竇雪麗，陳曉暉，楊幸怡，劉 宏，劉 超,*

（1.廣東省汕頭市公安局，廣東 汕頭 515011；

2.廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所，廣東省法醫(yī)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510030）

3個(gè)Y-STR分型體系的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用比較

竇雪麗1，陳曉暉2，楊幸怡2，劉 宏2，劉 超2,*

（1.廣東省汕頭市公安局，廣東 汕頭 515011；

2.廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所，廣東省法醫(yī)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510030）

目的 評(píng)估GFS24Y STR、PowerPlex?Y23System及AGCU24Y STR 3個(gè)體系的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。方法 從群體多態(tài)性、分型準(zhǔn)確性、靈敏度、種屬特異性、組織同一性、性別特異性、混合樣本檢驗(yàn)等方面進(jìn)行檢測(cè)評(píng)估。結(jié)果 對(duì)137例廣東男性無關(guān)個(gè)體進(jìn)行檢測(cè)，3個(gè)Y-STR復(fù)合擴(kuò)增體系均檢出137種唯一單倍型，PowerPlex?Y23System共發(fā)現(xiàn)139個(gè)等位基因，AGCU24Y STR共發(fā)現(xiàn)145個(gè)等位基因，GFS24Y STR共發(fā)現(xiàn)154個(gè)等位基因；AGCU24Y STR、GFS24Y STR檢測(cè)體系靈敏度均為0.125 ng，PowerPlex?Y23 體系為0.0625 ng。結(jié)論 PowerPlex?Y23System、AGCU24Y STR、GFS24Y STR 3個(gè)體系在廣東人群中均有高度多態(tài)性，靈敏度、種屬特異性、組織同一性、性別特異性、混合樣本檢測(cè)等方面均可滿足法醫(yī)實(shí)際檢案要求，在父系鑒定、個(gè)體識(shí)別、群體遺傳等方面具有良好的應(yīng)用前景。

Y-STR；熒光復(fù)合擴(kuò)增；多態(tài)性；法醫(yī)遺傳學(xué)；單倍型

人類Y染色體屬正常男性特有，除擬常染區(qū)外，在遺傳過程中不發(fā)生重組。理論上除突變外，同一父系Y-STR遺傳標(biāo)記擁有相同的單倍型，在混合檢材檢驗(yàn)和父系鑒定等方面具有獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值[1]。目前，Y-fi ler和PowerPlex?Y23等商業(yè)化試劑盒已在法醫(yī)DNA檢驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用，但這些試劑盒所含的基因座基本相同，即使聯(lián)合應(yīng)用，也難以大幅提升總識(shí)別力。同時(shí)，由于地域、種族間的差異性，國(guó)外試劑盒中所包含的一些Y-STR基因座在我國(guó)群體中的遺傳多態(tài)性相對(duì)較差，個(gè)體識(shí)別力相對(duì)較低，不能滿足國(guó)內(nèi)法醫(yī)學(xué)應(yīng)用的需要[2-3]。因此，建立適合我國(guó)人群的、包含更多多態(tài)性基因座的Y-STR熒光檢測(cè)體系十分必要。

本研究將國(guó)產(chǎn)的GFS24Y STR及AGCU24Y STR檢測(cè)系統(tǒng)與美國(guó)Promega公司的PowerPlex?Y23System進(jìn)行法醫(yī)學(xué)應(yīng)用效果比較研究，為法醫(yī)學(xué)實(shí)踐、群體遺傳學(xué)研究選用適合的系統(tǒng)提供參考。

1 樣本與方法

1.1 Y-STR基因座的群體遺傳學(xué)調(diào)查

137名廣東漢族無關(guān)男性個(gè)體血樣，由廣州市刑事科學(xué)研究所日常案件中隨機(jī)抽取，使用TECAN freedom EVO-150自動(dòng)化工作站，提取基因組DNA，4 ℃保存待用。樣本DNA按照3個(gè)檢測(cè)體系提供的說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物采用ABI 3130XL遺傳分析儀電泳，使用GeneMapper V3.2進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2 靈敏度檢測(cè)

分別使用1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 ng的男性DNA標(biāo)準(zhǔn)品9948作為模板，在同一臺(tái)ABI 9700擴(kuò)增儀上，按照各試劑盒建議的擴(kuò)增條件，分別進(jìn)行GFS24Y STR、AGCU24Y STR、PowerPlex?Y23System 3個(gè)復(fù)合擴(kuò)增體系的檢測(cè)。

1.3 種屬特異性檢測(cè)

使用兔、魚、雞、牛、羊、鴨、驢、狗、鼠、豬、猴、鴿子的基因組DNA樣本分別進(jìn)行GFS24Y STR、AGCU24Y STR、PowerPlex?Y23System 3個(gè)復(fù)合擴(kuò)增體系的檢測(cè)。

1.4 混合成分檢測(cè)

1.4.1 男女混合，男性成分保持不變

PCR反應(yīng)體積為25 μL。Control DNA 2800M男性標(biāo)準(zhǔn)品，其成分保持在0.5 ng不變，高濃度女性DNA濃度為221 μg/mL。2800M與高濃度女性DNA分 別 以1:1000、1:2000、1:4000、1:6000混 合， 用GFS24Y STR、AGCU24Y STR、PowerPlex?Y23System 3個(gè)體系進(jìn)行平行檢測(cè)。

1.4.2 女男混合，女性成分保持不變

PCR反應(yīng)體積為25 μL。Control DNA 2800M與高濃度女性DNA（高濃度DNA保持400ng不變）混合，Control DNA 2800M的濃度依次為0.5、0.25、0.125、 0.0625、0.03125 ng進(jìn)行混合的樣本，樣本分別用GFS24Y STR、AGCU24Y STR、PowerPlex?Y23System 3個(gè)體系進(jìn)行平行檢測(cè)。

1.4.3 男男混合

Control DNA2800M男性標(biāo)準(zhǔn)品為樣本1，Control DNA9948男性標(biāo)準(zhǔn)品為樣本2，DNA模板量為1ng不變，樣本1和樣本2分別以1:1、1:3、1:9和1:19的比例混合，用GFS24Y STR、AGCU24Y STR、PowerPlex?Y23 System 3個(gè)體系進(jìn)行平行檢測(cè)。

1.5 男性特異性檢測(cè)

對(duì)廣州市刑事科學(xué)研究所日常案件中隨機(jī)抽取的5例男性與5例女性樣本模板進(jìn)行GFS24Y STR、AGCU24Y STR、PowerPlex?Y23 System 3個(gè)復(fù)合檢測(cè)體系擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3130XL基因分析儀檢測(cè)。

1.6 組織同一性檢測(cè)

取同一男性尸體的肌肉組織、骨組織、肋軟骨、指甲、皮膚、肝臟、血痕等樣本（由廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所提供）的基因組DNA各1 ng，分別使用GFS24Y STR、AGCU24Y STR、PowerPlex?Y23System進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

等位基因頻率和單倍型用計(jì)數(shù)法直接計(jì)算并統(tǒng)計(jì)，Pi為等位基因頻率，即第i個(gè)等位基因的頻率Pi=第i個(gè)等位基因頻數(shù)/ n(n為實(shí)驗(yàn)檢測(cè)樣本數(shù))?；蚨鄻有?gene diversity，GD)按公式GD=n(1-∑Pi2)/(n-1)計(jì)算，n為實(shí)驗(yàn)檢測(cè)樣本數(shù)[4]。

2 結(jié)果

2.1 一致性檢測(cè)結(jié)果

3個(gè)體系檢測(cè)137名廣東漢族無關(guān)男性個(gè)體的Y-STR，PowerPlex?Y23 System和GFS24Y STR兩個(gè)體系共有5個(gè)基因座相同：DYS385 a/b、DYS635、DYS481 和DYS570；AGCU24Y STR和GFS24Y STR兩個(gè)體系共有8個(gè)基因座相同：DYS449、DYS635、DYS527a/b、DYS522、DYS385a/b和DYS444；PowerPlex?Y23 System和AGCU24Y STR兩個(gè)體系共有17個(gè)基因座相同：DYS19、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS385 a/ b、DYS438、DYS439、DYS437、DYS448、DYS456、DYS635、Y-GATA-H4和DYS458。3個(gè)體系中所有相同基因座分型結(jié)果完全相同。

2.2 靈敏度檢測(cè)結(jié)果

GFS24Y STR、AGCU24Y STR復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)在模板量0.125 ng～1 ng之間時(shí)，可以獲得24個(gè)Y-STR基因座完整的分型結(jié)果，擴(kuò)增均衡性、峰高符合要求，靈敏度為0.125 ng，當(dāng)模板量為0.0625 ng時(shí)出現(xiàn)基因座漏擴(kuò)現(xiàn)象。PowerPlex?Y23 System復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)在模板量0.0625 ng～1ng的情況下可以獲得24個(gè)Y-STR基因座完整的分型結(jié)果，靈敏度為0.0625 ng，當(dāng)模板量為0.03125 ng時(shí)出現(xiàn)基因座漏擴(kuò)現(xiàn)象。

2.3 種屬特異性檢測(cè)結(jié)果

分別使用GFS24Y STR、AGCU24Y STR、Power-Plex?Y23 System 3個(gè)復(fù)合擴(kuò)增體系對(duì)兔、魚、雞、牛、羊、鴨、驢、狗、鼠、豬、猴、鴿子的DNA樣本進(jìn)行檢測(cè)，均未檢測(cè)出擴(kuò)增片段。

2.4 混合樣本檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 男女混合，男性成分保持不變

Control DNA2800M男性標(biāo)準(zhǔn)品和高濃度女性DNA混合比例大于1:1000時(shí)，GFS24Y STR、AGCU24Y STR體系的Y-STR分型均受到女性成分的干擾，而PowerPlex?Y23體系不受女性成分的干擾。

2.4.2 女男混合，女性成分保持不變

在女性成分保持不變（400 ng）的情況下，減少Control DNA2800M男性標(biāo)準(zhǔn)品的量，結(jié)果顯示：Control DNA2800M男性標(biāo)準(zhǔn)品的量小于0.5 ng時(shí)，GFS24Y STR、AGCU24Y STR出現(xiàn)基因丟失，而PowerPlex?Y23 System不受影響（見圖1～3）。

2.4.3 男男混合

對(duì)Control DNA2800M男性標(biāo)準(zhǔn)品和Control DNA9948男性標(biāo)準(zhǔn)品混合比例分別為1:1、1:3、1:9、1:19的樣本分別用GFS24Y STR、AGCU24Y STR、PowerPlex?Y23 System 3個(gè) 體系進(jìn)行平行檢測(cè)，結(jié)果顯示：Control DNA2800M男性標(biāo)準(zhǔn)品和Control DNA9948男性標(biāo)準(zhǔn)品混合比例高于1:9時(shí)，GFS24Y STR、AGCU24Y STR、PowerPlex?Y23 System 3個(gè)體系均出現(xiàn)含量較少的男性個(gè)體基因座基因丟失的現(xiàn)象（見圖4～6）。

2.5 男性特異性檢測(cè)

對(duì)5例男性與5例女性樣本模板進(jìn)行GFS24Y STR、AGCU24Y STR、PowerPlex?Y23 System 3個(gè)復(fù)合檢測(cè)體系擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3130XL基因分析儀檢測(cè)，女性樣本未檢測(cè)到產(chǎn)物峰。同樣方法檢測(cè)的5例男性樣本，電泳結(jié)果顯示各Y-STR基因座均獲得檢測(cè)峰。表明系統(tǒng)檢測(cè)的Y-STR位點(diǎn)在X染色體上沒有同源序列，為男性特異的遺傳標(biāo)記。

2.6 組織同一性的比較

對(duì)來源于同一個(gè)男性尸體上的肌肉、皮膚、肝臟、指甲、軟骨、血痕等進(jìn)行3個(gè)系統(tǒng)檢測(cè)，分型均一致。說明同一個(gè)體系統(tǒng)所檢測(cè)的Y-STR具有組織同一性。

2.7 遺傳多態(tài)性檢測(cè)

圖1 AGCU24Y電泳圖譜Fig.1 The electrophoretogram of AGCU 24Y

圖2 GFS24Y STR電泳圖譜Fig.2 The electrophoretogram of GFS 24Y

圖3 PowerPlex?Y23電泳圖譜Fig.3 The electrophoretogram of PowerPlex?Y23

應(yīng) 用 GFS24Y STR、AGCU24Y STR、Power-Plex?Y23 System 3個(gè)體系對(duì)137例廣東男性無關(guān)個(gè)體進(jìn)行檢測(cè)，3個(gè)Y-STR復(fù)合擴(kuò)增體系單獨(dú)均檢出不同單倍型，每個(gè)體系的單倍型各有137種。由PowerPlex?Y23 System擴(kuò)增體系的23個(gè)Y-STR基因座在廣東漢族群體共檢出139個(gè)等位基因，GD值為0.4428～0.9623，其中GD值小于0.7的基因座有8個(gè)，分別為DYS448、DYS549、DYS389I、DYS392、DYS533、DYS456、DYS393、Y-GATA-H4， 占34.7 %，GD值小于0.4的基因座有3個(gè)（DYS391、DYS437、DYS438）；AGCU24Y 擴(kuò)增體系的24個(gè)Y-STR基因座在廣東漢族群體中共檢出145個(gè)等位基因，GD值為0.428～0.9623，其中GD值小于0.7的基因座有8個(gè)，分 別 為DYS448、DYS444、DYS522、DYS392、DYS389I、DYS456、DYS393、Y-GATA-H4，占33.3 %，GD值小于0.4的基因座有4個(gè)（DYS391、DYS437、DYS438、DYS388）；GFS24Y擴(kuò) 增 體系的24個(gè)Y-STR基因座在廣東漢族群體中共檢出154個(gè)等位基因，GD值為0.3137～0.9623，其中GD值小于0.7的基因座有7個(gè)，分別為DY557、DYS444、DY552、DYS522、DY520、DY443、DYS460， 占 29.1%，GD值小于0.4的基因座有2個(gè)（DYS531、DYS459）（見表1）。

3 討論

Y染色體STR具有單倍型遺傳、父系遺傳及男性特有等特征，可在法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別、混合斑男性成分檢測(cè)、父權(quán)鑒定、親緣搜索、家系排查等中應(yīng)用[1-3]。隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)不同人群進(jìn)行的遺傳學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)Y-STR的多態(tài)性分布在種族、民族、地域和家族等方面有明顯的差異。其在研究人類的起源進(jìn)化、遷移發(fā)展和群體分布等方面以獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)發(fā)揮著重要作用[5-6]。

目前，雖然有包括Y-fi ler和PowerPlex?Y23等商業(yè)化試劑盒可供選擇，但在法醫(yī)實(shí)踐中，由于有些Y-STR在我國(guó)人群中個(gè)體識(shí)別力較低，加之Y-STR突變率較高，在利用Y-STR基因座進(jìn)行父權(quán)鑒定時(shí)，3個(gè)以上的基因座不同才能排除父權(quán)關(guān)系[7]。遇到父系關(guān)系比較近的男性、微量男男混合檢材個(gè)體識(shí)別等案件時(shí)，需要增加檢測(cè)Y-STR基因座的數(shù)目，或同時(shí)檢測(cè)多個(gè)Y-STR熒光復(fù)合擴(kuò)增體系，使結(jié)論更加可靠。

本研究通過對(duì)GFS24Y STR、AGCU24Y STR、PowerPlex?Y23 System等3個(gè)擴(kuò)增體系比較，發(fā)現(xiàn)3個(gè)體系的靈敏度、種屬特異性、組織同一性、性別特異性、混合樣本檢測(cè)等方面均可滿足法醫(yī)實(shí)際檢案要求。但PowerPlex?Y23 System的靈敏度及抗女性成分干擾能力優(yōu)于GFS24Y STR、AGCU24Y STR，建議在對(duì)現(xiàn)場(chǎng)檢材尤其是微量污染檢材檢驗(yàn)時(shí)優(yōu)先選擇PowerPlex?Y23系統(tǒng)。

圖4 GFS24Y STR 檢測(cè)混合比為1:9的電泳圖譜Fig.4 Electrophoretogram by GFS24Y system to detect the mixed sample of a ratio of 1(male1):9 (male2)

圖5 AGCU24Y STR檢測(cè)混合比為1:9的電泳圖譜Fig.5 Electrophoretogram by AGCU24Y system to detect the mixed sample of a ratio of 1 (male1):9 (male2)

圖6 PowerPlex?Y23檢測(cè)混合比為1:9的電泳圖譜Fig.6 Electrophoretogram by PowerPlex?Y23 system to detect the mixed sample of a ratio of 1 (male1):9 (male2)

對(duì)137例廣東男性無關(guān)個(gè)體進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)3個(gè)Y-STR復(fù)合擴(kuò)增體系均檢出不同單倍型，即每個(gè)體系的單倍型各有137種。但GFS24Y STR、AGCU24Y STR檢出的等位基因數(shù)高于PowerPlex?Y23，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[2-3]。為提高應(yīng)用效能，需要同時(shí)檢測(cè)多個(gè)Y-STR熒光復(fù)合擴(kuò)增體系時(shí)，聯(lián)合應(yīng)用GFS24Y STR與AGCU24Y STR擴(kuò)增體系或聯(lián)合應(yīng)用GFS24Y與PowerPlex?Y23擴(kuò)增體系。實(shí)際應(yīng)用時(shí)，可根據(jù)檢材和案件需求等具體情況選擇合適的Y-STR檢測(cè)系統(tǒng)。

表1 3個(gè)檢測(cè)體系43個(gè)Y-STR基因座GD及等位基因個(gè)數(shù)（n=137）Table 1 GD value of 43 Y-STR loci and the number of alleles in 137 Guangdong unrelated male individuals detected by three Y-STR typing systems

［1］ Kayser M, Kittler R, Erler A, et al. A comprehensive survey of human Y-chromosomal microsatellites［J］. Am J Hum Genet, 2004,74(6):1183-1197.

［2］ Ou X, WangY, Liu C, et al. Haplotype analysis of the polymorphic 40 Y-STR markers in Chinese populations［J］. Forensic SciInt Genet, 2015, 19:255-262.

［3］ Liu C, Liu H, Li Y, et al. Development of a 24-plex Y chromosomal STR loci typing system［J］. Forensic Science International: Genetics Supplement Series, 2013, 4(1): e67-e68

［4］ Nei M. Analysis of gene diversity in subdivided populations［J］. Proc Natl Acad Sci USA,1973,70(12):3321-3323.

［5］ Jobling MA, Tyler-Smith C. Fathers and sons: the Y chromosome and human evolution［J］. Trends Genet,1995,11(11):449-456.

［6］ 何燕，文波，單可人，等. 貴州三都水族Y染色體單倍型頻率分析［J］. 遺傳，2003,25(3):249-252.

［7］ Weng W, Liu H, Li S, et al. Mutation rates at 16 Y-chromosome STRs in the South China Han population［J］. Int J Legal Med, 2012, 127(2): 369-372.

Forensic Comparison of Three Y – STR Typing Systems

DOU Xueli1, CHEN Xiaohui2, YANG Xingyi2, LIU Hong2, LIU Chao2
（1. Shantou Public Security Bureau, Guangdong, Shantou 515000, China;
2. Guangzhou Institute of Criminal Science and Technology, Guangzhou 510030,China)

Objective To assess the forensic value of three systems of GFS24Y STR, PowerPlex?Y23 and AGCU24Y STR. Methods The evaluation was targeted at group polymorphism, classifi cation accuracy, sensitivity, species specifi city, organization identity, gender specifi city and detectivity for mixed samples. Results Of the 137 Guangdong unrelated male individuals, 139, 145 and 154 alleles were respectively detected by PowerPlex?Y23, AGCU24Y STR and GFS24Y STR although all the three Y - STR composite amplifi cation systems were detected 137 kinds of sole haploid type. The sensitivities of the three Y-STR systems are 0.0625 ng for PowerPlex?Y23, both 0.125 ng for GFS 24Y and AGCU24Y. Conclusion The three systems of PowerPlex?Y23, AGCU24Y STR and GFS24Y STR, all of high sensitivity and strong specifi city, reveal the high polymorphism in the Guangdong population. The combination of the PowerPlex?Y23, AGCU24Y STR and GFS24Y STR should have good prospect for application in fatherhood identifi cation as well as population genetic analysis.

Y-STR; fl uorescent composite amplifi cation; polymorphism; forensic genetics; haplotype

DF795.2

B

1008-3650(2016)05-0405-05

2016-01-16

格式：竇雪麗，陳曉暉，楊幸怡，等. 3個(gè)Y-STR分型體系的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用比較[J]. 刑事技術(shù)，2016, 41(5):405-409.

10.16467/j.1008-3650.2016.05.015

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B021500010）；公安部應(yīng)用創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（2011YYCXGDST076）

竇雪麗(1980—），女，山西河曲人，碩士，主檢法醫(yī)師，研究方向?yàn)榉ㄡt(yī)物證學(xué)。E-mail:108703466@qq.com

* 通訊作者：劉超（1963—），男，湖北十堰人，博士，主任法醫(yī)師，研究方向?yàn)榉ㄡt(yī)學(xué)檢案及研究。E-mail: liuchaogzf@163.com