吳偉偉 王千 龔杰 萬(wàn)喆 王愛(ài)平 李若瑜

(北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科 北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心，北京 100034)

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·論著·

不同分?jǐn)?shù)抑菌濃度解讀標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估抗真菌藥物體外聯(lián)合效應(yīng)比較

吳偉偉 王千 龔杰 萬(wàn)喆 王愛(ài)平 李若瑜

(北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科 北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心，北京 100034)

目的 明確酮康唑聯(lián)合特比萘芬或萘替芬相互作用模式，評(píng)估不同分?jǐn)?shù)抑菌濃度解讀標(biāo)準(zhǔn)對(duì)判斷抗真菌藥物體外聯(lián)合效應(yīng)的影響。方法 參考CLSI微量液基稀釋法M27-A3和M38-A2方案，采用棋盤微量稀釋法對(duì)100株分離自臨床真菌病患者的菌株進(jìn)行酮康唑與特比萘芬或奈替芬體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，包括皮膚癬菌，念珠菌和馬拉色菌。采用不同分?jǐn)?shù)抑菌濃度解讀標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估酮康唑與特比萘芬或奈替芬體外聯(lián)合效應(yīng)，A標(biāo)準(zhǔn)定義為：FICI≤0.5為協(xié)同作用，0.54為拮抗作用；B標(biāo)準(zhǔn):FICI≤0.5為協(xié)同作用，0.52為拮抗作用；C標(biāo)準(zhǔn)：FICI<1為協(xié)同作用，F(xiàn)ICI=1為相加作用，12為拮抗作用。結(jié)果 A標(biāo)準(zhǔn)與B標(biāo)準(zhǔn)具有較好的一致性，C標(biāo)準(zhǔn)則較為寬松。根據(jù)C標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行解讀會(huì)明顯擴(kuò)大協(xié)同效應(yīng)范圍。結(jié)論 定義FICI≤0.5為協(xié)同作用，0.54為拮抗作用的解讀標(biāo)準(zhǔn)，具有簡(jiǎn)便、一致性好的優(yōu)點(diǎn)，值得臨床采用。

抗真菌藥物；聯(lián)合；藥敏實(shí)驗(yàn)；分?jǐn)?shù)抑菌濃度

[Chin J Mycol，2016，11(2):85-89]

近年來(lái)隨著真菌感染臨床病例不斷增多及抗真菌藥物的廣泛應(yīng)用，真菌對(duì)抗真菌藥物的耐藥現(xiàn)象，特別是唑類藥物的耐藥現(xiàn)象也日漸嚴(yán)重，而抗真菌藥物的開(kāi)發(fā)卻相對(duì)緩慢，因此抗真菌藥物聯(lián)合應(yīng)用則為真菌病患者提供了更多的治療選擇。臨床實(shí)踐表明抗真菌藥物聯(lián)合應(yīng)用確實(shí)可對(duì)部分單一藥物治療無(wú)效的患者取得良好效果[1-4]，但如何選擇合適的抗真菌藥物進(jìn)行聯(lián)用是臨床醫(yī)師面臨的難題。棋盤法是最為常用的體外測(cè)定抗真菌藥物聯(lián)合效應(yīng)的方法，分?jǐn)?shù)抑菌濃度 (fractional inhibitory concentration index,FICI)則是最為常用解釋抗真菌藥物相互作用的模型，但其自身也存在缺點(diǎn)，如長(zhǎng)期以來(lái)不同文獻(xiàn)對(duì)于FICI自身解讀尚存在多種標(biāo)準(zhǔn)[5-8]。酮康唑、特比萘芬和萘替芬是唑類和丙烯胺類抗真菌藥物的典型代表，臨床廣泛應(yīng)用，但酮康唑與特比萘芬或萘替芬聯(lián)合用藥的實(shí)驗(yàn)資料極為有限。因此，為明確酮康唑與特比萘芬或萘替芬的聯(lián)合應(yīng)用價(jià)值，并評(píng)價(jià)不同分?jǐn)?shù)抑菌濃度解讀標(biāo)準(zhǔn)對(duì)抗真菌藥物聯(lián)合效應(yīng)評(píng)估的影響，我們根據(jù)CLSI M38-A2[9]和M27-A3[10]方案，采用棋盤微量稀釋法對(duì)近期國(guó)內(nèi)臨床分離到的100株真菌病患者致病菌株 (皮膚癬菌、念珠菌及馬拉色菌)進(jìn)行酮康唑與特比萘芬或萘替芬體外聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)，并采用不同分?jǐn)?shù)抑菌濃度判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行聯(lián)合效應(yīng)評(píng)估。

1 材料和方法

1.1 受試菌株

100株受試真菌系北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心保藏菌株，分離自臨床真菌病患者，均經(jīng)形態(tài)學(xué)和核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region)序列分析鑒定，其中包括皮膚癬菌屬45株 (紅色毛癬菌20株，趾間毛癬菌10株，絮狀表皮癬菌、犬小孢子菌和石膏樣小孢子菌各5株)，念珠菌屬40株 (白念珠菌25株，光滑念珠菌、熱帶念珠菌和近平滑念珠菌各5株)，馬拉色菌屬15株 (糠秕馬拉色菌12株，厚皮馬拉色菌3株)。質(zhì)控菌株為美國(guó)菌種保藏中心提供的近平滑念珠菌ATCC-22019和紅色毛癬菌ATCC-MYA-4439。

1.2 抗真菌藥

酮康唑、特比萘芬和萘替芬，均為標(biāo)準(zhǔn)試劑級(jí)粉劑。酮康唑購(gòu)自Sigma-Aldrich公司 (St.Louis,USA，批號(hào)為SLBK7327V)，特比萘芬和萘替芬購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院 (北京，中國(guó)，批號(hào)分別為100563-201402，100823-20501)。

1.3 培養(yǎng)基

皮膚癬菌和念珠菌培養(yǎng)基使用RPMI-1640液體培養(yǎng)基，稱取34.53 g MOPS (三氮嗎啡啉丙璜酸)和10.4 g RPMI-1640，加900 mL蒸餾水溶解后用pH計(jì)調(diào)整pH至7.0，定容至1 000 mL，過(guò)濾除菌并置于4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。馬拉色菌培養(yǎng)基使用Leeming-Nortman固體培養(yǎng)基和改良Leeming-Nortman液態(tài)培養(yǎng)基。Leeming-Nortman固體培養(yǎng)基包含1%蛋白胨、0.5%葡萄糖、0.1%酵母浸膏、0.4%牛膽汁鹽、0.1%甘油、0.05%單硬脂酸甘油酯、2%橄欖油、0.05%吐溫-60、1%全脂牛奶、1.2%瓊脂、0.5%放線菌酮和0.05%氯霉素[11]。改良Leeming-Nortman液態(tài)培養(yǎng)基包含0.1%葡萄糖、0.1%蛋白胨、0.8%牛膽汁鹽、0.2%酵母浸膏、0.1%甘油、0.5%吐溫-60、3%橄欖油和50 μg/mL氯霉素[12]。

1.4 真菌藥敏試驗(yàn)

藥物儲(chǔ)存液制備 采用100%二甲基亞砜 (DMSO)溶解稀釋3種抗真菌藥物至儲(chǔ)存液濃度為1.6 mg/mL，置于無(wú)菌聚乙烯小瓶-70℃存儲(chǔ)備用。

藥敏板制備 實(shí)驗(yàn)前使用RPMI-1640或改良Leeming-Nortman液體培養(yǎng)基將3種藥物儲(chǔ)存液進(jìn)行倍比稀釋，獲得4倍于終濃度的藥液。藥敏板第1列與第H行相交孔 (即左下角孔)為生長(zhǎng)對(duì)照孔，第1列及第H行 (除生長(zhǎng)對(duì)照孔外)為單藥藥敏試驗(yàn)區(qū)，第2～11列及A～G行交集處為聯(lián)合藥敏試驗(yàn)區(qū)，第12列為空白對(duì)照孔。采用棋盤法，將稀釋后藥液分別加入到96孔藥敏板 (12×8)中，取酮康唑、特比萘芬或萘替芬各稀釋濃度藥液50 μL依次加入A～G行或1～11列各孔。使得皮膚癬菌時(shí)，酮康唑最終濃度范圍為0.03～2 μg/mL，特比萘芬或萘替芬最終濃度范圍為0.000 25～0.125 μg/mL；念珠菌時(shí)，酮康唑最終濃度范圍為0.015～8 μg/mL，特比萘芬或萘替芬最終濃度范圍為0.125～8 μg/mL；馬拉色菌時(shí)，酮康唑最終濃度范圍為0.004～2 μg/mL，特比萘芬或萘替芬最終濃度范圍為0.5～32 μg/mL。藥敏板制備密封后置于-20℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

菌懸液制備 ①試驗(yàn)前將受試皮膚癬菌菌株接種在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基 (PDA)上30℃培養(yǎng)4～5 d使其活化。取1 mL無(wú)菌0.85%鹽水覆蓋菌落，輕輕用移液器尖端摩擦菌落制成菌懸液。將菌懸液吸至無(wú)菌試管中靜置10 min，取上清液振蕩15 s，血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)孢子，再用RPMI-1640液體培養(yǎng)基調(diào)整為終濃度菌懸液 (1～3)×103CFU/mL。②試驗(yàn)前將受試念珠菌菌株在沙氏固體培養(yǎng)基 (SDA)上連續(xù)轉(zhuǎn)種2次，以保證其純度和活力，隨后35℃培養(yǎng)24 h；將受試馬拉色菌菌株接種在Leeming-Nortman固體培養(yǎng)基連續(xù)傳代培養(yǎng)2次，第2次32℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)4 d。從培養(yǎng)基中挑取5個(gè)大約1 mm的菌落，用5 mL無(wú)菌0.85%鹽水混懸。震蕩15 s，混勻菌懸液。在530 nm波長(zhǎng)的比濁儀上，用無(wú)菌0.85%鹽水調(diào)整菌懸液到0.5個(gè)麥?zhǔn)媳葷岫?。震蕩混勻菌懸液，再用RPMI-1640液體培養(yǎng)基或改良Leeming-Nortman液體培養(yǎng)基調(diào)整為終濃度菌懸液 (0.5～2.5)×103CFU/mL。

菌懸液接種 試驗(yàn)當(dāng)天向已制備好的藥敏板每孔各加入100 μL稀釋好的2倍于終濃度的菌懸液 (空白對(duì)照孔除外)。

培養(yǎng) 接種后的藥敏板置于濕盒內(nèi)，皮膚癬菌、念珠菌和馬拉色菌分別在35℃培養(yǎng)5～7 d、48 h和3～5 d。每天觀察生長(zhǎng)情況，以陽(yáng)性對(duì)照孔生長(zhǎng)良好為準(zhǔn)。

結(jié)果判讀 按照CLSI M27-A3和M38-A2制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判讀。只有當(dāng)生長(zhǎng)對(duì)照生長(zhǎng)良好且質(zhì)控菌株最小抑菌濃度 (minimal inhibitory concentrations，MIC)值在規(guī)定范圍內(nèi)時(shí)，方認(rèn)為試驗(yàn)成功，可進(jìn)行結(jié)果判讀。所有試驗(yàn)均進(jìn)行2次。同一菌株MIC值在2次試驗(yàn)不超過(guò)2個(gè)稀釋度時(shí)認(rèn)為相同。MIC判讀標(biāo)準(zhǔn)均定為與生長(zhǎng)對(duì)照相比生長(zhǎng)明顯抑制 (80%)的最低藥物濃度。

1.5 聯(lián)合用藥效果評(píng)價(jià)

采用分?jǐn)?shù)抑菌濃度 (fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI)表示，即聯(lián)合用藥時(shí)藥物的MIC值分別除以單獨(dú)用藥時(shí)藥物MIC值的商之和，表示為：FICI=MIC A聯(lián)合/MIC A單獨(dú)+MIC B聯(lián)合/MIC B單獨(dú)。

藥物之間的相互作用解釋為：A標(biāo)準(zhǔn):FICI≤0.5為協(xié)同作用，0.54為拮抗作用[6]。B標(biāo)準(zhǔn):FICI≤0.5為協(xié)同作用，0.52為拮抗作用[7]。C標(biāo)準(zhǔn)：FICI<1為協(xié)同作用，F(xiàn)ICI=1為相加作用，12為拮抗作用[8]。

2 結(jié) 果

酮康唑與特比萘芬或萘替芬體外藥敏實(shí)驗(yàn)聯(lián)合效應(yīng)分析詳見(jiàn)表1和表2。根據(jù)A標(biāo)準(zhǔn)或B標(biāo)準(zhǔn)對(duì)聯(lián)合藥敏結(jié)果進(jìn)行解讀可得到較為一致的結(jié)果：酮康唑與特比萘芬或萘替芬聯(lián)用對(duì)各種皮膚癬菌，均未顯示出明顯協(xié)同效應(yīng)；酮康唑與特比萘芬聯(lián)用對(duì)白念珠菌表現(xiàn)為明顯協(xié)同效應(yīng)，對(duì)熱帶念珠菌和近平滑念珠菌表現(xiàn)為部分協(xié)同效應(yīng)，對(duì)光滑念珠菌無(wú)協(xié)同作用；酮康唑與萘替芬聯(lián)用對(duì)近平滑念珠菌顯示部分協(xié)同效應(yīng)，對(duì)白念珠菌、熱帶念珠菌和光滑念珠菌無(wú)明顯協(xié)同作用。酮康唑與特比萘芬聯(lián)用對(duì)兩種馬拉色菌均表現(xiàn)出明顯協(xié)同效應(yīng)，酮康唑與萘替芬聯(lián)用對(duì)糠秕馬拉色菌無(wú)明顯協(xié)同作用，對(duì)厚皮馬拉色菌則表現(xiàn)為部分協(xié)同效應(yīng)。根據(jù)C標(biāo)準(zhǔn)則可解讀為：酮康唑與特比萘芬或萘替芬聯(lián)用對(duì)各種皮膚癬菌均顯示出部分協(xié)同效應(yīng)。酮康唑與特比萘芬聯(lián)用對(duì)白念珠菌和近平滑念珠菌表現(xiàn)為明顯協(xié)同效應(yīng)，對(duì)光滑念珠菌和熱帶念珠菌表現(xiàn)為部分協(xié)同效應(yīng)。酮康唑與萘替芬聯(lián)用對(duì)近平滑念珠菌顯示明顯協(xié)同效應(yīng)，對(duì)白念珠菌、熱帶念珠菌和光滑念珠菌表現(xiàn)為部分協(xié)同作用。酮康唑與特比萘芬或萘替芬聯(lián)用均對(duì)兩種馬拉色菌均表現(xiàn)出明顯協(xié)同效應(yīng)。

3 討 論

近年來(lái)研究表明，單獨(dú)長(zhǎng)期應(yīng)用抗真菌藥物可能導(dǎo)致真菌產(chǎn)生耐藥性[13-14]，而多種不同作用機(jī)理抗真菌藥物聯(lián)合可能通過(guò)增強(qiáng)藥物各自抗菌活性，減少各自用量以及各自不同作用部位藥效累積作用，從而增強(qiáng)療效，同時(shí)減少或延遲耐藥的產(chǎn)生[15-16]。唑類藥物和丙烯胺類藥物分別作用于真菌麥角固醇合成的不同靶點(diǎn)，故聯(lián)用時(shí)可能發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)特比萘芬與唑類藥物聯(lián)用可產(chǎn)生協(xié)同作用[17-20]，但關(guān)于酮康唑與特比萘芬或萘替芬的聯(lián)合體外藥敏研究資料仍然很少。

目前聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)FICI自身解讀存在多種標(biāo)準(zhǔn)，其中對(duì)于協(xié)同和拮抗效應(yīng)的定義較為一致。協(xié)同效應(yīng)為兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)產(chǎn)生的積極相互作用，發(fā)揮大于各自效應(yīng)單純相加所產(chǎn)生的抑制效應(yīng)。拮抗則為兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)產(chǎn)生的消極相互作用，顯著低于藥物單獨(dú)檢測(cè)時(shí)的抑制效應(yīng)。但對(duì)于“無(wú)相互作用”的定義則存在爭(zhēng)議，諸如“相加”“無(wú)關(guān)”“獨(dú)立”和“自主”等仍然被廣泛使用。然而，許多已經(jīng)發(fā)表用于確定抗真菌藥物相互作用的標(biāo)準(zhǔn)過(guò)于寬松，導(dǎo)致協(xié)同或拮抗效應(yīng)的臨床相關(guān)性存在不確定性。除此以外，絕大多數(shù)關(guān)于抗菌劑聯(lián)合效應(yīng)的報(bào)告將無(wú)相互作用分為兩類，即相加和無(wú)關(guān)，則使得相互作用的解釋更為復(fù)雜。當(dāng)聯(lián)合應(yīng)用的效果為所檢測(cè)藥物單獨(dú)效應(yīng)之和時(shí)可定義為相加，而無(wú)關(guān)則表示為聯(lián)合效應(yīng)僅僅表現(xiàn)為兩種藥物中較為有效藥物的效應(yīng)。目前而言，絕大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為在相加和無(wú)關(guān)之間并無(wú)實(shí)質(zhì)性不同，主張當(dāng)FICI值略微高于或低于1.0的理論臨界值時(shí)，實(shí)際上預(yù)示著藥物間并無(wú)相互作用[21]。因此，定義FICI≤0.5為協(xié)同作用，0.54為拮抗作用的解讀標(biāo)準(zhǔn)較為普遍接受。

表1 酮康唑與特比萘芬體外藥敏實(shí)驗(yàn)聯(lián)合效應(yīng)分析

表2 酮康唑與萘替芬體外藥敏實(shí)驗(yàn)聯(lián)合效應(yīng)分析

本研究結(jié)果顯示，對(duì)A標(biāo)準(zhǔn)與B標(biāo)準(zhǔn)而言，酮康唑與特比萘芬或萘替芬聯(lián)合，對(duì)不同菌種的抗菌協(xié)同和拮抗效應(yīng)比例均無(wú)改變，A標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)相互作用比例為B標(biāo)準(zhǔn)中相加與無(wú)關(guān)比例之和；對(duì)于C標(biāo)準(zhǔn)而言，酮康唑與特比萘芬或萘替芬聯(lián)合，對(duì)不同菌種的抗菌拮抗效應(yīng)無(wú)改變，而抗菌協(xié)同效應(yīng)比例較A標(biāo)準(zhǔn)與B標(biāo)準(zhǔn)明顯增加。根據(jù)C標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行解讀則會(huì)明顯擴(kuò)大抗菌協(xié)同效應(yīng)。因此，采用A標(biāo)準(zhǔn)對(duì)抗真菌藥物體外聯(lián)合抗菌效應(yīng)結(jié)果進(jìn)行解讀可能更為合理。

綜上所述，本研究表明不同F(xiàn)ICI解讀標(biāo)準(zhǔn)對(duì)抗真菌藥物體外聯(lián)合抗菌效應(yīng)評(píng)估可產(chǎn)生不同的解讀結(jié)果，定義FICI≤0.5為協(xié)同作用，0.54為拮抗作用的解讀標(biāo)準(zhǔn)，則具有簡(jiǎn)便、一致性好的優(yōu)點(diǎn)，值得臨床采用。

致謝 本研究由西安楊森制藥有限公司贊助。

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Comparision of different interpretation criterions of fractional inhibitory concentration for evaluating theinvitrocombined effect of antifungal agents

WU Wei-wei,WANG Qian,GONG Jie,WAN Zhe,WANG Ai-ping,LI Ruo-yu

(DepartmentofDermatologyandVenereology，PekingUniversityFirstHospital，ResearchCenterforMedicalMycology，PekingUniversity，Beijing100034，China)

Objective To determine the interaction pattern of ketoconazole combined with terbinafine or naftifine,and to evaluate the effects of different interpretation criterions of fractional inhibitory concentration index (FICI) for theinvitrocombined effect of antifungal drugs.Methods According to CLSI M38-A2 and M27-A3,a checkerboard broth microdilution method was performed to investigate theinvitroactivities of ketoconazole in combination with terbinafine or naftifine against 100 clinical strains isolated from patients with mycosis,including dermatophyte,CandidaandMalassezia.Different criterion for the interpretation of fractional inhibitory concentration were employed to evaluate theinvitrocombined effect of ketoconazole in combination with terbinafine or naftifine.Standard A:synergy is defined by FICI≤0.5,antagonism by FICI>4,and no interaction by FICI>0.5,but≤4;Standard B:synergy is defined by FICI≤0.5,additive by FICI>0.5,but≤1,no interaction by FICI>1,but≤2,and antagonism by FICI>2;Standard C:synergy is defined by FICI≤1,additive by FICI=1,no interaction by FICI>1,but≤2,and antagonism by FICI>2.Results Standard A had good consistency with Standard B,Standard C is relatively lenient.According to Standard C,the interpretation might significantly expand the range of synergy.Conclusions The interpretation criterion of fractional inhibitory concentration (Synergy is defined by FICI≤0.5,antagonism by FICI>4,and no interaction by FICI>0.5,but≤4) has the advantage of simplicity,convenience and good consistence,and it is worthy of clinical application.

antifungal agents;combination;susceptibility testing;fractional inhibitory concentration

吳偉偉，男 (漢族)，博士研究生在讀.E-mail:vigorwu@126.com

李若瑜，E-mail:mycolab@126.com

R 978.5

A

1673-3827(2016)11-0085-05

2015-09-08 [本文編輯] 王 飛