沈小娟, 何新新, 王毅斌, 丁海龍, 關(guān) 雄*, 鄧 波*

1.瀘州老窖股份有限公司, 四川 瀘州 646000;2.福建農(nóng)林大學(xué), 生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室, 福州 350002

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堿前處理白酒丟糟生物質(zhì)轉(zhuǎn)化蘇云金芽胞桿菌培養(yǎng)基

沈小娟1, 何新新2, 王毅斌2, 丁海龍1, 關(guān) 雄2*, 鄧 波1*

1.瀘州老窖股份有限公司, 四川 瀘州 646000;2.福建農(nóng)林大學(xué), 生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室, 福州 350002

為了減少環(huán)境污染和資源浪費，利用濃香型白酒丟糟作為原料生產(chǎn)還原糖用于培養(yǎng)蘇云菌芽胞桿菌(Bt)。采用不同濃度、溫度、氫氧化鈣和氫氧化鈉前處理濃香型白酒丟糟，HPLC測定前處理液還原糖產(chǎn)量，并利用前處理液培養(yǎng)Bt。結(jié)果表明，用0.75% NaOH在100℃下處理1 h后，還原糖產(chǎn)量最高(81 g/kg)。而芽胞產(chǎn)量最高的前處理條件為1% Ca(OH)2在50℃下處理1 h，芽胞產(chǎn)量高達4.6×107CFU/mL。利用白酒丟糟前處理液培養(yǎng)Bt，既能有效的減少資源浪費和環(huán)境污染，又能實現(xiàn)Bt制劑商業(yè)化。

堿前處理；白酒丟糟；生物質(zhì)；蘇云金芽胞桿菌

木質(zhì)纖維素是由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，農(nóng)業(yè)及造紙業(yè)廢棄物是木質(zhì)纖維素的主要來源之一[1]。眾所周知，木質(zhì)素作為物理屏障保護纖維素和半纖維素，很難被降解[2]。因此，為了增加纖維素和半纖維素的降解率，需要對木質(zhì)纖維素進行前處理[3]。前處理能破壞木質(zhì)纖維素的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，增加纖維材料表面孔徑及數(shù)目，使碳水化合物與相結(jié)合的木質(zhì)素分離[4]。目前已經(jīng)有很多前處理方法，包括酸前處理[5]、氨爆炸前處理和熱水前處理等[6]。由于成本低、半纖維素轉(zhuǎn)化率高，酸前處理已被廣泛應(yīng)用于多種材料中。因為沒有加入化學(xué)物質(zhì)，熱水前處理能有效的避免污染問題且減少有毒物質(zhì)產(chǎn)生。但酸前處理和熱水前處理可能導(dǎo)致糠醛和脂肪酸的生成[7]。堿前處理能有效的去除木質(zhì)素及水解半纖維素[8]，且已有用氫氧化鈉前處理小麥梗及水稻梗的報道[9,10]。

濃香型白酒丟糟是我國白酒行業(yè)的副產(chǎn)品，年產(chǎn)量達2 000萬t[11]，且白酒丟糟產(chǎn)量呈每年遞增趨勢。白酒丟糟中含有蛋白質(zhì)、脂肪、粗纖維等[12]，現(xiàn)已應(yīng)用到多個產(chǎn)業(yè)，如生產(chǎn)飼料[13]、培養(yǎng)食用菌[14]和改良土壤[15]等，但始終存在著環(huán)境污染和資源浪費的嚴(yán)重問題。因此，我國白酒行業(yè)對白酒丟糟的處理和利用極為關(guān)注。濃香型白酒丟糟的主要成分是高粱和米糠，均含有豐富的木質(zhì)纖維素，可以做為潛在的碳源以培養(yǎng)微生物。目前已有用酒糟發(fā)酵培養(yǎng)木霉和毛孢子菌生產(chǎn)生物油[16]、琥珀酸[17]的報道。因此，為充分利用白酒丟糟，避免造成環(huán)境污染及資源浪費，同時實現(xiàn)對Bt的擴大培養(yǎng)，本研究用氫氧化鈣和氫氧化鈉對白酒丟糟進行前處理，測定前處理后還原糖的產(chǎn)量，并利用還原糖發(fā)酵生產(chǎn)Bt，進行Bt芽胞數(shù)的測定，以期為白酒丟糟的利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試樣品與菌株

白酒丟糟采集自四川省瀘州市瀘州老窖有限公司。所采集的白酒丟糟經(jīng)40℃烘箱烘干，用萬能粉碎機粉碎，過40目篩，密封裝袋，放置于-4℃?zhèn)溆?。所用Bt菌株為本實驗室分離菌株[18]。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

液體LB培養(yǎng)基：5 g酵母粉，10 g胰蛋白胨，10 g氯化鈉，蒸餾水充分溶解，調(diào)pH至7.2，定容至1 L，分裝后高壓滅菌。

固體LB培養(yǎng)基：100 mL液體LB培養(yǎng)基中加入3 g瓊脂條，高壓滅菌。

半乳糖醛酸、甘露糖、纖維二糖、鼠李糖、核糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、乙醇、甲醇、氯仿及其他化學(xué)試劑均為分析純，購自國藥化學(xué)集團有限公司；乙腈(HPLC)、甲醇(HPLC)購自MERCK公司；醋酸銨(HPLC)購自Solarbio公司；3-甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮(PMP)購自SolarBio公司。

1.3 白酒丟糟前處理

準(zhǔn)確稱取5 g烘干后的白酒丟糟粉末于250 mL錐形瓶中，加入50 mL蒸餾水，根據(jù)表1制成反應(yīng)液，于對應(yīng)的溫度下反應(yīng)1 h。反應(yīng)完畢后立即冰浴防止進一步反應(yīng)，冷卻后加入鹽酸中和反應(yīng)液。用400 mL蒸餾水分4次沖洗反應(yīng)后的白酒丟糟殘渣，于4℃、10 000 g下離心3 min，定容至500 mL。取20 mL的溶液保存于-20℃，用于還原糖含量的測定。剩余的溶液每100 mL分裝于250 mL三角瓶，高壓滅菌，用于Bt的發(fā)酵培養(yǎng)。每處理設(shè)3次重復(fù)。

表1 前處理條件

Table 1 Pretreatment conditions.

序號處理方法堿濃度(%)溫度(℃)123456Ca(OH)20.21211.01212.01214.01211.01001.050789101112NaOH0.51210.751211.01212.01210.751000.7550

1.4 HPLC還原糖的測定

分別精密稱取核糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、纖維二糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸各0.036 g，加入100 mL 10%甲醇水溶液定容至刻度，搖勻，超聲脫氣2 min，作為還原糖測定標(biāo)準(zhǔn)液保存于4℃。柱前衍生的方法參照Dai[19]的方法進行。色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.5 moL/L醋酸銨緩沖液(16∶84)；柱溫30℃；流速1.0 mL/min；檢測波長250 nm；進樣量10 μL。

1.5 Bt發(fā)酵和芽胞數(shù)的測定

培養(yǎng)液的準(zhǔn)備方法參照Yezza[20]的方法，轉(zhuǎn)接2%(V/V)的培養(yǎng)液于100 mL白酒丟糟培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵液稀釋到適合的濃度，放置于80℃水浴鍋中水浴10 min，用稀釋涂布法進行芽胞數(shù)的測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 氫氧化鈣前處理

由圖1可知，獲得最高還原糖產(chǎn)量的氫氧化鈣前處理條件為0.2% Ca(OH)2和121℃，還原糖產(chǎn)量為56 g/kg。其次為1% Ca(OH)2和50℃。在121℃處理下，隨著Ca(OH)2濃度的提高，還原糖產(chǎn)量下降。這可能由于還原糖與高濃度的堿發(fā)生了進一步的反應(yīng)，導(dǎo)致還原糖產(chǎn)量降低。

圖1 還原糖產(chǎn)量Fig.1 Yield of reducing sugars.注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 氫氧化鈉前處理

如圖1所示，當(dāng)氫氧化鈉濃度由0.5%開到1.0%時，還原糖產(chǎn)量與濃度成正比，但當(dāng)NaOH濃度為2.0%時，還原糖產(chǎn)量顯著降低。最高還原糖產(chǎn)量為0.75% NaOH 100℃處理1 h(81 g/kg)。這可能是由于隨著濃度和溫度的升高，NaOH與還原糖進一步反應(yīng)，將木糖和葡萄糖進一步降解為糠醛[21～23]。

2.3 芽胞產(chǎn)量

前處理液培養(yǎng)Bt后的芽胞產(chǎn)量如圖2所示，在稀釋倍數(shù)為107條件下， 1% Ca(OH)2和50℃處理下芽胞產(chǎn)量最高(4.6×107CFU/mL)，高于還

圖2 Bt芽胞產(chǎn)量Fig.2 Spore counts of Bt.注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

原糖產(chǎn)量最高的前處理液。這一結(jié)果可能由兩個因素造成，首先，由于Bt在一定碳氮比例下才能更好的生長，這一濃度的還原糖可能適合Bt的培養(yǎng)；其次，該處理條件為Bt提供了足夠的鈣離子，有利于Bt的生長。在1%、2%和4%的Ca(OH)2前處理液中Bt芽胞產(chǎn)量為0，這有可能是由于還原糖濃度過低及鈣離子濃度過高而抑制了Bt的生長。

3 討論

濃香型白酒丟糟營養(yǎng)豐富，含有大量的殘余蛋白、維生素及微量元素等[24]，還含有豐富的發(fā)酵產(chǎn)物如酵母和活性因子等[25]。但白酒丟糟成酸性，含水量高，極易霉?fàn)€，若處理不當(dāng)，會導(dǎo)致環(huán)境污染。雖然已有前人將生產(chǎn)乙醇的丟糟進行前處理，但很少有關(guān)白酒丟糟纖維素和半纖維素轉(zhuǎn)化為還原糖的報道。由于乙醇發(fā)酵與白酒發(fā)酵的原材料不同[26]，乙醇發(fā)酵生產(chǎn)的原材料為玉米，但白酒發(fā)酵的主要原材料為高粱與米糠，因此，乙醇丟糟與白酒丟糟成分有很大的區(qū)別。木質(zhì)纖維素作為世界上第二大再生資源[2,27]，若不加以利用，會造成資源浪費。為充分利用木質(zhì)纖維素，前人通過不同的前處理方法去除木質(zhì)素及半纖維素，并通過酶處理將纖維素轉(zhuǎn)化為還原糖[4]。眾所周知，纖維素酶價格高昂，而本研究僅用氫Ca(OH)2前處理就能獲得理想的Bt芽胞產(chǎn)量，極大地降低了Bt發(fā)酵培養(yǎng)的成本。因此，本研究用Ca(OH)2和NaOH對白酒丟糟進行前處理，將白酒丟糟中的纖維素和半纖維素轉(zhuǎn)化為還原糖，用于Bt的發(fā)酵培養(yǎng)，可有效防止白酒丟糟霉變污染環(huán)境，實現(xiàn)了資源的有效利用。

中國白酒種類繁多，按香味可分為濃香型、清香型、醬香型、米香型和其他香型，其中濃香型白酒以瀘州老窖和五糧液為代表。雖然濃香型白酒的發(fā)酵工藝與其他香型白酒的發(fā)酵工藝有少量的區(qū)別，但主要原材料等大致相同，白酒丟糟的成分差異不大。因此，堿前處理可以應(yīng)用于其他香型的白酒丟糟，但需要進行一些條件的摸索。

Bt作為廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)害蟲防治的昆蟲致病菌，對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等多種昆蟲有殺蟲活性[28]。Bt對生長繁殖所需的營養(yǎng)要求不太嚴(yán)格，在以農(nóng)副產(chǎn)品為主要原料的培養(yǎng)基中即可生長。且在前期研究中，已從白酒丟糟分離出一株Bt，說明白酒丟糟環(huán)境可達到Bt發(fā)酵生產(chǎn)的要求[18]。因此，使用白酒丟糟浸提液對Bt進行發(fā)酵，一方面既滿足了Bt擴大培養(yǎng)的需要，另一方面又實現(xiàn)了白酒丟糟資源的二次利用。且白酒丟糟價格低廉，處理簡易，大大的降低了Bt發(fā)酵培養(yǎng)成本。綜上所述，白酒丟糟發(fā)酵培養(yǎng)Bt應(yīng)用于實際生產(chǎn)具有切實的可行性。

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Transition of Distillers’ Grains Biomass by Alkali Pretreatment forBacillusthuringiensisCultivation

SHEN Xiao-juan1, HE Xin-xin2, WANG Yi-bin2, DING Hai-long1, GUAN Xiong2*, DENG Bo1*

1.LuzhouLaojiaoCo.,LTD.,SichuanLuzhou646000,China;2.KeyLaboratoryofBiopesticideandChemicalBiology,MinistryofEducation,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China

To minimize environmental contamination and waste of resource, distillers’ grains (DG) from Chinese liquor industry was used to produce reducing sugars forBacillusthuringiensis(Bt) cultivation. Ca(OH)2and NaOH were used to pretreat DG at different concentrations and temperatures. HPLC was used to determine the yield of reducing sugars, followed by cultivating Bt using distillers’ grains extract. The results showed that the highest yield of reducing sugars were obtained by 0.75% NaOH for 1 h at 100℃ (81 g/kg). However, the highest spore count was obtained by 1% Ca(OH)2for 1 h at 50℃, and it was as high as 4.6×107CFU/mL. DG methods could not only reduce industrial waste and environmental pollution, but also promote Bt industrialization.

alkali pretreatment; distillers’ grains; biomass;Bacillusthuringiensis

2016-05-30; 接受日期：2016-06-24

四川省白酒酒糟窖泥DGGE和PLFA分析及酒糟發(fā)酵研究項目(ychx00018)資助。

沈小娟，工程師，主要從事科技項目管理工作。E-mail: shenxj@lzljcom。*通信作者：關(guān)雄，教授，主要從事生物農(nóng)藥研究。E-mail: guanxfafu@126.com。鄧波，高級工程師，主要從事發(fā)酵工程研究。E-mail：dengbo@lzlj.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.05.09