邵欣宇 顧 燊 丁希偉 鄒曉平

南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院消化科(210008)

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Hedgehog信號通路與胰腺癌吉西他濱固有耐藥的相關性研究

邵欣宇*顧 燊 丁希偉 鄒曉平#

南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院消化科(210008)

背景：吉西他濱是胰腺癌的一線化療藥物，但化療耐藥問題普遍存在并成為胰腺癌化療失敗的主要原因。Hedgehog(Hh)信號通路是胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的核心信號通路之一，其異?；罨c多藥耐藥相關蛋白表達、腫瘤干細胞的維持和自我更新等明確相關。目的：探討Hh信號通路相關因子表達與胰腺癌吉西他濱固有耐藥的相關性。方法：培養(yǎng)人胰腺癌細胞株CFPAC-1和PANC-1，予吉西他濱、Hh信號通路抑制劑GANT61或激動劑purmorphamine處理，或吉西他濱分別與GANT61或purmorphamine聯(lián)合處理，以real-timePCR和蛋白質印跡法檢測Hh信號通路相關因子Shh、Ptch、Smo、Gli1表達，CCK-8實驗檢測不同處理對細胞增殖活性的影響。結果：與CFPAC-1細胞相比，PANC-1細胞中的Hh信號通路相關因子表達顯著增高(P<0.05)，對吉西他濱的敏感性相對較低。GANT61可下調PANC-1細胞中的Gli1表達，并增強細胞對吉西他濱的敏感性，而purmorphamine則可上調CFPAC-1細胞中的Gli1表達，并降低細胞對吉西他濱的敏感性，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論：Hh信號通路相關因子表達與胰腺癌吉西他濱固有耐藥相關，抑制Hh信號通路異?；罨稍黾右认侔┘毎麑魉麨I的敏感性。

胰腺腫瘤； 吉西他濱；Hedgehog信號通路；Hedgehog蛋白質類； 抗藥性，腫瘤

胰腺癌是惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，2015年發(fā)表的腫瘤統(tǒng)計報告顯示胰腺癌在美國腫瘤相關死因中居第四位[1]；2004—2009年間，上海市胰腺癌發(fā)病率為6.7/10萬，5年總生存率約4.1%，中位生存期僅為3.9個月[2]。80%以上的胰腺癌患者確診時已處于腫瘤晚期，無法進行外科干預[3]，因此，胰腺癌的綜合治療顯得尤為重要。吉西他濱(gemcitabine, 2’,2’-difluoro-2’-deoxycytidine)是胰腺癌的一線化療藥物[4-5]，但化療耐藥問題普遍存在并成為胰腺癌化療失敗的主要原因?；熌退幙煞譃楣逃心退幒瞳@得性耐藥，前者為細胞在接受化療前即存在的固有的對藥物不敏感，后者指在化療過程中，原本敏感的細胞通過基因突變以及其他適應性改變而變得耐藥。Hedgehog(Hh)信號通路是胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的核心信號通路之一，該信號通路相關蛋白在正常胰腺組織中不表達，但在胰腺癌及其癌前病變中存在異常表達[6]。本研究選擇兩株對吉西他濱敏感性不同的人胰腺癌細胞株CFPAC-1和PANC-1，通過檢測Hh信號通路相關因子Shh、Ptch、Smo、Gli1在兩者中的表達情況，以及Hh信號通路抑制劑或激動劑對細胞吉西他濱敏感性的影響，探討Hh信號通路相關因子表達與胰腺癌吉西他濱固有耐藥的相關性。

材料與方法

一、細胞株和主要試劑

人胰腺癌細胞株CFPAC-1、PANC-1購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，送GENEWIZ公司以短串聯(lián)重復序列(short tandem repeat)圖譜分析方法進行鑒定，結果與細胞庫和文獻報道相符。兩株細胞均按貼壁方法培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。細胞生長至接近融合狀態(tài)時，以含EDTA 的0.25% 胰酶消化傳代，2～3 d一次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

吉西他濱購自中國食品藥品檢定研究院，溶于雙蒸水中配制成2.5 mmol/L的母液備用； GANT61、purmorphamine購自Sigma-Aldrich Co. LLC.，溶于DMSO中配制成10 mmol/L的母液備用。

TRIzol?RNA分離試劑(Thermo Fisher Scientific Inc.)，PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(TAKARA BIO INC.)，real-time PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。Shh: F 5’-GCT CGG TGA AAG CAG AGA AC-3’, R 5’-CCA GGA AAG TGA GGA AGT CG-3’; Ptch: F 5’-GGA GCA GAT TTC CAA GGG GA-3’, R 5’-CCA CAA CCA AGA ACT TGC CG-3’; Smo: F 5’-GCT ACA ACG TGT GCC TGG G-3’, R 5’-CAT TCC GGA GGC CCG AC-3’; Gli1: F 5’-CCC AGA CAG AGG CCC ACT C-3’, R 5’-AGA TGT GCA TCG CGA GTT GA-3’; β-actin: F 5’-CCT GGC ACC CAG CAC AAT-3’, R 5’-AGT ACT CCG TGT GGA TCG GC-3’。Shh兔多克隆抗體、Ptch羊多克隆抗體、Gli1兔多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology)，Smo兔多克隆抗體(Abcam plc.)。CCK-8細胞增殖/細胞毒性檢測試劑盒[東仁化學科技(上海)有限公司]。

二、方法

1. Real-time PCR：取對數(shù)生長期CFPAC-1、PANC-1細胞，按實驗要求進行不同處理。48 h或72 h后收集細胞，預冷PBS洗滌2次，TRIzol?試劑提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，行real-time PCR，操作步驟參照試劑盒說明書。2-△△Ct法計算目的基因mRNA相對表達量。每組設3個復孔，每次實驗至少重復3次。

2. 蛋白質印跡法：取對數(shù)生長期CFPAC-1、PANC-1細胞，按實驗要求進行不同處理。48 h或72 h后收集細胞，預冷PBS洗滌2次，加入蛋白裂解液冰上裂解，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，取上清，BCA法蛋白定量。取30 μg總蛋白上樣，SDS-PAGE電泳分離1～2 h，蛋白轉移至PVDF膜，5%牛奶封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，加入二抗孵育2 h，TBST洗滌，ECL法自動曝光成像。實驗重復3次。

3. CCK-8實驗：取對數(shù)生長期CFPAC-1、PANC-1細胞接種于96孔板，24 h后按實驗要求進行不同處理，CFPAC-1細胞培養(yǎng)48 h，PANC-1細胞培養(yǎng) 72 h，吸去培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8與90 μL完全培養(yǎng)基混合物，2 h后酶標儀測定450 nm波長處吸光度值(A值)。細胞活力=(A待測組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、Hh信號通路相關因子在CFPAC-1、PANC-1細胞中呈差異性表達

既往文獻報道Hh信號通路相關因子在胰腺癌組織中表達異常[6]。本實驗分別在基因和蛋白水平檢測了該通路中的主要因子Shh、Ptch、Smo、Gli1在人胰腺癌細胞株CFPAC-1、PANC-1中的表達情況，結果顯示兩株細胞中的Hh信號通路均異?；罨?，相關因子尤其是轉錄因子Gli1在PANC-1細胞中的表達顯著高于CFPAC-1細胞(P<0.05)(圖1)。

二、PANC-1細胞對吉西他濱相對不敏感

經(jīng)不同濃度吉西他濱處理后(CFPAC-1細胞48h，PANC-1細胞72h)，低倍鏡下可見貼壁細胞減少，漂浮細胞增多，高倍鏡下可見貼壁細胞形態(tài)改變，伸出較多突起，細胞內可見空泡。CCK-8實驗顯示，吉西他濱濃度越高，細胞增殖抑制作用越明顯，CFPAC-1細胞50%抑制濃度(IC50)為101nmol/L，PANC-1細胞IC50為5.346mmol/L，CFPAC-1細胞對吉西他濱的敏感性明顯高于PANC-1細胞(圖2)。Hh信號通路相關因子表達較高的PANC-1細胞對吉西他濱相對不敏感，提示Hh信號通路異?；罨赡芘c胰腺癌細胞的固有耐藥相關。

三、抑制Gli1可增加PANC-1細胞對吉西他濱的敏感性

GANT61為Hh信號通路抑制劑，主要作用為干擾轉錄因子Gli1與DNA結合，從而抑制其靶基因轉錄[7]。由于Gli1能調控自身轉錄，因此GANT61有抑制Gli1合成的功能。以GANT61處理Gli1表達較高的PANC-1細胞72h，real-timePCR和蛋白質印跡法檢測顯示GANT61可從基因和蛋白水平下調Gli1表達(P<0.05)(圖3)。CCK-8實驗顯示，GANT61處理72h可抑制PANC-1細胞的增殖活性(圖4A)，選用對增殖活性影響較小的5μmol/LGANT61聯(lián)合吉西他濱處理PANC-1細胞72h，增殖抑制作用較吉西他濱單藥處理增強，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖4B)，且此差異大于5μmol/LGANT61單獨作用的效果，表明抑制Gli1可增強PANC-1細胞對吉西他濱的敏感性。

四、激活Smo可上調CFPAC-1細胞的Gli1表達并降低細胞對吉西他濱的敏感性

Purmorphamine能選擇性結合并激活Smo，從而激活Hh信號通路[8]。以purmorphamine處理Gli1表達較低的CFPAC-1細胞48h，real-timePCR和蛋白質印跡法檢測顯示purmorphamine可從基因和蛋白水平上調Gli1表達(P<0.05)(圖5)。CCK-8實驗顯示，purmorphamine處理48h可增強CFPAC-1細胞的增殖活性(圖6A)，選用對增殖活性影響較小的5μmol/Lpurmorphamine聯(lián)合吉西他濱處理CFPAC-1細胞48h，發(fā)現(xiàn)purmorphamine可減弱吉西他濱單藥處理的增殖抑制作用，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖6B)，且此差異大于5μmol/Lpurmorphamine單獨作用的效果，表明激活Smo可降低CFPAC-1細胞對吉西他濱的敏感性。

A：real-time PCR；B：蛋白質印跡法

圖2 吉西他濱抑制CFPAC-1、PANC-1細胞的增殖活性(CCK-8實驗)

討 論

Hh信號通路在哺乳動物的胚胎發(fā)育過程中起重要作用，出生后，該通路在正常情況下幾乎無活性，其異常活化與多種惡性腫瘤的發(fā)生、生長、侵襲、 轉移等惡性生物學行為有關。在哺乳動物中，Hh信號通路主要有3個配體蛋白：SonicHedgehog(Shh)、DesertHedgehog(Dhh)和IndianHedgehog(Ihh)。其激活途徑為：由自分泌或旁分泌途徑產(chǎn)生的hh(包括Shh、Dhh、Ihh)作用于腫瘤抑制因子Patched(Ptch，一種十二次跨膜受體)，兩者結合后，釋放原先被Ptch抑制的七次跨膜受體Smoothened(Smo)，Smo移動至初級纖毛，使腫瘤抑制因子sufu(suppressoroffused)與轉錄因子Gli(包括Gli1、Gli2和Gli3)解聚，Gli進入細胞核，調節(jié)靶基因轉錄，其靶基因包括Gli1、Ptch以及多種促進細胞增殖、存活的分子如Myc、Bcl-2、cyclin等。其他如Ptch基因突變、sufu蛋白缺失、Gli過表達等亦可激活Hh信號通路。一項針對胰腺癌患者的全基因組分析顯示，幾乎所有患者均存在Hh信號通路基因突變[9]。在正常胰腺組織、胰腺上皮內瘤變至胰腺癌的進展過程中，Hh信號通路相關蛋白的表達水平逐漸增高[6,10]，癌組織中相關蛋白Shh、Gli1表達水平越高，患者預后越差[11]。因此，針對Hh信號通路的研究在胰腺癌研究領域中居重要地位。

A：real-time PCR；B：蛋白質印跡法

與同濃度吉西他濱單藥處理比較，**P<0.01，***P<0.001

A：real-time PCR；B：蛋白質印跡法

與同濃度吉西他濱單藥處理比較，*P<0.05，**P<0.01

吉西他濱是胰腺癌的一線化療藥物之一[4-5]，但耐藥現(xiàn)象限制了該藥的臨床應用。探索胰腺癌對吉西他濱耐藥的機制可為胰腺癌的有效治療、精準治療提供理論依據(jù)。胰腺癌治療困難的原因之一為癌組織中血管相對較少，使藥物難以被轉運、吸收。近年眾多研究證實Hh信號通路可影響胰腺癌間質的形成和分化，抑制該信號通路可減少腫瘤相關間質組織，增加癌組織中的血管密度，從而增加藥物灌注[12-13]。腫瘤干細胞的存在亦為影響胰腺癌吉西他濱化療效果的重要因素[14-15]。研究表明Hh信號通路在腫瘤干細胞的維持和自我更新方面起重要作用[16-17]。此外，Hh信號通路還與多藥耐藥相關蛋白ABCG2(BCRP)、ABCB1(MDR1)等明確相關[18-20]，可介導腫瘤細胞的多藥耐藥。上述發(fā)現(xiàn)為提出Hh信號通路與胰腺癌對吉西他濱的耐藥程度存在相關性的假設奠定了理論基礎。

本研究檢測了Hh信號通路相關因子在兩株人胰腺癌細胞株CFPAC-1、PANC-1中的表達情況，發(fā)現(xiàn)PANC-1細胞中Shh、Ptch、Smo、Gli1在基因和蛋白水平的表達均顯著高于CFPAC-1細胞，尤其是Gli1，CCK-8實驗則顯示吉西他濱對PANC-1細胞的IC50遠高于CFPAC-1細胞，提示Hh信號通路異?；罨赡芙档鸵认侔┘毎麑魉麨I的敏感性。為進一步證實此推測，本研究分別將Hh信號通路抑制劑和激動劑與吉西他濱聯(lián)合應用，檢測兩者對胰腺癌細胞吉西他濱敏感性的影響。結果顯示，在Gli1表達較高的PANC-1細胞中，Gli1抑制劑GANT61處理可使細胞對吉西他濱的敏感性顯著增強；而在Gli1表達較低的CFPAC-1細胞中，Smo激動劑purmorphamine處理可上調Gli1表達并顯著降低細胞對吉西他濱的敏感性。上述結果證實了之前的推測：Hh信號通路異?；罨c胰腺癌吉西他濱固有耐藥相關。這一結論為胰腺癌患者的精準治療提供了可能的靶點，但仍需開展相關臨床研究。

盡管針對Hh信號通路的特異性小分子抑制劑GDC-0449(vismodegib)在臨床試驗中顯示出較好的抗腫瘤活性[21-22]，但在胰腺癌的治療中卻未顯示出能增強吉西他濱的治療效果[23]?？赡茉蛑皇荊DC-0449為Smo抑制劑，而Smo為Gli1的上游分子，Hh信號通路受多個旁系通路影響，下游Gli1表達水平是多種方式綜合調控的結果，尚存在一些其他信號通路如PI3K/AKT、RAS/RAF/MEK/ERK軸、Wnt等，可通過非Smo依賴性途徑調節(jié)Gli1表達[24-25]。由此推測在Gli1水平抑制Hh信號通路產(chǎn)生的抗腫瘤效應應優(yōu)于Smo抑制劑。因此本研究選擇Gli1特異性阻斷劑GANT61作為Hh信號通路抑制劑，發(fā)現(xiàn)經(jīng)GANT61處理后，原先對吉西他濱相對不敏感的PANC-1細胞敏感性顯著增強。

綜上所述，Hh信號通路相關因子表達與胰腺癌吉西他濱固有耐藥相關，抑制Hh信號通路異?；罨稍黾右认侔┘毎麑魉麨I的敏感性。這一發(fā)現(xiàn)或許能為未來解決胰腺癌吉西他濱耐藥問題提供一個新的思路。

1SiegelRL,MillerKD,JemalA.Cancerstatistics, 2015[J].CACancerJClin, 2015, 65 (1): 5-29.

2LuoJ,XiaoL,WuC,etal.Theincidenceandsurvivalrateofpopulation-basedpancreaticcancerpatients:ShanghaiCancerRegistry2004-2009[J].PLoSOne, 2013, 8 (10):e76052.

3VincentA,HermanJ,SchulickR,etal.Pancreaticcancer[J].Lancet, 2011, 378 (9791): 607-620.

4TemperoMA,ArnolettiJP,BehrmanSW,etal;NationalComprehensiveCancerNetworks.PancreaticAdenocarcin-oma,version2.2012:featuredupdatestotheNCCNGuidelines[J].JNatlComprCancNetw, 2012, 10 (6): 703-713.

5deSousaCavalcanteL,MonteiroG.Gemcitabine:metabolismandmolecularmechanismsofaction,sensitivityandchemoresistanceinpancreaticcancer[J].EurJPharmacol, 2014, 741: 8-16.

6ThayerSP,diMaglianoMP,HeiserPW,etal.Hedgehogisanearlyandlatemediatorofpancreaticcancertumorigenesis[J].Nature, 2003, 425 (6960): 851-856.

7LauthM,Bergstr?mA,ShimokawaT,etal.InhibitionofGLI-mediatedtranscriptionandtumorcellgrowthbysmall-moleculeantagonists[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2007, 104 (20): 8455-8460.

8SinhaS,ChenJK.PurmorphamineactivatestheHedgehogpathwaybytargetingSmoothened[J].NatChemBiol, 2006, 2 (1): 29-30.

9JonesS,ZhangX,ParsonsDW,etal.Coresignalingpathwaysinhumanpancreaticcancersrevealedbyglobalgenomicanalyses[J].Science, 2008, 321 (5897): 1801-1806.

10BardeesyN,DePinhoRA.Pancreaticcancerbiologyandgenetics[J].NatRevCancer, 2002, 2 (12): 897-909.

11MaréchalR,BachetJB,CalommeA,etal.SonichedgehogandGli1expressionpredictoutcomeinresectedpancreaticadenocarcinoma[J].ClinCancerRes, 2015, 21 (5): 1215-1224.

12NeesseA,MichlP,FreseKK,etal.Stromalbiologyandtherapyinpancreaticcancer[J].Gut, 2011, 60 (6): 861-868.

13OliveKP,JacobetzMA,DavidsonCJ,etal.InhibitionofHedgehogsignalingenhancesdeliveryofchemotherapyinamousemodelofpancreaticcancer[J].Science, 2009, 324 (5933): 1457-1461.

14HongSP,WenJ,BangS,etal.CD44-positivecellsareresponsibleforgemcitabineresistanceinpancreaticcancercells[J].IntJCancer, 2009, 125 (10): 2323-2331.

15ShahAN,SummyJM,ZhangJ,etal.Developmentandcharacterizationofgemcitabine-resistantpancreatictumorcells[J].AnnSurgOncol, 2007, 14 (12): 3629-3637.

16ClementV,SanchezP,deTriboletN,etal.HEDGEHOG-GLI1signalingregulateshumangliomagrowth,cancerstemcellself-renewal,andtumorigenicity[J].CurrBiol, 2007, 17 (2): 165-172.

17LiuS,DontuG,MantleID,etal.HedgehogsignalingandBmi-1regulateself-renewalofnormalandmalignanthumanmammarystemcells[J].CancerRes, 2006, 66 (12): 6063-6071.

18SinghRR,KunkallaK,QuC,etal.ABCG2isadirecttranscriptionaltargetofhedgehogsignalingandinvolvedinstroma-induceddrugtoleranceindiffuselargeB-celllymphoma[J].Oncogene, 2011, 30 (49): 4874-4886.

19ChenY,BieberMM,TengNN.HedgehogsignalingregulatesdrugsensitivitybytargetingABCtransportersABCB1andABCG2inepithelialovariancancer[J].MolCarcinog, 2014, 53 (8): 625-634.

20Sims-MourtadaJ,IzzoJG,AjaniJ,etal.SonicHedgehogpromotesmultipledrugresistancebyregulationofdrugtransport[J].Oncogene, 2007, 26 (38): 5674-5679.

21LoRussoPM,RudinCM,ReddyJC,etal.PhaseⅠtrialofhedgehogpathwayinhibitorvismodegib(GDC-0449)inpatientswithrefractory,locallyadvancedormetastaticsolidtumors[J].ClinCancerRes, 2011, 17 (8): 2502-2511.

22SekulicA,MigdenMR,OroAE,etal.Efficacyandsafetyofvismodegibinadvancedbasal-cellcarcinoma[J].NEnglJMed, 2012, 366 (23): 2171-2179.

23KimEJ,SahaiV,AbelEV,etal.PilotclinicaltrialofhedgehogpathwayinhibitorGDC-0449 (vismodegib)incombinationwithgemcitabineinpatientswithmetastaticpancreaticadenocarcinoma[J].ClinCancerRes, 2014, 20 (23): 5937-5945.

24InghamPW,NakanoY,SegerC.MechanismsandfunctionsofHedgehogsignallingacrossthemetazoan[J].NatRevGenet, 2011, 12 (6): 393-406.

25AbergerF,KernD,GreilR,etal.CanonicalandnoncanonicalHedgehog/GLIsignalinginhematologicalmalignancies[J].VitamHorm, 2012, 88: 25-54.

(2016-03-29收稿；2016-04-25修回)

Hedgehog Signaling Pathway Mediates Gemcitabine Intrinsic Chemoresistance in Pancreatic Cancer

SHAOXinyu,GUShen,DINGXiwei,ZOUXiaoping.

DepartmentofGastroenterology,theAffiliatedDrumTowerHospitalofNanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing(210008)

Correspondence to: ZOU Xiaoping, Email: 13770771661@163.com

Background: Gemcitabine is the standard first-line chemotherapy for pancreatic cancer. However, chemoresistance commonly occurs and is the main cause of therapeutic failure. Hedgehog (Hh) pathway is a core signaling pathway in the initiation and progression of pancreatic cancer, the aberrant activation of Hh pathway is associated with the expression of multidrug resistance related proteins and the maintenance and self-renewal of cancer stem cells. Aims: To investigate the correlation between expressions of Hh pathway related factors and gemcitabine intrinsic chemoresistance in pancreatic cancer. Methods: Human pancreatic cancer cell line CFPAC-1 and PANC-1 were treated with gemcitabine, GANT61 -- the inhibitor of Hh pathway, purmorphamine -- the agonist of Hh pathway, and gemcitabine combined with GANT61 or purmorphamine, respectively. Expressions of the Hh pathway related factors Shh, Ptch, Smo and Gli1 were detected by real-time PCR and Western blotting, and CCK-8 assay was used to assess the effect of various interventions on cell viability. Results: Compared with CFPAC-1 cells, expressions of Hh pathway related factors were significantly higher in PANC-1 cells (P<0.05) and PANC-1 cells was more resistant to gemcitabine. GANT61 could down-regulate Gli1 expression and increase the sensitivity to gemcitabine in PANC-1 cells, whereas purmorphamine could up-regulate the expression of Glil and decrease the sensitivity to gemcitabine in CFPAC-1 cells (Pall <0.05). Conclusions: Expressions of Hh pathway related factors are correlated with gemcitabine intrinsic chemoresistance in pancreatic cancer. Inhibiting Hh pathway aberrant activation might increase the sensitivity of pancreatic cancer cells to gemcitabine.

Pancreatic Neoplasms; Gemcitabine; Hedgehog Pathway; Hedgehog Proteins; Drug Resistance, Neoplasm

10.3969/j.issn.1008-7125.2016.11.004

*Email:xinxinyuxin0711@163.com

#本文通信作者，Email: 13770771661@163.com