200 mg/mL；“—”表示沒有明顯的抑菌圈；每一行的不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 討論

目前，蟲花棒束孢在抗氧化和抗真菌活性等方面的研究取得了一定的進(jìn)展[3]，但尚未見對(duì)蟲花棒束孢大米培養(yǎng)提取物的抗氧化和抗細(xì)菌活性以及不同菌株之間比較的報(bào)道。本研究選擇不同來源的蟲花棒束孢菌株，在相同的大米培養(yǎng)條件下，進(jìn)行抗氧化和抗菌活性比較。研究結(jié)果表明不同菌株差異顯著，從乙酸乙酯粗提物的產(chǎn)量到抗氧化和抗細(xì)菌活性均表現(xiàn)出差異，并呈現(xiàn)一定的規(guī)律。菌株2142大米培養(yǎng)的乙酸乙酯粗提物的產(chǎn)量最高，在抗氧化的兩個(gè)體系中IC50值均最小，在抑菌實(shí)驗(yàn)中對(duì)兩種革蘭氏陽性菌有最好的抑制效果，并達(dá)到正對(duì)照氨芐西林鈉的水平。與此相反，菌株2138的乙酸乙酯粗提物的產(chǎn)量最少,在抗氧化的兩個(gè)體系中IC50值最大或清除能力低于50%，并在抑菌實(shí)驗(yàn)中對(duì)所有參試菌株均無明顯抑制效果。本研究結(jié)果表明，蟲花棒束孢2142菌株具有較好的應(yīng)用前景，有必要進(jìn)一步展開研究，以確定其對(duì)人體的安全性、開發(fā)利用的方向和產(chǎn)品設(shè)計(jì)的類型等。

有報(bào)道采用平板培養(yǎng)菌絲獲得乙酸乙酯粗提物的方法，比較了3株來自云南、北京和安徽不同寄主昆蟲的蟲花棒束孢(原文稱“粉擬青霉”)菌株的清除DPPH自由基活性，在10 mg/mL濃度下，其平均清除率均未達(dá)到30%，而不同寄主、不同采集地的同一物種的不同菌株間清除自由基活性差異相對(duì)較小[10]。另外，通過比較43株不同來源的蟲花棒束孢菌株液體培養(yǎng)菌絲體乙酸乙酯提取物的DPPH自由基清除能力，結(jié)果表明在30 mg/mL下，其自由基清除率普遍偏低，最高僅約20%，但不同菌株的自由基清除活性差別較大[13]。本研究通過比較7株來源不同的蟲花棒束孢菌株，結(jié)果表明菌株之間差異很明顯，且其大米固體培養(yǎng)的乙酸乙酯粗提物對(duì)DPPH自由基清除能力為50%時(shí)，其濃度均小于6 mg/mL。

蟲花棒束孢是值得關(guān)注的真菌資源，因其寄主廣泛和全球性分布的特點(diǎn)，用于農(nóng)業(yè)害蟲生物防治的研究非常之多。這個(gè)種的部分菌株可從我國名貴的食藥用真菌冬蟲夏草上分離獲得，有些菌株已經(jīng)開發(fā)成了藥品或者保健品在市場上大量銷售。因此，鑒于這個(gè)物種的復(fù)雜性，在保健或醫(yī)藥產(chǎn)品開發(fā)時(shí)要經(jīng)過代謝產(chǎn)物、生物活性以及毒理方面的檢測，以確保菌種的安全性。

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Antioxidant and Antimicrobial Tests of Extracts from Solid Culture ofIsariafarinosaStrains

WANG Yong-hui1,2§, GUO Chen-yu3§, WANG Wen-jing1*, JIANG Lan1,2, LI Yi4, WU Hong-mei1,2, YAO Yi-jian1*

1.StateKeyLaboratoryofMycology,InstituteofMicrobiology,ChineseAcademyofSciences,Beijing100101,China;2.UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing10148,China;3.BeijingNo.8HighSchool,Beijing100101,China;4.CollegeofPlantProtection,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China

Isariafarinosais a widely distributed entomopathogenic fungus in soil-dwelling insects. It has been extensively studied and applied in biological control of insects, and also attracted researchers′ attention for its pharmacological effects and bioactive metabolites. In this study, seven strains ofI.farinosafrom different origins were selected based on morphological and molecular identification to reveal the variation among strains. Antioxidant effects and antimicrobial activities were tested by crude ethyl acetate extracts from the strains cultivated on rice medium. The results showed that the strains displayed significant variations in the bioactivities tested under the same conditions and strain 2142 had the best performance. In particular, the crude extract (200 mg/mL) from strain 2142 had the similar effect withBacilluscereusto that of ampicillin sodium (80 μg/mL) used as the positive control in the antimicrobial experiment. Further investigation on the strain was required to explore its potentials. There are broad prospects for the application ofI.farinosain health foods and pharmaceutical product, but the caution should be taken in the selection of strains for such purposes. It is important to evaluate the safety of any strain before its application in the area associated with human health.

Isariafarinosa;Paecilomyceshepiali; crude ethyl acetate extracts; antioxidant effects; antimicrobial activity; strain variation

2016-04-20; 接受日期：2016-06-06

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31170017);國家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013BAD16B013)；青海省科學(xué)技術(shù)廳項(xiàng)目(2014-NS-524；2014-NS-525)資助。

§王永會(huì)與郭宸昱為本文共同第一作者。王永會(huì)，博士研究生，主要從事真菌活性代謝產(chǎn)物研究。E-mail：wangyhsdu@163.com。郭宸昱，中學(xué)生，科研實(shí)踐項(xiàng)目為真菌活性代謝產(chǎn)物。E-mail：18910779039@163.com。*通信作者：王文婧，助理研究員，博士，從事真菌活性代謝產(chǎn)物研究。E-mail：wangwj@im.ac.cn;姚一建，研究員，博士，主要從事中國大型經(jīng)濟(jì)真菌相關(guān)研究。E-mail： yaoyj@im.ac.cn

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.05.10