李靜++葉志中++尹志華++陳新鵬

【摘 要】 目前類風濕關節(jié)炎的發(fā)病機制尚不清楚。隨著對類風濕關節(jié)炎的深入研究，近年來多種生物制劑的臨床治療獲得了成功；但生物制劑花費較高且易感染，而基因治療能夠克服這些缺點?；蛑委熤饕ò谢虻倪x擇、動物模型的實驗研究以及臨床試驗的研究等。靶基因的選擇中，主要闡述了調控細胞因子的相關基因、核轉錄因子-κB抑制劑以及調控細胞凋亡的相關基因。雖然類風濕關節(jié)炎的基因治療目前處于探索階段；但現(xiàn)有的臨床研究表明基因治療有顯著的療效，進一步說明類風濕關節(jié)炎的基因治療有較好的研究前景。

【關鍵詞】 關節(jié)炎，類風濕；基因治療；靶基因；綜述

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以對稱性的累及外周關節(jié)的持續(xù)性滑膜炎為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫性疾病，主要特點是滑膜炎癥導致血管翳的形成、軟骨破壞及骨質侵蝕，而最終影響關節(jié)的完整性。RA的發(fā)病機制尚不完全清楚，傳統(tǒng)的藥物治療能夠有效控制疾病的進展；但是存在起效慢以及不良反應多等缺點。目前，生物制劑已經(jīng)廣泛應用于臨床，然而仍有一部分患者應用生物制劑效果并不明顯。生物制劑的主要缺點是限制免疫系統(tǒng)的功能，導致機體更容易感染。而基因治療避免了這些缺點，基因治療的主要思路是將具有編碼治療性蛋白的基因導入特定的組織中，使患者能夠持續(xù)性地產(chǎn)生這種治療性蛋白，這給RA的治療開辟了新路徑。

1 基因治療的一般過程

基因治療能夠潛在地治療疾病的遺傳性，主要方法是在靶細胞內通過抵消或者替換某些缺陷基因，從而達到治療該缺陷基因引起某種疾病的目的[1]。

基因治療的過程主要包括4個階段。（1）目的基因的獲取，常用的方法有：①通過限制性內切酶在生物體基因上直接提取目的基因；②采用逆轉錄酶，以mRNA為模板合成單鏈DNA，再經(jīng)DNA聚合酶作用產(chǎn)生雙鏈DNA；③根據(jù)已知的氨基酸人工合成DNA；④用PCR擴增特定片段。（2）載

體的選擇，主要有病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)。病毒載體系統(tǒng)除了常用的腺病毒、逆轉錄病毒之外，還包括慢病毒、皰疹病毒、麻疹病毒及桿狀病毒等。（3）重組DNA的構建，即用DNA連接酶將目的基因DNA分子與載體連接，形成一個具有自我復制能力的雜合子DNA。（4）重組DNA導入體細胞。

人類的疾病主要分為單基因遺傳病、多基因遺傳病以及獲得性基因遺傳病。RA的發(fā)病機制仍不清楚，目前研究表明，RA可能是復雜的多基因遺傳病，與多個尚未闡明的易感基因以及環(huán)境因素之間的相互聯(lián)系有關[2]。盡管RA的遺傳性并不符合傳統(tǒng)意義上的孟德爾定律，但是基因治療同樣可用于RA患者的治療[3]。

2 RA的基因治療

2.1 細胞因子的基因治療 目前基因治療研究較多的是與細胞因子有關的靶基因。細胞因子參與了RA的發(fā)病機制相關的免疫應答中，促進自身免疫反應、慢性炎癥的形成過程及組織的破壞。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及白細胞介素-1β（IL-1β）的抑制劑已在臨床中廣泛應用于RA的治療，并取得了良好的效果。這一點同時也支持細胞因子在RA中發(fā)揮重要作用的觀點，基因治療的靶基因，特別是細胞因子相關的靶基因是重要的研究方向。

TNF-α在RA的發(fā)病機制中有重要作用，在RA滑膜組織中調節(jié)其他促炎性細胞因子的產(chǎn)生。TNF-α主要由巨噬細胞產(chǎn)生，同樣也可以由單核細胞、成纖維細胞、肥大細胞及自然殺傷細胞等產(chǎn)生。目前的研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α有2個受體，即TNF-RⅠ受體及TNF-RⅡ受體。TNF-RⅡ受體有更多的限制，主要在調節(jié)性T細胞中高度表達[4]。TNF-α的免疫功能主要是通過誘導促炎性細胞因子，以及刺激免疫細胞的免疫效應來發(fā)揮作用的，而刺激免疫細胞往往是通過TNF受體來介導的[5]。Rossol等[6]通過實驗發(fā)現(xiàn)，TNF-α和TNF-RⅠ之間的相互關系在滑膜內T細胞的轉移中有重要作用。收集RA的滑膜組織切片在體外環(huán)境下培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下可以觀察到轉移的CD4+T細胞，結果表明，來自RA患者的CD4+T細胞轉移到滑膜組織中，而健康對照組的CD4+T細胞并沒有轉移到滑膜組織中。在對比實驗中發(fā)現(xiàn)，TNF-RⅠ和ICAM-1是CD4+T細胞轉移至滑膜液中必不可少的條件[6]。

IL-1家族主要包括11種細胞因子，即7種促炎性細胞因子（IL-1α、IL-1β、IL-18、IL-33、IL-36α、IL-36β、IL-36γ）和4種抗炎性細胞因子（IL-1Ra、IL-36Ra、IL-37、IL-38），在介導免疫應答中有重要的作用[7]。內源性抑制劑IL-1Ra具有阻斷IL-1α及IL-1β的作用，IL-1的受體包括IL-1RⅠ及IL-1RⅡ。編碼IL-1α、IL-1β及IL-Ra的基因存在多態(tài)性，該位點的基因多態(tài)性提高了RA的易感性以及改變了IL-1的生成。IL-1β基因rs 169 44位點的多態(tài)性同樣影響IL-1的表達，這也與RA患者的關節(jié)損害密切相關[8]。IL-Ra主要是通過刺激單核細胞的抗炎細胞因子產(chǎn)生的。Hu等[9]將IL-Ra基因轉染至間充質干細胞，量化重組骨髓間充質干細胞產(chǎn)生的IL-Ra相關蛋白，然后觀察APA微囊劑的滲透性，并通過對CIA小鼠模型的治療來評估臨床效果，結果表明，帶有IL-Ra基因轉染的間充質干細胞對RA有潛在治療效果[9]。

一些生長因子已經(jīng)被證實在骨科疾病模型中有一定的治療效果。骨形成蛋白（BMPs）在軟骨及骨的形成中有重要的作用[10]，特別是BMP-2及BMP-7有最大的成骨效能，并且已經(jīng)被批準用于臨床的重組蛋白。但是由于其半衰期短以及能夠明顯降低細菌表達蛋白的活性，故這種蛋白療法是有限的[11]?；蛑委熆梢酝ㄟ^高水平的局部轉基因表達來克服這些缺點。某些生長因子已被用于RA治療的研究，例如轉化生長因子-β1（TGF-β1）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）等。最近有研究表明，IGF-1的基因治療獲得了有限的成功。腺病毒載體介導的IGF-1在體外轉染骨髓間充質干細胞中不能促進軟骨的分化，但是在軟骨的形成中表達TGF-β1有協(xié)同作用[12]。腺病毒作為載體能夠成功在體外環(huán)境下將馬的IGF-1轉導入馬的軟骨細胞。將這種經(jīng)過修飾的細胞再導入有15 mm軟骨破損的股膝關節(jié)中，能夠觀察到基質的合成及軟骨的修復[13]。RA相關的促炎性細胞因子，例如TNF-α及IL-1β能夠產(chǎn)生IGF-1的抵抗，這些研究表明IGF-1在RA的基因治療中有較好的研究前景。

2.2 細胞凋亡基因的治療 許多研究表明，在人類自身免疫性疾病中，外周血存在單核細胞過度的細胞凋亡，而不一定是有缺陷的免疫細胞的凋亡，通過誘導細胞凋亡以及抑制細胞周期的延長改善RA關節(jié)破壞是一種新的治療方向。目前發(fā)現(xiàn)在Fas基因的啟動子區(qū)域，2個單核苷酸多態(tài)性是已經(jīng)被證實了，主要包括-1377G-A和-670A-G。這些單核苷酸多態(tài)性的生物學功能還不確定，而Fas-1377位點的多態(tài)性可能與轉錄因子SP-1序列有關。Fas/FasL啟動子區(qū)的基因變化可能在影響RA細胞凋亡中有重要意義[14]。

FasL是Fas在體內的天然配體，屬于TNF/LT家族。細胞凋亡機制的受損以及Fas基因的過度表達可能導致多種遺傳性疾病。當Fas與FasL結合后，可以導致攜帶有Fas的細胞發(fā)生凋亡，而細胞膜上的Fas與Fas交聯(lián)成Fas三聚體，繼而誘導Fas分子胞質區(qū)死亡結構域（DD）與一種含有死亡結構域的Fas相關蛋白（FADD）結合，最終導致細胞凋亡的發(fā)生。CTLA4-FasL是CTLA4和FasL的胞外結構域的融合產(chǎn)物，是將T細胞的兩種抑制分子整合到同一個分子中。重組腺相關病毒（AAV）編碼鼠CTLA4-FasL融合基因（rAAV.CTLA4-FasL）注射到小鼠踝關節(jié)內后，觀察到rAAV.CTLA4-FasL抑制了AIA模型中小鼠關節(jié)炎的進展，這表明關節(jié)腔內局部注射CTLA4-FasL可能對RA疾病的進展有潛在的治療效果[15]。

2.3 核轉錄因子-κB（NF-κB）抑制劑 RA的滑膜成纖維細胞中信號轉導通路的中斷是轉基因治療的新方向，可以通過抑制或者激活轉錄因子的信號轉導機制，減少細胞因子介導的慢性炎癥。NF-κB在分化、代謝以及CNS的某些特定功能中有重要作用[16]。NF-κB是由5種DNA相關蛋白組成，主要包括relA（p65）、relB、c-rel、p50以及p52等。這些二聚體被細胞抑制劑抑制其功能，當信號介導導致細胞抑制劑降解后能夠釋放其功能，能夠在滑膜成纖維樣細胞的培養(yǎng)中以及RA患者的滑膜組織中檢測到NF-κB的活化，在關節(jié)炎動物模型中同樣能夠檢測到NF-κB在RA的疾病發(fā)展中有重要的作用[17]。

最近的研究表明，與NF-κB信號遺傳相關的基因包括CD40、TRAF1、TNFAIP3以及c-REL，同樣也強調了NF-κB的活化在RA發(fā)病機制中的重要作用[18]。目前研究表明，NF-κB的活化主要有2條路徑[19]。在經(jīng)典的路徑中，細胞質中的IκBα抑制p50/rel A二聚體的功能。激活經(jīng)典路徑的信號主要包括抗原受體以及細胞因子受體，細胞因子受體主要為TNFR1、IL-1R以及Toll樣受體（TLR）。另外一條非經(jīng)典路徑是NF-κB的活化，包括p100和p105等4種NF-κB亞基。p100和p105分別是p52和p50的前體[20]。齊晅等[21]分別取RA和健康人群的成纖維樣滑膜細胞（FLS）進行培養(yǎng)，然后分別用相同劑量的NF-κB抑制劑，結果表明，與對照組相比，NF-κB能夠誘導FLS的凋亡，并抑制促炎性細胞因子TNF-α以及IL-1β的釋放?；虻南嚓P性分析能夠幫我們預測疾病的風險以及潛在的治療方案，通過全基因組相關分析（GWAS）發(fā)現(xiàn)，NF-κB路徑可能是RA發(fā)病的潛在危險因素[20]。

3 基因治療在動物模型中的進展

目前建立動物RA模型的方法較多，主要有小鼠膠原誘導性關節(jié)炎（CIA）、大鼠鏈球菌細胞壁誘導關節(jié)炎（SCW）、小鼠酵母聚糖誘導關節(jié)炎（ZIA）、兔抗原誘導關節(jié)炎（AIA）。國內許多實驗室利用CIA模型進行篩選藥物、轉基因、免疫治療及發(fā)病機制方面的研究。

CIA模型被用來研究已經(jīng)超過30年，即使現(xiàn)在仍能從小鼠CIA模型中學到很多，然而CIA模型只模擬了人類RA的一小部分模型片段。RA患者與小鼠CIA模型的不同主要體現(xiàn)在缺乏性別差異，以及RA患者會產(chǎn)生類似于類風濕因子（RF）、抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體（抗CCP抗體）之類的抗體。

4 RA基因治療的臨床試驗

美國的匹茲堡大學在1996年完成實施了第1例

應用基因轉移技術治療RA的臨床試驗，主要實驗方法是將治療基因轉移至RA患者關節(jié)中，用以確定對RA患者治療的可行性及安全性。主要研究對象是需要關節(jié)置換術的嚴重RA終末期患者，將攜帶有IL-1Ra基因輸入到RA的第2～5掌指關節(jié)中，在RA患者的其他炎性關節(jié)置換術中獲得了自體滑膜細胞的培養(yǎng)。將這些培養(yǎng)的自體滑膜細胞擴增，其中一半被逆轉錄病毒轉染，另一半未修飾的滑膜細胞保持自體遺傳的同源性作為對照組。培養(yǎng)這些滑膜細胞，并將其重新注入掌指關節(jié)中。其中有

2個關節(jié)獲得IL-1Ra表達的細胞，另外2個關節(jié)獲得未修飾的滑膜細胞。通過ELISA和PCR分析，結果表明，帶有IL-1Ra基因的確轉入關節(jié)中，并得到有效表達[22]。

盡管逆轉錄病毒在臨床試驗中得到有效應用，逆轉錄病毒本身存在安全問題及費用問題，因此在RA這類非致死性疾病中，研究者們開始采用相對更安全、更便宜的腺病毒載體。腺病毒載體已經(jīng)成功運用于超過47項人類臨床試驗中，總共有600多例患者[23]。Targeted Genetics公司進行了一項針對RA基因治療的臨床試驗研究，主要是測試能夠完全編碼TNFR：Fc的單鏈rAAV2病毒的臨床有效性，這種目的基因產(chǎn)物主要是結合了胞外的人類TNF-RⅡ及IgG1的Fc結構區(qū)。在臨床試驗進程一半的時候，發(fā)現(xiàn)單個和重復的關節(jié)腔內注射AVV2-TNFR：Fc（tgAAC94）是安全的，并且具有良好的耐受性[24]。然而在2007年6月24日

1例36歲的RA患者于第2次關節(jié)腔內注射22 d后死亡[25]，F(xiàn)DA立即叫停了這項臨床試驗，并對患者死亡原因進行調查。調查結果顯示，患者死亡原因與本次試驗的tgAAC94無明顯相關性，故于同年9月允許此臨床試驗繼續(xù)進行[31]。試驗結果表明，rAAV載體是安全的，而且通過關節(jié)外的檢測證實目前并沒有證據(jù)表明關節(jié)外TNFR：Fc的過度表達。臨床結果證實，實驗組相比對照組，靶關節(jié)的臨床癥狀得到較好的改善[32]?；蛑委熍R床試驗的成功證實了將基因轉導入靶關節(jié)中，并得到有效、穩(wěn)定、持續(xù)的表達是可能的，這為RA治療方法的探索提供了新的研究方向。

5 問題及展望

近來RA的基因治療發(fā)展較快，通過試驗研究獲得了較大的突破及發(fā)展；但是目前基因治療RA存在一些問題。主要包括：①基因治療RA的實驗研究缺乏理想的RA動物模型，目前的動物模型只有關節(jié)炎癥的單次發(fā)作或者一個階段的發(fā)展。②帶有目的基因的載體可能播散到靶器官外，目的基因難以穩(wěn)定表達，并且目的基因的調控也存在問題。③最大的限制性問題是缺乏理想的載體，目前使用最多的是逆轉錄病毒、腺病毒及非病毒載體。逆轉錄病毒能穩(wěn)定表達，體內轉染率低，并且是隨機整合到體細胞染色體上的，已經(jīng)證明野生的逆轉錄病毒可引起細胞惡變。腺病毒載體轉染率高，但是不能穩(wěn)定表達，并且腺病毒存在免疫原性。非病毒載體的主要優(yōu)點是安全、穩(wěn)定，主要缺點是轉基因的表達時間短，在活體細胞中的轉染率較低。目前沒有一個載體能夠安全、穩(wěn)定、有效地表達。有理由相信，隨著載體、基因調控和轉染效率的不斷完善，基因治療將成為治療RA的有效手段。

6 參考文獻

[1] Naldini L.Gene therapy returns to centre stage[J].Nature，2015，526（7573）：351-360.

[2] Picerno V，F(xiàn)erro F，Adinolfi A，et al.One year in review：the pathogenesis of rheumatoid arthritis[J].Clin Exp Rheumatol，2015，33（4）：551-558.

[3] Evans CH，Ghivizzani SC，Robbins PD.Arthritis gene therapy and its tortuous path into the clinic[J].Transl Res，2013，161（4）：205-216.

[4] Monaco C，Nanchahal J，Taylor P，et al.Anti-TNF therapy：past，present and future[J].Int Immunol，2015，27（1）：55-62.

[5] Mula RVR，Shashidharamurthy R.Multifaceted role of TNF-α during the pathogenesis of rheumatoid arthritis[J].

Adv in Biosci & Biotechnol，2013，4（10）：937-940.

[6] Rossol M，Schubert K，Meusch U，et al.Tumor necrosis factor receptor type I expression of CD4+ T cells in rheumatoid arthritis enables them to follow tumor necrosis factor gradients into the rheumatoid synovium[J].Arthritis Rheum，2013，65（6）：1468-1476.

[7] Wang M，Wang B，Ma Z，et al.Detection of the novel IL-1 family cytokines by QAH-IL1F-1 assay inrheumatoid arthritis[J].Cell Mol Biol（Noisy-le-grand），2016，62（4）：31-34.

[8] Magyari L，Varszegi D，Kovesdi E，et al.Interleukins and interleukin receptors in rheumatoid arthritis：Research，diagnostics and clinical implications[J].World J Orthod，2014，5（4）：516-536.

[9] Hu J，Li H，Chi G，et al.IL-1RA gene-transfected bone marrow-derived mesenchymal stem cells in APA microcapsules could alleviate rheumatoid arthritis[J].Int J Clin Exp Med，2015，8（1）：706-713.

[10] Wu X，Shi W，Cao X.Multiplicity of BMP signaling in skeletal development[J].Ann N Y Acad Sci，2007，1116：29-49.

[11] Einhorn TA.Clinical applications of recombinant human BMPs：early experience and future development[J].J Bone Joint Surg Am，2003，85（13）：82-88.

[12] Evans CH，Ghivizzani SC，Robbins PD.The 2003 Nicolas Andry Award.Orthopaedic gene therapy[J].Clin Orthop Rel Res，2004（429）：316-329.

[13] Goodrich LR，Hidaka C，Robbins PD，et al.Genetic modification of chondrocytes with insulin-like growth factor-1 enhances cartilage healing in an equine model[J].J Bone Joint Surg Br，2007，89（5）：672-685.

[14] Kobak S，Berdeli A.Fas/FasL promoter gene polymorphism in patients with rheumatoid arthritis[J].Reumatismo，2012，64（6）：374-379.

[15] Zhang W，Wang F，Wang B，et al.Intraarticular gene delivery of CTLA4-FasL suppresses experimental arthritis[J].

Int Immunol，2012，24（6）：379-388.

[16] Tornatore L，Thotakura AK，Bennett J，et al.The nuclear factor kappa B signaling pathway：Integrating metabolism with inflammation[J].Trends Cell Biol，2012，22（11）：557-566.

[17] Roman-Blas JA，Jimenez SA.Targeting NF-κB：a promising molecular therapy in inflammatory arthritis[J].Int Rev Immunol，2008，27（5）：351-374.

[18] Criswell LA.Gene discovery in rheumatoid arthritis highlights the CD40/NF-κB signaling pathway in disease pathogenesis[J].Immunol Rev，2010，233（1）：55-61.

[19] Sun SC.The noncanonical NF-κB pathway[J].Immunol Rev，2012，246（1）：125-140.

[20] Scheinman R.NF-κB and Rheumatoid Arthritis：Will Understanding Genetic Risk Lead to a Therapeutic Reward？[J].For Immunopathol Dis Therap，2013，4（2）：93-110.

[21] 齊晅，田玉，孫超，等.NF-κB信號通路的阻斷對類風濕關節(jié)炎滑膜細胞凋亡與炎癥的影響[J].中國老年學雜志，2015，35（12）：7022-7024.

[22] Evans CH，Robbins PD，Ghivizzani SC，et al.Gene transfer to human joints：progress towards a gene therapy of arthritis[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（24）：8698-8703.

[23] Edelstein ML，Abedi MR，Wixon J.Gene therapy clinical trials worldwide to 2007-an update[J].J Gene Med，2007，9（10）：833-842.

[24] Mease P，Wei N，F(xiàn)udman E.Local treatment for inflammatory arthritis：A phase 1-2 clinical study of intra-articular administration of a recombinant adeno-associated vector containing a TNF-alpha antagonist gene[J].Arthritis Rheum，2007，56：793.

[25] Evans CH，Ghivizzani SC，Robbins PD.Arthritis gene therapys first death[J].Arthritis Res Ther，2008，10（3）：110.

[26] Mease PJ，Wei N，F(xiàn)udman EJ，et al.Safety，tolerability，and clinical outcomes after intraarticular injection of a recombinant adeno-associated vector containing a tumor necrosis factor antagonist gene：results of a phase 1/2 Study[J].J Rheumatol，2010，37（4）：692-703.

收稿日期：2016-06-29；修回日期：2016-07-25