抗金黃色葡萄球菌單鏈抗體（scFv）的原核表達(dá)及蛋白純化

李晶泉徐永平，2王熙濤李媛王麗麗，2李曉宇，2

（1. 大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116024；2. 教育部動(dòng)物性食品安全保障技術(shù)工程研究中心，大連 116620）

抗金黃色葡萄球菌單鏈抗體（scFv）的原核表達(dá)及蛋白純化

李晶泉1徐永平1，2王熙濤1李媛1王麗麗1，2李曉宇1，2

（1. 大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116024；2. 教育部動(dòng)物性食品安全保障技術(shù)工程研究中心，大連 116620）

旨在將來(lái)源于雞的金黃色葡萄球菌單鏈抗體（scFv）進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)，獲得有抗體活性的目的蛋白。構(gòu)建含有目的抗體基因的重組質(zhì)粒，將此質(zhì)粒進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)并鑒定所獲得蛋白的生物活性。結(jié)果顯示，（1）成功構(gòu)建了含有金黃色葡萄球菌單鏈抗體（scFv）的重組質(zhì)粒pCold I-scFv，質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株中；（2）經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)后，目的蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中；（3）使用4 mol/L 尿素成功地將包涵體變性溶出；（4）通過(guò)柱層析法及透析法獲得了純化及復(fù)性效果較好的目的蛋白；（5）間接ELISA鑒定證實(shí)所獲蛋白具有金黃色葡糖球菌抗體活性。通過(guò)質(zhì)粒構(gòu)建及原核誘導(dǎo)表達(dá)、包涵體溶出和復(fù)性等步驟，最終獲得了有金黃色葡萄球菌抗體活性的目的蛋白。

可溶性表達(dá)；包涵體；蛋白純化；蛋白復(fù)性；有活性的蛋白

金黃色葡萄球菌是人和動(dòng)物的一種主要病原菌［1］，它能引起膿腫、膿皰病和乳腺炎等感染性疾病，也能引起肺炎、敗血病和中毒性休克綜合征等致死性疾?。?］。目前為止，對(duì)金黃色葡萄球菌感染的治療主要以抗生素為主，但濫用抗生素導(dǎo)致耐藥菌頻現(xiàn)，禽畜產(chǎn)品中抗生素的殘留也對(duì)食品安全和人體健康造成了嚴(yán)重威脅［3，4］。因此，尋找抗生素的替代品是解決抗生素各種弊端的一種有效的途徑。

卵黃抗體（IgY）是一類具有殺滅病菌作用的抗生素替代品。這種抗體是在特異性抗原刺激下由禽類B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生并轉(zhuǎn)移到卵黃中的多克隆抗體，以其性質(zhì)穩(wěn)定、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)而成為特別具有應(yīng)用前景的抗生素替代品。本實(shí)驗(yàn)室多年來(lái)一直致力于抗金黃色葡萄球菌IgY的制備和應(yīng)用，在其制備方面采用免疫蛋雞的方法，純化方面一直采用的是傳統(tǒng)的水稀法［5，6］及硫酸銨和硫酸鈉鹽析結(jié)合的方法［7］。免疫蛋雞所獲得的特異性IgY僅占IgY總含量的2%-10%，且分離純化過(guò)程繁瑣，因此，如何獲得高活性、性能穩(wěn)定，甚至能通過(guò)基因工程菌大量表達(dá)的IgY，是突破IgY難以大量提純瓶頸問(wèn)題的關(guān)鍵，也是研究IgY抗菌機(jī)理必須解決的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)PCR方法擴(kuò)增IgY基因的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，并通過(guò)噬菌體展示技術(shù)將重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的連接產(chǎn)物表達(dá)于噬菌體的表面，運(yùn)用生物淘選的方法淘選到了一條重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)序列完整的金黃色葡萄球菌單鏈抗體（singlechain fragment variable，scFv）基因［8］。本研究主要針對(duì)此基因的原核蛋白表達(dá)方法，通過(guò)蛋白小量誘導(dǎo)表達(dá)、大量誘導(dǎo)表達(dá)、包涵體溶解、復(fù)性及蛋白純化和濃縮等手段，以期獲得有生物活性的目的蛋白抗體。

1 材料與方法

1.1 材料

金黃色葡萄球菌（CVCC545）購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。原核表達(dá)載體pColdⅠ、宿主菌大腸桿菌 JM109、大腸桿菌 BL21、PCR擴(kuò)增用酶PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、DL2000 DNA Marker、Premixed Protein Marker（Broad）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；Precision Plus ProteinTMStandards購(gòu)自 Life Technologies公司；In-Fusion HD Cloning Plus購(gòu) 自Clotech公 司；Antibody BSA free Mouse monoclonal IgG購(gòu)自Qiagen公司；Rabbit anti Mouse IgG HRP購(gòu)自Invitrogen公司；HiTrapTMTALON crude，5 mL TALON SuperflowTM購(gòu)自美國(guó)通用電氣公司；SnakeSkinTMPleated Dialysis Tubing；3500 MWCO購(gòu)自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌抗體scFv基因的擴(kuò)增 根據(jù)金黃色葡萄球菌抗體scFv基因序列和pCold I載體序列設(shè)計(jì)了1對(duì)In-Fusion引物。其中上游引物INF：5'-GAAGGTAGGCATATGGCCGTGACGTTGG AC-3'，劃線處為scFv基因上的序列，未劃線處為pCold I載體上的序列；下游引物INR：5'-AGACTGC AGGTCGACTTATGGTTCCATGCAACAGCCG-3'，劃線處為scFv基因上的序列，未劃線處為pCold I載體上的序列。以噬菌體文庫(kù)淘選到的scFv基因?yàn)槟０?，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系如下：ScFVDNA片段 1 μL，INF（20 pmol/μL）0.5 μL，INR（20 pmol/μL）0.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L each）8 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U/μL）0.5 μL，5×PrimeSTAR PCR Buffer 10 μL，dH2O補(bǔ)充至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性1 min；98℃變性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸1 min，循環(huán)擴(kuò)增30次。擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析，并回收目的條帶。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 表達(dá)載體pCold I用Xho I、Nde I進(jìn)行雙酶切，雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收后與上述純化的PCR產(chǎn)物用In-Fusion HD Enzyme 50℃連接15 min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB/Amp（50 μg/mL）平板篩選陽(yáng)性克隆，37℃培養(yǎng)箱倒置過(guò)夜培養(yǎng)，然后挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，取菌落PCR呈陽(yáng)性的重組子提取質(zhì)粒DNA，將重組質(zhì)粒pCold I -scFv送往寶生物工程（大連）有限公司測(cè)序。

1.2.3 重組蛋白的小量表達(dá) 測(cè)序讀碼框架正確的重組質(zhì)粒pCold I -scFv轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB/Amp（50 μg/mL）平板篩選陽(yáng)性克隆，挑取單克隆接種至2 mL LB/Amp（50 μg/mL）液體培養(yǎng)基，置于37℃振蕩培養(yǎng)，次日取過(guò)夜培養(yǎng)的種培養(yǎng)液，按1/100的比例接種至3 mL LB/Amp（50 μg/mL）液體培養(yǎng)基中，當(dāng)菌體生長(zhǎng)至OD600約為0.6時(shí)，15℃培養(yǎng)15 min，之后添加適量的100 mmol/L IPTG至終濃度為1 mmol/L，15℃誘導(dǎo)培養(yǎng)22 h。集菌后，取2.0 OD相當(dāng)?shù)木w加入320 μL PBS緩沖液（137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/LNa2HPO4，2 mmol/L KHPO4，pH7.4），將細(xì)菌懸濁后進(jìn)行冰浴超聲破碎，之后將破碎液進(jìn)行離心（12 000 r/min，5 min）。取各抽提液（全蛋白、上清、沉淀）8 μL（0.05 OD相當(dāng)），加入2 μL 5×SDS Loading Buffer，95℃加熱10 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.2.4 重組蛋白的大量表達(dá)及包涵體的洗滌和溶出 將經(jīng)小量表達(dá)優(yōu)化后的pCold I -scFv甘油保存菌種50 μL，接種至5 mL LB/Amp（50 μg/mL）液體培養(yǎng)基中，在16.5φ玻璃試管內(nèi)，37℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)。次日取過(guò)夜培養(yǎng)的種培養(yǎng)液，按1/100的比例接種至500 mL LB/Amp（50 μg/mL）液體培養(yǎng)基中，在2 L 搖瓶?jī)?nèi)，37℃搖床震蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)方法同小量表達(dá)。將大量誘導(dǎo)表達(dá)的菌體于4℃4 000 r/min 離心40 min，收集菌體，用不含尿素的PBS緩沖液洗滌菌體兩次，之后用含4 mol/L 尿素的Sonication buffer（50 mmol/L Sodium phosphate，300 mmol/L NaCl，5 mmol/L Imidazole，4 mol/L Urea，pH8.0）將菌體重懸，冰浴超聲破碎，繼而4℃，12 000 r/min離心40 min，取上清。上清液即是包涵體的溶解液，使用0.45 μmol/L 過(guò)濾膜將上清進(jìn)行過(guò)濾，即得到了較純的蛋白上清液，為蛋白的進(jìn)一步純化和復(fù)性做好準(zhǔn)備。

1.2.5 重組蛋白的純化 溶出的包涵體使用GE HiTrap TALON crude，5 mL TALON Superflow 進(jìn)行柱層析純化。首先將GE HiTrap TALON crude，5 mL TALON Superflow純化柱與AKTA prime Plus機(jī)器相連接，用10倍柱體積的MilliQ水和Buffer A（50 mmol/L Sodium phosphate，300 mmol/L NaCl，5 mmol/L Imidazole，pH8.0）對(duì)樹脂進(jìn)行平衡。然后進(jìn)行上樣及清洗，將AKTA prime Plus機(jī)器的進(jìn)樣管放于1.2.4過(guò)濾后的蛋白上清液中，以0.5 mL/min的速度上樣。待樣品流穿后，用20倍柱體積的Buffer A洗3次柱，充分除去非特異結(jié)合的蛋白。在AKTA prime Plus機(jī)器的引導(dǎo)下，10倍柱體積的Buffer A和10倍 柱 體 積 的Buffer B（50 mmol/L Sodium phosphate，300 mmol/L NaCl，300 mmol/L Imidazole，4 mol/L Urea，pH8.0）以1 mL/min的流速混合，混合液洗脫Buffer咪唑的濃度由5 mmol/L逐漸提高至300 mmol/L。目的蛋白在合適的咪唑濃度下被洗脫下來(lái)。使用AKTA prime Plus的自動(dòng)收集盤對(duì)洗脫樣品進(jìn)行收集，每1.1 mL收集一管。從每管樣品中取5 μL樣品，15% SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，檢測(cè)目的樣本的分布。

1.2.6 重組蛋白的復(fù)性 將收集后的目的蛋白裝入透析袋，在燒杯中用20倍收集蛋白量的PBS緩沖液（137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KHPO4，pH7.4）進(jìn)行3次透析。前2次 2 h/次，第3次過(guò)夜。將透析后的蛋白放入15 mL tube中，分別取2、4和8 μL進(jìn)行電泳，通過(guò)BSA及ImageMaster 1D version 3.0解析軟件對(duì)透析后蛋白進(jìn)行定量分析。

1.2.7 重組蛋白Western blot鑒定 將PVDF膜、濾紙分別剪切成與凝膠相同大小，使用轉(zhuǎn)膜緩沖液處理后，按濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙的順序依次放在轉(zhuǎn)膜儀電極板之間，開始轉(zhuǎn)膜。將PVDF膜置于含1.5% BSA 的10 mL 封閉液中，4℃平放過(guò)夜封閉。使用稀釋后的Antibody BSA free Mouse monoclonal IgG溶液5 mL，進(jìn)行一次抗體反應(yīng)1 h。TBST緩沖液（20 mL）洗滌2次；TBS緩沖液洗滌3次。使用稀釋后的Rabbit anti Mouse IgG HRP抗體溶液5 mL，進(jìn)行二次抗體反應(yīng)1 h。TBST緩沖液（20 mL）洗滌2次；TBS緩 沖 液 洗 滌3次。1 mL TrueBlue Peroxidase Substrate顯色1 min。

1.2.8 重組蛋白間接ELISA活性鑒定 以金黃色葡萄球菌為抗原檢測(cè)原核表達(dá)的蛋白是否有抗體活性。將購(gòu)買的金黃色葡萄球菌接種到TSB（胰蛋白胨1.5%，大豆蛋白胨0.5%，氯化鈉0.5%）培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，第2天，4℃，8 000 r/min，離心10 min，收集菌體，將獲得的菌體用PBS重懸，洗滌3次，之后用1%甲醛37℃滅活24 h，再用PBS重懸洗滌3次，用生理鹽水稀釋備用。為了確保實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)性，實(shí)驗(yàn)用同樣處理的大腸桿菌做為陰性對(duì)照。首先，用100 μL 濃度為0.02 mg/mL的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌過(guò)夜包被ELISA板，第2天，傾倒包被液，使用100 μL封閉液（含1.0% BSA）37℃封閉1 h，棄孔中溶液，然后每孔加入100 μL 濃度為0.016 mg/mL的可溶性蛋白，于37℃孵育1 h，棄孔中溶液，用TBST洗滌3次；之后每孔加入100 μL1∶1 000稀釋的Antibody BSA free Mouse monoclonal IgG，37℃孵育1 h，棄孔中溶液，用TBST洗滌3次；再加入100 μL 1∶1 000稀釋的Rabbit anti Mouse IgG HRP抗體，37℃孵育1 h，棄孔中溶液，用TBST洗滌5次；加100 μL TMBZ顯色液，室溫密閉顯色20 min，之后加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止液，立即在TECAN Infinite F200酶標(biāo)儀上讀取A450值。

2 結(jié)果

2.1 金黃色葡萄球菌抗體scFv基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

使用In-Fusion引物對(duì)scFv基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的片段見圖1。使用Nde I 和Xho I對(duì)pCold I載體進(jìn)行酶切，酶切結(jié)果見圖2。

圖1 scFv片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 pCold I載體Nde I和Xho I酶切前后結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及測(cè)序

隨機(jī)從轉(zhuǎn)化平皿上挑取4個(gè)pCold I -scFv重組菌落，使用pCold I載體上的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果（圖3）顯示，重組菌落擴(kuò)增后得到了1 kb左右的核酸條帶，擴(kuò)增條帶大小與目的基因大小吻合。測(cè)序結(jié)果顯示所構(gòu)建的重組質(zhì)粒讀碼框完整，讀碼正確，說(shuō)明目的重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖3 重組菌落PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.3 重組蛋白的小量表達(dá)及檢測(cè)

重組質(zhì)粒pCold I-scFv轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21感受態(tài)細(xì)胞，用終濃度為1 mmol/L 的IPTG，15℃誘導(dǎo)培養(yǎng)22 h，用SDS-PAGE電泳分析表達(dá)產(chǎn)物。結(jié)果顯示，有目的蛋白表達(dá)，重組蛋白分子量約為32 kD，與預(yù)測(cè)的分子量一致。大量收集菌體并破碎、離心，分別取等量全蛋白、上清和沉淀，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的可溶性。結(jié)果（圖4）表明，目的蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中。

圖4 pCold I-scFv小量誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的可溶性檢測(cè)

2.4 重組蛋白包涵體的溶出及柱層析純化

為了獲得目的蛋白，本研究將重組質(zhì)粒pCold I-scFv用終濃度為1 mmol/L的 IPTG 500 mL LB/Amp（50 μg/mL）液體培養(yǎng)基大量誘導(dǎo)表達(dá)后，按照1.2.4的方法，使用4 mol/L的尿素對(duì)包涵體進(jìn)行處理，將包涵體蛋白溶出，如圖5所示，經(jīng)處理后，目的蛋白都溶解于上清液中。表達(dá)的目的蛋白羧基端含組氨酸標(biāo)簽，因此考慮利用親和柱分離目的蛋白，GE HiTrap TALON crude，5 mL TALON Superflow層析介質(zhì)含有Co2+離子四配位螯合基團(tuán)，其與瓊脂糖微球高度交聯(lián)。這種層析介質(zhì)高選擇性結(jié)合含有組氨酸標(biāo)簽的蛋白，低親和性結(jié)合宿主蛋白，從而提供更低的純化背景。變性狀態(tài)的目的蛋白使用0.45 μmol/L 的過(guò)濾膜過(guò)濾后，用GE HiTrap TALON crude，5 mL TALON Superflow 進(jìn)行柱層析純化。純化過(guò)程中，將GE HiTrap TALON crude，5 mL TALON Superflow層析柱與AKTA prime Plus機(jī)器相連接，使用AKTA prime Plus機(jī)器進(jìn)行層析柱的上樣，待樣品流穿后，用20倍柱體積的Buffer A在低咪唑濃度下洗3次柱，充分除去非特異結(jié)合的蛋白，3次清洗狀態(tài)如圖6所示。之后使用AKTA prime Plus機(jī)器將10倍柱體積的Buffer A和10倍柱體積的Buffer B緩慢混合，混合的過(guò)程中咪唑的濃度按線性梯度由5 mmol/L提高到300 mmol/L，目的蛋白在合適的咪唑濃度下洗脫下來(lái)。在純化的過(guò)程中AKTA prime Plus的自動(dòng)收集盤對(duì)洗脫樣品進(jìn)行收集，每1.1 mL收集一管。由AKTA prime Plus的出峰情況（圖7）可以看出，目的蛋白從第40管開始大量溶出，從第40-69管中各取5 μL樣品，進(jìn)行15% SDSPAGE凝膠電泳，檢測(cè)目的樣本的分布，結(jié)果如圖8所示。

圖5 包涵體溶出后SDS-PAGE電泳檢測(cè)

圖6 非目的蛋白洗脫情況分析

圖 7 pCold I-scFv蛋白溶出

2.5 重組蛋白的收集與透析復(fù)性

收集目的蛋白第40-69管共計(jì)約34.1 mL。使用收集樣品20倍量的PBS在4℃對(duì)蛋白進(jìn)行3次透析。前2次 2 h/次，第3次過(guò)夜透析，透析過(guò)程中未見絮狀沉淀，透析后也未見沉淀產(chǎn)生，證明復(fù)性成功。復(fù)性后共收集樣品32 mL，取少量復(fù)性后蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖9-A所示；取少量復(fù)性后蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果如圖9-B所示。使用ImageMaster 1D version 3.0解析軟件根據(jù)定量蛋白BSA進(jìn)行定量分析，分析結(jié)果顯示目的蛋白的濃度為0.16 mg/mL，目的蛋白的純度為98%。32 mL透析后的目的蛋白總量為5.12 mg，蛋白收率為10 mg/L菌體。

圖8 目的蛋白梯度洗脫液情況分析

圖9 pCold I-scFv蛋白的透析（A）及Western blot檢測(cè)（B）

2.6 重組蛋白間接ELISA活性鑒定

實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌為陰性對(duì)照，使用蛋白上帶有的his標(biāo)簽對(duì)應(yīng)的一抗和二抗檢測(cè)可溶性蛋白與金黃色葡萄球菌（金葡菌）抗原及大腸桿菌的結(jié)合能力。間接ELISA的結(jié)果（圖10）顯示，pCold I -scFv蛋白與金黃色葡萄球菌抗原的結(jié)合能力明顯高于與大腸桿菌的結(jié)合能力，說(shuō)明通過(guò)原核表達(dá)及純化、透析得到的是有金黃色葡萄球菌生物活性的目的蛋白。

圖10 pCold I-scFv蛋白ELISA檢測(cè)

3 討論

IgY抗體是一種具有較大應(yīng)用潛力的抗體，目前，已有大量添加IgY的產(chǎn)品，如發(fā)酵酸奶、衛(wèi)生消毒產(chǎn)品、功能性食品及化妝品等上市銷售［9，10］。IgY可應(yīng)用于醫(yī)療診斷及治療，通過(guò)臨床驗(yàn)證也顯示出良好效果［11-20］。雖然IgY抗體有著較大的應(yīng)用潛力，但是傳統(tǒng)的制備IgY抗體的方法特異性抗體的得率較低、純化也比較復(fù)雜；隨著生物科學(xué)的發(fā)展，采用基因工程方法制備IgY單鏈抗體的技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，通過(guò)體外表達(dá)的方式得到具有商業(yè)應(yīng)用價(jià)值的單鏈抗體也成為眾多研究者追捧的目標(biāo)。

大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)具有繁殖快、遺傳背景清楚、表達(dá)效率高等優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。金黃色葡萄球菌是一種特別常見的人畜共患菌，目前鮮有使用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)金黃色葡萄球菌IgY單鏈抗體的報(bào)道。本研究通過(guò)選擇合適的表達(dá)載體pCold I及低溫誘導(dǎo)培養(yǎng)條件，實(shí)現(xiàn)了scFv單鏈抗體的高表達(dá)，表達(dá)的重組抗體蛋白主要以包涵體形式存在。包涵體通過(guò)離心容易收集，有利于分離純化；包涵體能夠保護(hù)蛋白免受蛋白酶的水解；目的蛋白以無(wú)活性的包涵體形式表達(dá)，不會(huì)影響宿主菌生長(zhǎng)。本研究使用4 mol/L尿素成功地將包涵體溶出，溶出的蛋白通過(guò)TALON樹脂進(jìn)一步親和純化得到了較高純度的目的蛋白。TALON樹脂以Co2+作為螯合金屬，與傳統(tǒng)的以Ni2+作為螯合金屬的樹脂相比，其結(jié)構(gòu)更規(guī)則，結(jié)合能力更強(qiáng)，故使用TALON樹脂比通常以Ni2+作為螯合金屬的樹脂純化效果更好。

溶出蛋白質(zhì)的復(fù)性也是特別關(guān)鍵的一個(gè)步驟，因此復(fù)性方法的選擇就顯得尤為重要。透析法操作簡(jiǎn)單、不增加蛋白質(zhì)的體積，通過(guò)逐漸降低外透液的濃度來(lái)控制變性劑的去除速度，使蛋白質(zhì)呈現(xiàn)生物活性［21-23］。本研究選擇透析法進(jìn)行蛋白復(fù)性，將從TALON樹脂中溶出的蛋白溶液置于SnakeSkin Pleated Dialysis Tubing 3500 MWCO透析膜內(nèi)，透析過(guò)程中未見絮狀沉淀，透析后也無(wú)沉淀產(chǎn)生，證明復(fù)性成功。復(fù)性后的目的蛋白濃度為0.16 mg/mL，純度為98%。體外抗體活性測(cè)定顯示，純化的重組蛋白在0.016 mg/mL時(shí)就表現(xiàn)出良好的金黃色葡萄球菌抗原的結(jié)合能力，說(shuō)明重組蛋白具有良好的金黃色葡萄球菌抗體活性。

本研究通過(guò)大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)以及搖瓶培養(yǎng)，獲得了純化收率為10 mg/L菌體、純度為98%的有活性的scFv單鏈抗體蛋白。其方法具有成本低、產(chǎn)率高、純度高、技術(shù)路線簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，不僅為規(guī)模化制備scFv單鏈抗體提供了寶貴的技術(shù)路線，為金黃色葡萄球菌IgY抗體蛋白進(jìn)一步的功能和應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為大腸桿菌生產(chǎn)其它重組小分子抗體提供了有價(jià)值的參考。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)質(zhì)粒構(gòu)建及大腸桿菌原核表達(dá)的方法，獲得了以包涵體形式存在的金黃色葡萄球菌抗體蛋白，此包涵體經(jīng)4 mol/L尿素成功溶出，使用透析法對(duì)蛋白進(jìn)行復(fù)性之后，經(jīng)ELISA鑒定證實(shí)所表達(dá)的蛋白具有金黃色葡萄球菌抗體活性。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Prokaryotic Expression and Purification of Single-chain Variable Fragment（scFv）Against Staphylococcus aureus

LI Jing-quan1XU Yong-ping1，2WANG Xi-tao1LI Yuan1WANG Li-li1，2LI Xiao-yu1，2
（1. School of Life Science and Biotechnology，Dalian University of Technology，Dalian 116024；2. Ministry of Education Center for Food Safety of Animal Origin，Dalian 116620）

This work aims to clone and express single-chain variable region fragment（scFv）of Staphylococcus aureus in Escherichia coli，and to obtain the target protein with scFv activity. A plasmid containing target scFv gene was constructed，then transformed into a prokaryotic expression strain to be induced，and the activity of the harvested protein was identified. As results：（1）Recombinant plasmid pCold I-scFv was successfully constructed，and transformed into the expression strain of Escherichia coli.（2）After induction，the target proteins mainly exist in pellet in the form of inclusion bodies. （3）Inclusion body was dissolved successfully using 4 mol/L urea. （4）Purified and renatured target protein by column chromatography and dialysis was favorable. （5）The refolded protein showed specific binding activity with S. aureus in ELISA experiment. Conclusively，the target protein with S. aureus antibody activity was successfully acquired by plasmid construction and prokaryotic expression，inclusion body dissolving and refolding.

soluble expression；inclusion；protein purification；protein refolding；active protein

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.022

2016-03-14

基金情況：中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)（DUT13 JB04），國(guó)家海洋公益項(xiàng)目（201405003-3）

李晶泉，女，博士研究生，研究方向：生物化工；E-mail：lijq@takara.com.cn

李曉宇，女，博士，研究方向：特異性卵黃抗體替代抗生素；E-mail：xiaoyuli@dlut.edu.cn