脂肪酶的固定化及其在食品領(lǐng)域的應用

魏雪 孫麗超 李淑英 王鳳忠 辛鳳姣

（中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

脂肪酶的固定化及其在食品領(lǐng)域的應用

魏雪 孫麗超 李淑英 王鳳忠 辛鳳姣

（中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

脂肪酶（lipase，EC 3.1.1.3）是一類能將長鏈脂肪酸甘油酯水解成脂肪酸和單甘油酯、甘油二酯或甘油的生物酶，主要來源于動物、植物和微生物。脂肪酶在食品領(lǐng)域的應用有巨大潛能，改善脂肪酶的性能對于實現(xiàn)工業(yè)上連續(xù)化和低成本的生產(chǎn)具有重要的意義。固定化酶技術(shù)可以通過提高脂肪酶的酶活力、穩(wěn)定性及回收率顯著改善脂肪酶的性能。固定化脂肪酶在食品領(lǐng)域中被廣泛應用于糖酯合成、油脂改性、芳香味酯類化合物及抗壞血酸酯類抗氧化劑的合成。介紹了脂肪酶及固定化酶技術(shù)，并綜述了近7年固定化脂肪酶在食品領(lǐng)域中的應用。最后對如何提高脂肪酶性能進行了展望。

脂肪酶；固定化脂肪酶；食品領(lǐng)域應用

脂肪酶（lipase，EC 3.1.1.3），全稱為三酰基甘油水解酶，是一類能夠?qū)㈤L鏈脂肪酸甘油酯水解成脂肪酸和單甘油酯、甘油二酯或甘油的生物酶，可來源于動物、植物及微生物［1］。其能催化水解、酯化、酯交換等反應類型，反應具有條件溫和、耗能低、原料要求低、成品質(zhì)量高等優(yōu)點，可應用于食品、醫(yī)藥及生物柴油等領(lǐng)域，有巨大的應用潛力［2］。

雖然脂肪酶在工業(yè)上有著廣泛的應用，但大多壽命短，且游離酶在有機相中不溶解，反應過程中容易結(jié)塊，大大降低了酶的可利用率，酶回收率低，產(chǎn)品分離困難，而且很昂貴［3］。利用固定化技術(shù)將酶固定在惰性載體上，可以改善酶在有機相中的溶解性能，提高利用率、回收率等，有利于連續(xù)化和低成本生產(chǎn)，因此脂肪酶催化技術(shù)的工業(yè)化很大程度上取決于酶的固定化［4］。本文總結(jié)了近7年脂肪酶在食品領(lǐng)域的應用，以期為研究固定化脂肪酶應用于食品工業(yè)奠定基礎(chǔ)。

1 脂肪酶及固定化脂肪酶在食品領(lǐng)域的應用

1.1 脂肪酶

脂肪酶廣泛存在于動物、植物及微生物中［1］。從1834年發(fā)現(xiàn)兔胰脂肪酶活性距今已有上百年的研究歷史。

動物中脂肪酶家族主要包括脂蛋白脂肪酶（LPL）、肝脂肪酶（LIPC）、胰脂肪酶（PL）、內(nèi)皮脂肪酶（EL）、絲氨酸磷脂酶（PLA1A）、H 型脂肪酶（LH）、胰脂肪酶相關(guān)蛋白 1（PLRP1）和胰脂肪酶相關(guān)蛋白 2（PLRP2）八種成員，除 PLRP1無活性之外，其他成員均可水解甘油三酯及磷脂等脂類物質(zhì)［5-7］。

根據(jù)不同植物的基因組測序結(jié)果，目前已鑒定出1 100個GDSL脂肪酶基因，分別為擬南芥（Arabidopsis thaliana）的GDSL家族脂肪酶108個成員［8，9］，水稻（Oryza sativa）114個成員，玉米（Zea mays）53個成員，江南卷柏（Selaginella moellendorffii）90個成員，蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）88個成員，葡萄（Vitis vinifera）96個成員、高粱（Sorghum bicolour）130個成員、楊樹（Populus trichocarpa）126個成員、小立碗蘚（Physcomitrella patens）57個成員和幾種藻類植物的200多個成員［9］。

產(chǎn)脂肪酶的微生物種類很多，迄今已報道的有65個屬，細菌28個屬，酵母菌10個屬，放線菌4個屬，其它真菌23個屬［10］。

1.2 脂肪酶的結(jié)構(gòu)及酶學性質(zhì)

不同物種來源的脂肪酶同源性相對較低，氨基酸組成和分子量大小存在較大差異，如Rhizopus oryzae脂肪酶大小為 16.25 kD［11］，而來源于人體的hormone-sensitive脂肪酶分子量高達 116.6 kD［12，13］。不同來源的脂肪酶在一級結(jié)構(gòu)氨基酸序列上差異極大，但二級結(jié)構(gòu)相對比較保守，為典型的α/β水解酶折疊（α/β hydrolase fold）結(jié)構(gòu)，如圖1-A所示。其中，β折疊數(shù)量及其扭曲角度和α螺旋的數(shù)量和位置不同［14，15］。脂肪酶的催化三聯(lián)體中心為絲氨酸-天冬氨酸-組氨酸，該催化中心在氨基酸序列和空間排布上也極為保守［14］。圖1-B所示為脂肪酶TLL（Thermomyces lanuginose lipase）的突變體TLL（S146A）的三維結(jié)構(gòu)（PDB編碼：1GT6），其催化三聯(lián)體的146位絲氨酸已被突變成丙氨酸，以便于結(jié)晶［16］。

圖1 脂肪酶的結(jié)構(gòu)

脂肪酶的天然底物通常是長鏈甘油三酯等不易溶于水的化合物，當催化水溶性底物或天然底物的濃度低于其溶解度時，脂肪酶表現(xiàn)出極低催化活力，當?shù)孜餄舛瘸^其溶解度時，會出現(xiàn)“油水”界面（Water-oil interface），脂肪酶的催化活力會急劇提高，直到最大催化活力，這種獨特的催化特性被稱為“界面激活”（Interfacial activation）現(xiàn)象。脂肪酶在“油水”兩相體系中催化的水解反應不符合“米氏”動力學的一般規(guī)律［17］。

蛋白質(zhì)晶體學研究表明，脂肪酶在溶液中存在兩種天然構(gòu)象：一種是閉合構(gòu)象（Closed conformation），此時脂肪酶的催化活性中心被一段“蓋子”結(jié)構(gòu)覆蓋，底物無法進入催化口袋，催化反應無法進行；另外一種構(gòu)象是“蓋子”處于打開狀態(tài)的構(gòu)象（Open conformation），“蓋子”區(qū)域側(cè)向移動，將催化中心暴露出來，底物可以自由進入催化口袋，催化反應得以順利發(fā)生［18］。

不同來源脂肪酶的最適pH值不同，大多為中性或堿性脂肪酶；最適溫度相差迥異，就微生物來源脂肪酶來講，真菌來源脂肪酶的最適溫度相對較低，而細菌脂肪酶則相對較高。就溫度穩(wěn)定性而言，脂肪酶在水相中對溫度較敏感，而在有機相中，其穩(wěn)定性大大提高［19］。脂肪酶對不同底物脂肪酸長度和飽和度、底物甘油三酯不同位置酯鍵的識別和水解、底物立體對映結(jié)構(gòu)1，3位酯鍵的識別和水解均具有選擇性，脂肪酶的底物專一性取決于酶的分子結(jié)構(gòu)尤其是催化中心結(jié)構(gòu)［20］。

1.3 固定化脂肪酶在食品領(lǐng)域的應用

1.3.1 固定化酶技術(shù) 固定化酶技術(shù)是利用固體材料將酶束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi)，但仍具有催化活性，并可回收及重復使用的一類技術(shù)。利用固定化技術(shù)將脂肪酶固定在惰性載體上，可以提高其在有機相中的擴散效果和熱穩(wěn)定性，同時有利于酶的回收、連續(xù)化和低成本生產(chǎn)。到目前為止，用于固定化酶的方法主要有包埋法、吸附法、共價結(jié)合法及交聯(lián)法；載體方面，已經(jīng)有不同形態(tài)、不同功能的載體被用于固定化酶，包括天然高分子材料、無機材料、合成高分子材料以及具有特定功能的新型載體材料等［21］。

固定化酶技術(shù)可以較好地提高脂肪酶的活性。Ghattas等［22］將Rhizopus oryzae脂肪酶完全吸附到辛基-瓊脂糖和C-18柱上，結(jié)果表明，固定化后的脂肪酶為超激活狀態(tài)，其活性大約為游離酶的2.5倍。Yan等［23］將Yarrowia lipolytica脂肪酶2固定在大孔樹脂，比活性為809.751 U/g，為游離酶的2.1倍。

固定化酶技術(shù)可以顯著提高脂肪酶的操作穩(wěn)定性。Aybast?er等［24］將Thermomyces lanuginosus脂肪酶共價結(jié)合在一種新型微孔苯乙烯-二乙烯苯聚戊二醛共聚物上，結(jié)果表明，通過該技術(shù)制備出的固定化脂肪酶具有很強的操作穩(wěn)定性，24 h內(nèi)被連續(xù)重復使用10個批次后，僅有12%的酶失活。Khoobi等［25］通過物理吸附及共價連接，將Thermomyces lanuginosa脂肪酶固定在磁性納米顆粒，結(jié)果表明，與游離酶進行對比，在聚乙烯亞胺磁性納米顆粒MNPs@PEI-GLU上的脂肪酶使用12個循環(huán)后仍保留最初活性的80%。

固定化酶技術(shù)提高了脂肪酶的熱穩(wěn)定性。Li等［26］將Candida sp. 99-125脂肪酶通過物理吸附固定在硅烷化介孔材料SBA-15，并將其在50℃孵育觀測熱穩(wěn)定性，結(jié)果表明，與游離酶相比，固定后的脂肪酶的活性損失率低，熱穩(wěn)定性較高。Jun等［27］通過雙固定，即大孔聚丙烯酸酯物理吸附和硅基修飾多肽silaffin R1介導的生物硅化固定Candida antarctica脂肪酶B，結(jié)果表明，雙固定后脂肪酶的T-50（60）從45℃提高到72℃，且多次循環(huán)后無活性損失。

1.3.2 固定化脂肪酶在食品領(lǐng)域的應用

1.3.2.1 合成糖酯 糖酯是一類以糖基為親水基團，脂肪酸為疏水基團，同時具有親水性和親油性的非離子型生物表面活性劑。糖酯類食品添加劑具有優(yōu)良表面活性、生物可降解性、無臭、無刺激等優(yōu)點，某些糖酯還具有抑菌、抗病毒等活性，現(xiàn)已作為食品乳化劑、質(zhì)地改良劑、保鮮殺菌劑、抗老化劑等廣泛應用于食品工業(yè)。

Adnani等［28］將固定化脂肪酶Novozym 435（將Candida antarctica脂肪酶固定在大孔樹脂），以木糖醇和硬脂酸為底物，己烷為反應介質(zhì)，合成木糖醇脂肪酸酯，結(jié)果表明，實際產(chǎn)率高達96.10%。Zaidan等［29］通過共價鍵結(jié)合及物理吸附的方法，將Candida rugosa脂肪酶（CRL）分別固定在氨基活化云母（Amino-CRL）及納米反應器（NER-CRL）上，催化合成乳糖酯類，結(jié)果表明，與游離的CRL相比，Amino-CRL及NER-CRL比活分別提高了2.4倍和2.6倍，并且都表現(xiàn)出顯著的操作穩(wěn)定性。

1.3.2.2 油脂改性 油脂改性是食品加工過程中的一個重要環(huán)節(jié)。改變油脂的物理化學性質(zhì)，開發(fā)較高營養(yǎng)價值的油脂具有重大的價值和市場潛力。脂肪酶具有位置特異性和脂肪酸特異性，可以作為油脂改性的生物催化劑，通過催化酯交換、酯轉(zhuǎn)移、水解等反應，可以使便宜的、營養(yǎng)價值低的油脂升級為昂貴的、營養(yǎng)價值高的油脂，所以在油脂工業(yè)中有廣泛應用。

Esenduran等［30］將商業(yè)非選擇性Candida Antarctica脂肪酶（Novozym 435）和Rhizopus oryzae脂肪酶固定在有機-無機雜化有機硅聚乙烯醇基質(zhì)上，通過酶法酯交換，調(diào)整乳脂的物理性質(zhì)，獲得了具有適合用于食品工業(yè)生產(chǎn)的脂肪混合物。Tecel?o等［31］利用商業(yè)性固定化脂肪酶Lipozyme RM IM，Lipozyme TL IM和Novozym 435，合成ω-3多不飽和脂肪酸，結(jié)果表明，在Novozym 435、Lipozyme RM IM、游離酶及Lipozyme TL IM催化下，生成的ω-3多不飽和脂肪酸的摩爾比例分別為21.6%、20%、8.5%及8.2%。

1.3.2.3 合成芳香味酯類化合物 芳香化合物酯類化合物由短鏈脂肪酸和醇類化合物組成，是風味和香味的主要組分，在制藥、化妝品和食品等工業(yè)領(lǐng)域具有廣泛的應用，如丁酸丁酯、乙酸異戊酯、乙酸香葉酯和丁酸香葉酯等芳香味脂類化合物常用在食品工業(yè)中調(diào)節(jié)食品風味。雖然芳香化合物可以通過傳統(tǒng)的方法如化學合成或從自然資源中提取得到，但是利用這些方法可能帶有許多副產(chǎn)物或毒性物質(zhì)。通過脂肪酶催化酯化合成可以有效避免這些弊端。

Matte等［32］將Thermomyces lanuginosus脂肪酶（TLL）多點共價固定在天然Immobead 150上，合成丁酸丁酯和丁酸異戊酯，結(jié)果表明，TLL被固定后，70℃下的半衰期為5.32 h，比游離態(tài)的穩(wěn)定性約高3倍，固定化酶在丙酮、己烷和異辛烷中表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性，酯化24 h后，收率在60%以上。Damnjanovi?等［33］將Candida rugosa 脂肪酶共價固定在sepabeads?ec-ep上催化丁酸和香葉醇的酯化生成丁酸香葉酯。Gupta等［34］也曾將TLL固定在不同的聚丙烯腈納米纖維膜上，合成乙酸香葉酯，通過物理吸附和共價固定后酶的酯交換能力分別提高了32倍及9倍。

1.3.2.4 合成抗壞血酸酯類抗氧化劑 異抗壞血酸可作為抗氧化劑廣泛用于食品工業(yè)。然而，由于其高度親水的性質(zhì)，限制其在油脂類食品中的應用。將異抗壞血酸轉(zhuǎn)化為異抗壞血酸酯類物質(zhì)可以有效提高其親脂性，能更好地應用于基于脂質(zhì)的食品中。利用固定化脂肪酶催化反應，可在一定程度上提高異抗壞血酸酯類物質(zhì)的產(chǎn)率。

Sun等［35］利用固定化脂肪酶Novozym 435，將D-異抗壞血酸與棕櫚酸轉(zhuǎn)化為異抗壞血酸棕櫚酸酯，產(chǎn)率高達95.32%；Santibá?ez等［36］利用Pseudomonas stutzeri脂肪酶和固定化脂肪酶Novozym 435，合成異抗壞血酸棕櫚酸酯，最優(yōu)反應條件下，固定化Pseudomonas stutzeri脂肪酶與Novozym435催化可分別獲得57%及51%的底物轉(zhuǎn)化率。

Reyes-Duarte等［37］利用兩種固定化脂肪酶Lipozyme TL IM和Novozym 435合成6-O-抗壞血酸油酸酯和6-O-抗壞血酸棕櫚酸酯，其產(chǎn)率分別為前者（64%和27%）、后者（84%和33%），且合成的6-O-抗壞血酸油酸酯和6-O-抗壞血酸棕櫚酸酯均表現(xiàn)出優(yōu)異的抗氧化能力。

1.3.2.5 其他 固定化脂肪酶在食品領(lǐng)域除用于糖酯合成、油脂改性、芳香味酯類化合物及抗壞血酸酯類抗氧化劑的合成外，還可用于處理餐飲廢油、果渣及生成一些重要產(chǎn)物。Lopresto等［38］將Pseudomonas cepacia脂肪酶共價結(jié)合到環(huán)氧丙烯酸樹脂上，催化煎炸廢油等廢棄植物油合成生物柴油。Yücel等［39］將Thermomyces lanuginosus脂肪酶用共價法固定在橄欖果渣上，制備生物柴油，最優(yōu)反應條件下，最高轉(zhuǎn)化率為93%，且固定化脂肪酶重復利用10次后仍保留80%以上的活性，操作穩(wěn)定性顯著。Zhong等［40］利用固定化Candida rugosa脂肪酶合成蔗糖-6-乙酸酯，結(jié)果表明，最優(yōu)反應條件下，蔗糖-6-乙酸酯產(chǎn)率高達78.68%，經(jīng)過6次循環(huán)后仍保持高催化活性，熱穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性顯著改善。

2 展望

根據(jù)我國食品工業(yè)十三五規(guī)劃，目前食品調(diào)味品的行業(yè)景氣度呈現(xiàn)最佳。雖然脂肪酶已在食品添加劑的合成及油脂改性等食品領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用，但仍具有很大的開發(fā)潛能，如應用于更多品種的食品添加劑合成。因此，利用固定化酶技術(shù)提高脂肪酶的酶活力、穩(wěn)定性及回收率等性能，使脂肪酶更好地應用于食品領(lǐng)域，仍具有廣闊的研究空間。

固定化酶技術(shù)雖然可以在一定程度上改善脂肪酶的特性，但是卻無法從本質(zhì)上改造脂肪酶。分子水平上，根據(jù)對酶結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的了解程度，進行理性或非理性設(shè)計，是提高脂肪酶特性的重要方法。理性設(shè)計是指對酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系了解較透徹情況下鑒定出酶分子的關(guān)鍵活性位點，并通過取代、插入或刪除等手段對需要突變的活性位點進行精確設(shè)計，從而改變酶學性質(zhì)。非理性設(shè)計包括定向進化技術(shù)（directed evolution）和化學修飾法。其中，定向進化技術(shù)不需要對酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系深刻了解，只需通過隨機突變和片段重組模擬自然進化，構(gòu)建一定容量的突變庫，通過高通量篩選，最后得到預期性質(zhì)的突變體，但這種方法缺乏目的性?；瘜W修飾則需要根據(jù)酶的特性以及需求來選擇合適的化學試劑及修飾方法，但通常伴隨酶活性的損失和酶穩(wěn)定性的下降，且不同批次化學修飾的酶分子之間存在差異性，因此，這種方法在酶改造中的應用也較為受限。而將理性設(shè)計和非理性設(shè)計相結(jié)合的半理性設(shè)計，是在對酶的結(jié)構(gòu)有一定了解后，選取多個靶標位點，構(gòu)建較小的突變庫，簡單篩選后進而得到優(yōu)異的突變體。因此，理性設(shè)計和半理性設(shè)計是未來分子水平上對脂肪酶改造的主要方向。實際工業(yè)生產(chǎn)過程中，還要考慮如何提高脂肪酶的異源表達量。切除N末端冗余肽段、密碼子優(yōu)化、分子伴侶共表達等方法的研究是提高脂肪酶異源表達水平的重要方式。綜上所述，通過這些設(shè)計思路改善脂肪酶性能進而擴展其在食品領(lǐng)域的應用，將具有很大的研究前景。

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（責任編輯 馬鑫）

Immobilization of Lipase and Its Application in Food Industry

WEI Xue SUN Li-chao LI Shu-ying WANG Feng-zhong XIN Feng-jiao
（Institute of Food Science and Technology in CAAS，Beijing 100193）

Lipase（EC 3.1.1.3）is a kind of enzyme that can hydrolyze long chain fatty acid esters into fatty acid and monoglyceride，diglyceride or glycerol，and it is mainly from animals，plants and microorganisms. Considering the great application potential of lipase in the food industry，optimization of lipase performance is of significance for achieving continuous and low-cost production. Immobilized enzyme technology significantly enhanced the lipase performance by increasing the enzymatic activity，stability and the recovery rate. Therefore，immobilized lipase is widely used in the food industry，including the enzymatic synthesis of glycolipids，oil modification，and the synthesis of aromatic ester compounds and ascorbyl esters. This article introduces the lipase and the immobilized enzyme technology，and mainly reviews the application of immobilized lipase in the food industry in last seven years，finally prospects how to improve the performance of lipase.

lipase；immobilized lipase；application in food industry

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.008

2016-04-19

國家自然科學基金面上項目（31571963）

魏雪，女，碩士，研究方向：微生物分子生物學與基因工程；E-mail：15701202366@163.com

王鳳忠，男，研究員，研究方向：功能食品與生物活性物質(zhì)；E-mail：wangfengzhong@sina.com辛鳳姣，女，研究員，研究方向：微生物分子生物學與基因工程；E-mail：xinfengjiao@caas.cn