高酸發(fā)酵液的發(fā)酵條件優(yōu)化研究

薛正楷

（1.瀘州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川瀘州646001； 2.瀘州市生物醫(yī)學(xué)工程研究所，四川瀘州646001；3.瀘州森普裕隆生物科技有限公司，四川瀘州646002）

高酸發(fā)酵液的發(fā)酵條件優(yōu)化研究

薛正楷1，2，3

（1.瀘州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川瀘州646001； 2.瀘州市生物醫(yī)學(xué)工程研究所，四川瀘州646001；3.瀘州森普裕隆生物科技有限公司，四川瀘州646002）

為了獲得濃香型白酒的高己酸和高總酸發(fā)酵液，本研究采用均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)和多因子及互作項(xiàng)回歸方法，對(duì)高酸發(fā)酵液的發(fā)酵配方和溫度進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與所得回歸方程具有顯著的擬合度（P＜0.01），從數(shù)學(xué)模型和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到的最優(yōu)配方及溫度組合為：葡萄糖120 g/L、酵母膏19 g/L、MgCl21 g/L、乙酸鈉27.5 g/L、K2HPO41 g/L，28℃。

高酸； 發(fā)酵液； 優(yōu)化； 發(fā)酵條件； 白酒

己酸是濃香型白酒生成己酸乙酯的前體物質(zhì)，己酸來源于濃香型白酒發(fā)酵過程中窖泥己酸菌的代謝活動(dòng)，其量的多少與窖齡密切相關(guān)，正如“千年老窖產(chǎn)好酒”，窖齡是生產(chǎn)好酒的重要前提。如何突破傳統(tǒng)白酒生產(chǎn)中窖齡對(duì)濃香型己酸乙酯產(chǎn)量的限制，可用于濃香型白酒灌窖或串香的高酸發(fā)酵液的生產(chǎn)是重要的嘗試[1-4]。

高酸發(fā)酵液，尤其是高己酸發(fā)酵液，可以提高濃香型白酒的酯（尤其是己酸乙酯）含量，其制備多采用經(jīng)驗(yàn)方法[5-6]，盡管此方法在生產(chǎn)實(shí)踐中被釀酒企業(yè)廣泛采用，但獲得的優(yōu)化配方具有較大的不可靠性和效率低下的弊端。因此如何借助現(xiàn)代統(tǒng)計(jì)分析方法，指導(dǎo)白酒的生產(chǎn)實(shí)踐，越來越受到白酒產(chǎn)業(yè)研究者的重視[7]。

“均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)”(Uniform Design)方法是20世紀(jì)70年代，由方開泰和王元院士利用偽蒙特卡羅方法，挑選實(shí)驗(yàn)點(diǎn)時(shí)，只考慮實(shí)驗(yàn)點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)充分“均勻散布”，不考慮“整齊可比”而提出的，由于不考慮“整齊可比”，因而大大減少了實(shí)驗(yàn)次數(shù)，且可以達(dá)到較好的尋找最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件的效果，由于均勻設(shè)計(jì)是建立在特定的穩(wěn)健回歸模型的基礎(chǔ)上，不但通過分析回歸模型中實(shí)驗(yàn)因子間的主效應(yīng)，而且可以分析因子間的交互效應(yīng)[8]。均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)法廣泛用于復(fù)雜因子的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，獲得了國際國內(nèi)的高度認(rèn)可[9-13]。

由于發(fā)酵液發(fā)酵過程中，對(duì)己酸影響因素眾多，如何高效獲得最佳的產(chǎn)己酸條件，均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)方法是較佳的探索工具，本研究擬采用均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)原理，對(duì)產(chǎn)己酸培養(yǎng)基成分及其溫度條件進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得較佳的發(fā)酵組合，為濃香型白酒企業(yè)生產(chǎn)高己酸發(fā)酵液提供理論和產(chǎn)業(yè)化依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

微生物：己酸菌分離自瀘州老窖萬賓酒業(yè)有限公司窖齡180余年的窖池，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisi-ae，ATCC26785）購自廣東微生物研究所，丁酸梭菌（Clostridium butyricum，ATCC19398）購自上海瑞楚生物科技有限公司。

試劑：葡萄糖、酵母膏、乙酸鈉、MgCl2、K2HPO4均為分析純，購自成都科龍?jiān)噭S。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基制備

根據(jù)文獻(xiàn)選擇葡萄糖、酵母膏、乙酸鈉、MgCl2、K2HPO4為發(fā)酵培養(yǎng)基成分，其水平見表1。

表1 高酸培養(yǎng)基因素與水平

采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，對(duì)表1中發(fā)酵培養(yǎng)基各因素進(jìn)行均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見表2。

表2 高酸培養(yǎng)基均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)表

取100m L三角瓶，按均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)表2加入試劑，并各加入5 g CaCO3和100m L自來水，121℃滅菌30min，待溫度降至90℃左右，分別各加入10m L己酸菌和丁酸菌，待溫度降至30℃左右，再加入5m L酵母菌菌液，混勻器上振蕩均勻三角瓶內(nèi)物料，調(diào)整每瓶的總體積為100m L,保鮮膜封口，在設(shè)定的溫度條件下發(fā)酵15 d，每組做3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 發(fā)酵液的色譜檢測

1.2.2.1 發(fā)酵液的預(yù)處理

采用pH計(jì)測定發(fā)酵液每組的pH值并記錄，吸取1m L發(fā)酵液，用1M鹽酸溶液，調(diào)pH3，記錄鹽酸用量；取490μL發(fā)酵液，加入10μL 2-乙基丁酸內(nèi)標(biāo)溶液，振蕩混勻，加入其1m L發(fā)酵液1/2量的1M鹽酸溶液用量，12000 r/m in離心10m in，取上清液400μL，0.22μM過濾，濾液置4℃冰箱備用。

1.2.2.2 發(fā)酵液的色譜分析

色譜柱：色譜柱：LZP-930白酒分析專用柱，柱長18m，內(nèi)徑0.53mm，購自中國科學(xué)院蘭州物理化學(xué)研究所。

色譜條件：檢測器溫度：200℃，氣化室溫度：200℃。

進(jìn)樣模式：分流，分流比：50∶1。

色譜柱：25.0m，內(nèi)徑：0.32mm，涂層厚度1μm。

升溫程序：65℃—3m in—3.5℃/min—150℃—2min。

分析時(shí)間：30m in。

1.2.3 發(fā)酵液中總酸的測定

1.2.3.1 測定

吸取10.0m L樣品于100m L容量瓶中,加水至刻度,混勻。吸取20.0m L,置于200m L燒杯中,加水60m L,開動(dòng)磁力攪拌器,用0.05mol/LNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計(jì)指示pH8.2。同時(shí)做試劑空白實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.2 計(jì)算

式中：X——試樣中總酸的含量(以乙酸計(jì))，g/100m L；

V1——測定用試樣稀釋液消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)液的體積，m L；

V2——試劑空白消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，m L；

C——NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；

0.060與1.0m L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液[c(NaOH)=1.000mol/L]相當(dāng)乙酸的質(zhì)量,g；

V——試樣體積，m L。

1.2.4 模型的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取100m L錐形瓶6只，分成A、B兩組，其中A為己酸組、B為總酸組，每組按表3每瓶加入葡萄糖、酵母膏、MgCl2、乙酸鈉、K2HPO4和100m L自來水，121℃滅菌30m in，待溫度降至95℃左右，分別各加入10m L己酸菌和丁酸菌，待溫度降至30℃左右，再加入5m L酵母菌菌液，保鮮膜封口，在28℃條件下，發(fā)酵15 d，取發(fā)酵液進(jìn)行酸產(chǎn)量檢測。

1.2.5 數(shù)據(jù)的處理采用DPS數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)和spss17.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。

表3 高酸發(fā)酵液酸產(chǎn)量的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 高酸發(fā)酵液的色譜圖（見圖1）

圖1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及發(fā)酵液的色譜檢測圖

2.2 高酸發(fā)酵液酸響應(yīng)值的色譜分析

對(duì)15 d發(fā)酵液進(jìn)行氣相色譜檢測，己酸和總酸產(chǎn)量見圖2。

圖2 高酸發(fā)酵液酸產(chǎn)量檢測結(jié)果

從圖2可知，己酸在N12組中達(dá)最高濃度，為1336.37mg/100m L±122.41mg/100m L，此時(shí)的發(fā)酵因素組合為：葡萄糖、酵母膏、MgCl2、乙酸鈉、K2HPO4濃度分別為40 g/L、13 g/L、1 g/L、15 g/L和1 g/L，溫度為35℃；總酸在N12組中達(dá)最高濃度，為1828.19 mg/100 m L± 41.14mg/100m L，此時(shí)的發(fā)酵因素組合與己酸一致。

2.3 高酸發(fā)酵液酸響應(yīng)值的回歸分析

對(duì)發(fā)酵液的己酸和總酸響應(yīng)值，采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中的多因子及相互作用法進(jìn)行逐步回歸。

2.3.1 高酸發(fā)酵液己酸響應(yīng)值的回歸分析

高酸發(fā)酵液體中，己酸響應(yīng)值的多因子及相互作用回歸結(jié)果及參數(shù)檢驗(yàn)見表4。

表4 回歸分析結(jié)果及其參數(shù)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)

己酸響應(yīng)值的回歸方程為：

其偏相關(guān)分析F值、相關(guān)系數(shù)及其顯著水平p值、Durbin-Watson統(tǒng)計(jì)量均表明：本實(shí)驗(yàn)建立的回歸方程可用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)分析；依據(jù)該回歸方程預(yù)測的最大己酸產(chǎn)量及其因素組合為：葡萄糖120 g/L、酵母膏19 g/L、MgCl21 g/L、乙酸鈉27.5 g/L、K2HPO41 g/L，在28℃下發(fā)酵15 d，預(yù)測己酸產(chǎn)量可達(dá)到2177.3246mg/100m L。

2.3.2 高酸發(fā)酵液總酸響應(yīng)值的回歸分析

高酸發(fā)酵液中，總酸響應(yīng)值的多因子及相互作用回歸結(jié)果及參數(shù)檢驗(yàn)見表5，總酸的回歸結(jié)果及參數(shù)檢驗(yàn)見表5。

表5 回歸分析結(jié)果及其參數(shù)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)

總酸響應(yīng)值的回歸方程為：

其偏相關(guān)分析F值、相關(guān)系數(shù)及其顯著水平p值、Durbin-Watson統(tǒng)計(jì)量均表明：本實(shí)驗(yàn)建立的回歸方程可用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)分析；依據(jù)該回歸方程預(yù)測的最大總酸產(chǎn)量及其因素組合為：葡萄糖119.9998 g/L、酵母膏19 g/L、MgCl21 g/L、乙酸鈉27.5 g/L、K2HPO41 g/L，在28℃下發(fā)酵15 d，預(yù)測的總酸產(chǎn)量可達(dá)到4856.3101mg/100m L。

2.3.3 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)酯化液采用2.3.2項(xiàng)下發(fā)酵液的色譜檢測，其酸產(chǎn)量結(jié)果見表6?？偹釢舛葹?736.33mg/100m L±215mg/100m L，與預(yù)測值4856.31mg/100m L僅相差119.98mg/100m L，表明實(shí)驗(yàn)值與模型預(yù)測值基本相符，證明了本研究通過均勻?qū)嶒?yàn)擬合的回歸模型有效性以及高酸發(fā)酵液的生產(chǎn)應(yīng)用具有較強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。

表6 高酸發(fā)酵液酸產(chǎn)量的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (mg/100 mL)

3 結(jié)論

3.1 己酸發(fā)酵液酸濃度的主效應(yīng)因素

影響己酸發(fā)酵液中己酸濃度的主效應(yīng)因素為：葡萄糖（P=0.0001）、酵母膏（P=0.0001）、乙酸鈉（P=0.0001）；同時(shí)，葡萄糖與酵母膏（P=0.0001）、葡萄糖與乙酸鈉（P= 0.0002）、酵母膏與MgCl2（P=0.0001）、酵母膏與乙酸鈉（P=0.0219）、酵母膏與發(fā)酵溫度（P=0.0002）、乙酸鈉與發(fā)酵溫度（P=0.0001）、K2HPO4與發(fā)酵溫度（P=0.0001）交互作用對(duì)己酸產(chǎn)量有顯著的影響；而影響總酸的主效應(yīng)因素為：葡萄糖（0.0046）和K2HPO4（0.0001）；同時(shí)，葡萄糖與酵母膏（0.0001）、葡萄糖與溫度（0.0001）、酵母膏與乙酸鈉（0.0001）、酵母膏與溫度（0.0001）、MgCl2與乙酸鈉（0.0001）、MgCl2與K2HPO4（0.0001）、K2HPO4與溫度（0.0001）的交互作用均對(duì)總酸有顯著的影響。

3.2 己酸發(fā)酵液產(chǎn)己酸的最佳工藝條件

應(yīng)用均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)及回歸分析結(jié)果表明：葡萄糖120 g/L、酵母膏19 g/L、MgCl21 g/L、乙酸鈉27.5 g/L、K2HPO41 g/L，在28℃下發(fā)酵15 d，發(fā)酵液中己酸濃度可達(dá)2053.60 mg/100 m L±52.42 mg/100 m L，與預(yù)測值2177.32mg/100m L相差僅123.72mg/100m L；發(fā)酵液中

[1] 黃艷梅,盧建春,李安軍,等.采用氣相色譜-質(zhì)譜分析古井貢酒中的風(fēng)味物質(zhì)[J].釀酒科技,2009(12)：112-116.

[2] 唐麗云,李國紅,王步利,等.利用黃水酯化液提高濃香型白酒質(zhì)量[J].食品與發(fā)酵科技,2013,49(3)：50-59.

[3] 陳帥,劉琨毅,鄭佳,等.基于響應(yīng)面法優(yōu)化釀酒黃水酶促酯化條件的研究[J].生物工程,2012,33(12)：205-209.

[4] 劉義剛,周治全,周超,等.全細(xì)胞酯化曲（酶）在生物酯化液中的應(yīng)用[J].釀酒科技,2016,260(2)：72-76.

[5] 唐麗云,李國紅,王步利,等.利用黃水酯化液提高濃香型白酒質(zhì)量[J].食品與發(fā)酵科技,2013(3)：50-51.

[6] 于蘭.利用己酸菌酯化液提高口子窖優(yōu)質(zhì)酒得率[J].釀酒, 2010,37(5)：55-56.

[7] 陳帥,劉琨毅,鄭佳,等.基于響應(yīng)面法優(yōu)化釀酒黃水酶促酯化條件的研究[J].食品工業(yè)科技,2012,33(12)：205-209.

[8]Hua LK,Wang,Y.Applicationsof number theory to numerical analysis[M].Berlin:Springer-Verlag,1981.

[9] Fang K T,Zhang JT.Criteria foruniform design,technical reportMATH-002[R].Hong Kong:Hong Kong BaptistCollege, 1992.

[10] Kong F,Yu S,BiY,etal.Optimization of processparameters and kineticmodelof enzymatic extraction of polyphenols from Lonicerae flos[J].Pharmacognosy Magazine,2016,12 (45)：70-74.

[11]Wang JP,Chen Y Z,Wang Y,etal.Optimization of the coagulation-flocculation process for pulpm illwastewater treatmentusing a combination ofuniform design and response surfacemethodology[J].Water Research,2011,45 (17)：5633-5640.

[12] Buenno LH,Rocha JC,Leme J,etal.Use ofuniform designs in combinationw ith neuralnetworks for viral infection process development[J].Biotechnology Progress,2015,31(2)：532-540.

[13] 熊晶晶,張玉瓊,周昌妮,等.均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選干姜超臨界萃取物微囊制備工藝[J].中國現(xiàn)代中藥,2015,17(4)：395-398.

Optim ization of Fermentation Conditionsof High-Acid Fermenting Liquid

XUEZhengkai1,2,3
(1.Luzhou Vocational Technology College,Luzhou,Sichuan 646001;2.Luzhou Instituteof Biomedical Engineering, Luzhou,Sichuan 646001;3.Luzhou St-Monon BiomedicalCo.Ltd.,Luzhou,Sichuan 646002,China)

In order to obtain Nongxiang Baijiu fermenting liquid w ith high caproic acid and high totalacids,uniform design andmulti-factor interaction regression method were adopted to optimize the fermentation formula and temperature for high-acid fermenting liquid.The results demonstrated that,the trial data from the optimized test had a significant degree of fitting w ith themathematicalmodel(P＜0.01).The optimum fermentation conditions for high-acid fermenting liquid were summed up as follows:glucose 120 g/L,yeastextracts 19 g/L,MgCl21 g/L, sodium acetate27.5 g/L,K2HPO41 g/L,and fermenting temperatureat28℃.

high-acid;fermenting liquid;optimization;fermentation conditions;Baijiu

TS262.3；TS261.4；TS261.1

A

1001-9286（2016）12-0024-04

10.13746/j.njkj.2016165

四川省科技廳科技支撐項(xiàng)目（NO.2014FZ0018）；四川省教育廳理工重點(diǎn)項(xiàng)目；瀘州市科技局重點(diǎn)項(xiàng)目(NO.2013-S-44(4/8)。

2016-05-17；

2016-10-10

薛正楷（1968-），男，博士，副研究員，研究方向：微生物代謝及其應(yīng)用研究。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-11-04；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20161104.1411.003.htm l。