孟利強(qiáng)， 沙長青， 張先成， 張淑梅， 趙曉宇， 曹 旭， 李 晶*

(1.黑龍江省科學(xué)院 微生物研究所 生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150010；2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，黑龍江 哈爾濱 150020；3.黑龍江省科學(xué)院 條件財(cái)務(wù)處，黑龍江 哈爾濱 150001)

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粘質(zhì)沙雷氏菌幾丁質(zhì)酶基因ChiA克隆及生物信息學(xué)分析

孟利強(qiáng)1,2， 沙長青1,3， 張先成1， 張淑梅1,2， 趙曉宇1,2， 曹 旭1,2， 李 晶1,2*

(1.黑龍江省科學(xué)院 微生物研究所 生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150010；2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，黑龍江 哈爾濱 150020；3.黑龍江省科學(xué)院 條件財(cái)務(wù)處，黑龍江 哈爾濱 150001)

通過生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)ChiA基因序列進(jìn)行分析預(yù)測，了解ChiA的基因結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)性質(zhì)。從自有菌株(粘質(zhì)沙雷氏菌SerratiamareescensS68)中克隆到幾丁質(zhì)酶基因ChiA，利用相關(guān)軟件對(duì)ChiA基因序列進(jìn)行分析預(yù)測。ChiA基因全長1 714 bp，開放閱讀框編碼563個(gè)氨基酸，推測其編碼的蛋白質(zhì)分子量為60 983.8 Da，等電點(diǎn)為6.35，是一種穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)。預(yù)測ChiA可能存在信號(hào)肽，切割位點(diǎn)在第23～24位氨基酸之間，1～23位氨基酸為其跨膜結(jié)構(gòu)，其余肽鏈位于細(xì)胞外。ChiA主要存在3種二級(jí)結(jié)構(gòu)元件，在二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)中都有體現(xiàn)。該ChiA是一種水溶性蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且可以分泌到胞外。

粘質(zhì)沙雷氏菌；幾丁質(zhì)酶；基因克??；生物信息學(xué)

幾丁質(zhì)(chitin)又稱甲殼素，是由N-乙酰-2-脫氧-D-葡萄糖聚合而成的大分子多糖，廣泛存在于自然界藻類、細(xì)菌、放線菌等體內(nèi)的多聚物，是僅次于纖維素居第二位的可再生資源[1]。幾丁質(zhì)酶(chitinase)可以催化水解幾丁質(zhì)的β-1,4糖苷鍵生成幾丁寡糖和N-乙酰-氨基葡萄糖，是非常重要的保健品和醫(yī)療原材料[2]。粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)是一種可以產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的菌株，早在1986年，Jone等[3]就克隆到了粘質(zhì)沙雷氏菌的ChiA和ChiB基因，并測定了全序列。1999年，Tanaka等[4]從濕熱古細(xì)菌ThermococcuskodakaraensisKOD1中克隆到了幾丁質(zhì)酶基因ChiA。國內(nèi)對(duì)微生物幾丁質(zhì)酶學(xué)的研究比較晚，2003年，張表等[5]構(gòu)建了含有ChiA基因的克隆載體，并完成測序和序列分析。本研究所用菌株粘質(zhì)沙雷氏菌S68為本研究室自有菌株，具有較強(qiáng)的幾丁質(zhì)酶活性。通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)引物，克隆到目的基因ChiA，并對(duì)其幾丁質(zhì)酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為了解微生物幾丁質(zhì)酶系及構(gòu)建高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶工程菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)由本研究室保藏，菌株編號(hào)S68;克隆載體pZeroback/ blunt vector及感受態(tài)細(xì)胞DH5α(140326)購于天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 分析比對(duì)GenBank中10個(gè)Serratiamarcescens的ChiA 基因序列，在其共同保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物：上游引物：5′-GGAATTCATGCGCAAATTTAATAAACCG-3′；下游引物：5′-CCCAAGCTTAACCGATTATTGAACGCCG-3′。PCR反應(yīng)體系(25μL)：模板DNA 1 μL，上下游引物各 1 μL，2×PCR Master Mix (TIANGEN) 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，66.2 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.2.2ChiA 基因克隆與序列測定分析 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳、純化、連接、轉(zhuǎn)化及陽性克隆子的篩選均參照文獻(xiàn)[6]。陽性克隆子由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司完成測序，將測得基因序列提交GenBank進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。

1.2.3ChiA 基因生物信息學(xué)分析 選用ProtParam軟件分析ChiA 的氨基酸組成、序列、分子量及等電點(diǎn)，用ProtScale軟件分析其疏水性，ChiA 信號(hào)肽的查找和細(xì)胞定位分別由SignalP 4.1和TMHMM v. 2.0完成，ChiA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分別由Psipred v3.3和Phyre2完成，ChiA 的進(jìn)化分類由Prosite完成，本研究涉及軟件的生物信息學(xué)網(wǎng)站見表1[7]。

表1 生物信息學(xué)軟件網(wǎng)站

2 結(jié)果與分析

2.1ChiA基因克隆和序列分析

ChiA 基因PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測為單一條帶，分子量在1 700 bp左右，符合目的片段的大小(圖1)。將單一條帶回收、連接、轉(zhuǎn)化得到陽性克隆子，并委托三博遠(yuǎn)志測序，得到ChiA 基因核苷酸序列(GenBank accession number KP065496)如圖2。序列全長1 714 bp，用ORF Finder 軟件分析，得到1條1 692 bp的開放閱讀框(圖3)，起始密碼子ATG位于第8位置，終止密碼子TAA位于1699位置，共編碼563個(gè)氨基酸。

圖1 ChiA基因PCR產(chǎn)物電泳

圖2 ChiA基因核苷酸序列Fig.2 Nucleotide sequence of ChiA gene

圖3 ChiA基因核苷酸開放閱讀框分析Fig.3 AnaJysis of open reading frame of ChiA

將ChiA基因序列提交NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因序列與GenBank中登錄號(hào)為DQ990373.1的S.marcescensChiA 基因高度相似，同源性達(dá)99%以上，兩者僅在196、649、1037和1486位置的4個(gè)核苷酸堿基不同(加粗標(biāo)記)，由于氨基酸密碼子的兼并性，二者對(duì)應(yīng)的氨基酸序列僅344位置不同，由GenBank中的Thr(T)變成了Ala(A)。2個(gè)氨基酸都屬于帶有極性的中性氨基酸，不會(huì)造成ChiA 的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變[8]。

2.2ChiA理化性質(zhì)分析

ChiA基因包含一個(gè)全長1 692 bp的完整閱讀框，編碼563個(gè)氨基酸(圖4)，用ProtParam軟件對(duì)其進(jìn)行分析，分子量為60 983.8 Da，等電點(diǎn)為6.35，分子式為C2739H4205N727O822S16。如圖5所示，ChiA中含量比較多的氨基酸有甘氨酸Gly(61,10.8%)、丙氨酸Ala(55,9.8%)、亮氨酸Leu(45,8%)及賴氨酸Lys(42,7.5%)，含量最少的為半胱氨酸Cys(5,0.9%)。總的帶負(fù)電荷的氨基酸(Asp+Glu)為56，總的帶正電荷的氨基酸(Arg+Lys)為54。在體外環(huán)境下ChiA的半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為15.33(小于40)，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)。疏水性分析由ProtScale軟件完成，如圖6所示，ChiA疏水性分析第12和13分值最高為2.178，疏水性最強(qiáng)，第151位的脯氨酸Pro分值最低為-3.178，親水性最強(qiáng)。計(jì)算ChiA的平均疏水性指數(shù)為-0.282，此外由疏水性分析曲線也可以看出，基準(zhǔn)線(0)的下半部分曲線部分明顯多于上半部分，所以預(yù)測ChiA為水溶性蛋白質(zhì)[9]。

圖4 ChiA氨基酸序列Fig.4 Amino acid sequence of ChiA gene

圖5 ChiA氨基酸組成及比例Fig.5 Composition and proportion of amino acid of ChiA

圖6 ChiA疏水性分析Fig.6 AnaJysis of hydmphobicity for ChiA

2.3ChiA信號(hào)肽分析及細(xì)胞定位

信號(hào)肽是位于分泌蛋白N端的一段氨基酸序列，將蛋白質(zhì)導(dǎo)向細(xì)胞的正確位置，之后在信號(hào)肽酶的作用下被切除[10]。用SignalP 4.1對(duì)ChiA信號(hào)肽進(jìn)行分析，結(jié)果如圖7，ChiA中可能存在信號(hào)肽，并且信號(hào)肽切割位點(diǎn)在23～24之間(AQA～AA)，信號(hào)肽存在的可能性為0.846，推測ChiA為一種分泌蛋白。

圖7 ChiA信號(hào)肽分析Fig.7 Analysis of signal peptide for ChiA

分泌蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)對(duì)其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞識(shí)別及最終的細(xì)胞定位均具有重要的作用[11]，通過TMHMM v. 2.0對(duì)ChiA分析發(fā)現(xiàn)在1～23之間存在一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)(圖8)，其余整條肽鏈都位于胞外，這與信號(hào)肽預(yù)測結(jié)果相吻合，推測ChiA的信號(hào)肽是具有疏水性的跨膜區(qū)，最終將ChiA分泌到胞外。

圖8 ChiA跨膜結(jié)構(gòu)域分析Fig.8 Analysis of trans-membrane segments for ChiA

2.4ChiA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白質(zhì)分子的多肽鏈(一級(jí)結(jié)構(gòu))通常會(huì)以多種二級(jí)結(jié)構(gòu)折疊、盤曲和延伸成特有的空間構(gòu)象，并具有自身的理化性質(zhì)和生物學(xué)活性，因此蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析和預(yù)測對(duì)其空間構(gòu)象的了解具有重要意義[12-13]。應(yīng)用SOPMA軟件對(duì)ChiA的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如圖9，ChiA二級(jí)結(jié)構(gòu)中共包含4種結(jié)構(gòu)元件：α螺旋、延伸連、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲，其中無規(guī)則卷曲、α螺旋及延伸連是ChiA的主要結(jié)構(gòu)元件，分別占36.94%、27.89%和24.33%，而β轉(zhuǎn)角所占比例最少僅為10.83%。

2.5ChiA三級(jí)結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域分析

應(yīng)用Phyre2軟件對(duì)ChiA的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，如圖10所示，ChiA主要由無規(guī)則卷曲、α螺旋及延伸連組成，這和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符。通過搜索Prosite家族數(shù)據(jù)庫，ChiA含有1條Chitinase 18保守結(jié)構(gòu)域(307～315)，屬于幾丁質(zhì)酶18基因家族。

圖9 ChiA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測線性圖Fig.9 Linear map of secondary structure prediction for ChiA豎線長度(由長到短)分別表示：α螺旋、延伸連、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲Length of vertical (from long to short) respectively: helix, strand, angle, coil

圖10 ChiA三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.10 Tertiary structure of ChiA

3 討 論

本研究從菌株粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens) S68克隆到幾丁質(zhì)酶基因ChiA，該基因全長1 714 bp，有1個(gè)1 692 bp的開放閱讀框，編碼563個(gè)氨基酸，這與張表等[5]報(bào)道的ChiA大小一致。該基因序列與GenBank中登錄號(hào)為DQ990373.1的S.marcescensChiA基因高度相似(99%)，僅有4個(gè)堿基發(fā)生突變，最終導(dǎo)致了1個(gè)氨基酸的突變(Thr-Ala)。但由于這2個(gè)氨基酸都屬于帶有極性的中性氨基酸，不會(huì)造成ChiA的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。通過一級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)ChiA中含量較高的氨基酸有甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和賴氨酸，半胱氨酸含量最少，分子式為C2739H4205N727O822S16，分子量為60 983.8 Da，等電點(diǎn)為6.35。此外，ChiA的不穩(wěn)定指數(shù)和平均疏水性指數(shù)分別為15.33和-0.282，說明它屬于水溶性的穩(wěn)定蛋白質(zhì)。通過蛋白質(zhì)預(yù)測軟件分析發(fā)現(xiàn)，ChiA可能是一種分泌蛋白，并且存在一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)。ChiA的二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符[14-15]。本研究首次對(duì)自有菌株粘質(zhì)沙雷氏菌S68的幾丁質(zhì)酶基因ChiA進(jìn)行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)預(yù)測，對(duì)幾丁質(zhì)酶ChiA的各級(jí)結(jié)構(gòu)有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，這將為該菌及幾丁質(zhì)酶的研究和應(yīng)用，如幾丁質(zhì)酶的克隆表達(dá)體系的建立及定向進(jìn)化的研究等方面提供參考。

[1] Dutta J,Tripathi S,Dutta P K,et al.Progress in antimicrobial activities of chitin, chitosan and its oligosaccharides: a systematic study needs for food applications[J].Food Science and Technology International,2012,18(1):3-34.

[2] 李春霞,佟永薇,侯世潔,等.微生物幾丁質(zhì)酶的研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā),2008,29(8):155-157.

[3] Jones J D G, Grady K L, Suslow T V, et al. Isolation and characterization of genes encoding two chitinage enzymes fromSerratiamarcescens[J].EMBOJ,1986,5(3):467-473.

[4] Tanaka T,Fukui T,Imanaka T,et al.Different cleavage specificities of the dual catalytic domains in chitinase from the hyperthermophilic archaeonThermococcuskodakaraensisKOD1[J].The Journal of Biological Chemistry,2001,276(38):35629-35635.

[5] 張表,趙曉瑜,喬環(huán)宇，等.粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)幾丁質(zhì)酶基因克隆的篩選及序列分析[J].河北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2003,23(2):184-187.

[6] Sambrook J, Fritsh E F, Maniat is T. Molecular cloning: a laboratory manual[M].New York, Cold Spring Harbor Laboratory,1989.

[7] 徐建華,朱家勇.生物信息學(xué)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測中的應(yīng)用[J].醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志,2005,2(3):227-232.

[8] 張久敏.例析基因突變與性狀的關(guān)系[J].試題與研究：新課程論壇, 2012，(13):69-69.

[9] 魏巍,賀淹才,方柏山，等.粘質(zhì)沙雷氏菌幾丁質(zhì)酶(ChiC)基因克隆及其生物信息學(xué)分析[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,28(3):444-448.

[10]Chen W.B,Nie Y,Xu Y，et al.Signal peptide-independent secretory expression and characterization of pullulanase from a newly isolatedKlebsiellavariicolashn-1 inEscherichiacoli[J].Applied Biochemistry and Biotechnology. Part A, enzyme engineering and biotechnology,2013,169(1):41-54.

[11]邱建丁,梁汝萍,譚學(xué)才,等.膜蛋白跨膜區(qū)段的預(yù)測分析[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào),2004,25(5):831-836.

[12]Osadchy M,Kolodny R.Maps of protein structure space reveal a fundamental relationship between protein structure and function[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2011,108(30):12301-2306.

[13]葉輝,程備久,朱蘇文,等.粘質(zhì)沙雷氏菌幾丁質(zhì)酶chiB基因的克隆與序列分析[J].激光生物學(xué)報(bào),2007,16(3):299-303.

[14]Watanabe T, Kimura K, Sumiya T, et al. Genetic analysis of the chitinase system ofSerratiamarcescens2170[J]. J. Bacteriol.,1997，(179):7111-7117.

[15]Francesco M,Sushmita M.Natural computing methods in bioinformatics: A survey[J].Information Fusion,2009,10(3):211-216.

Cloning & Bioinformatics Analysis of Chitinase Gene ChiA from Serratia marcescens

MENG Li-qiang1, 2, SHA Chang-qing1, 3, ZHANG Xian-cheng1, ZHANG Shu-mei1, 2,ZHAO Xiao-yu1, 2, CAO Xu1, 2, LI Jing1,2

(1.KeyLab.ofBiotech.,Inst.ofMicrobiol.ofHeilongjiangAcad.ofSci.,Harbin150010;2.Inst.ofAdvancedTechnol.,HeilongjiangAcad.ofSci.,Harbin150020;3.ConditionandFinancialDiv.,HeilongjiangAcad.ofSci.,Harbin150001)

In order to learn the structure of chitinase gene (ChiA) and the protein properties ofChiA, the sequence ofChiA was analyzed and predicted by bioinformatics techniques.ChiA was cloned fromSerratiamarcescensstrain 41003, its sequence was analyzed and predicted by bioinformatics software. The results showed that the length ofChiA was 1 714 bp having an open reading frame encoding 563 amino acids inferring their encoded protein molecular weight at 60 983.8 Da with isoelectric point at 6.35, it was a stable hydrophilic protein. It was predicted that it might exist a signal peptide inChiA with its cutting site between 23rd to 24th amino acid. 1st to 23rd amino acid might be the transmembrane construction and the rest peptide chains located outside the cell.ChiA mainly existed three kinds of secondary structure elements, which embodied in both secondary structure and tertiary structure. Therefore,ChiA was a hydrosoluble protein with stable structure and could be secreted outside the cell.

Serratiamarcescens; chitinase gene; gene cloning; bioinformatics

黑龍江省科學(xué)院學(xué)科團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新能力提升專項(xiàng)(2014ws09)

孟利強(qiáng) 男，副研究員，碩士。研究方向?yàn)槲⑸镔Y源及基因工程。E-mail：mengliqiang83420@163.com

* 通訊作者。女，研究員，博士。主要研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)微生物及分子生物學(xué)。E-mail：lj0706@sohu.com

2014-11-06；

2015-01-02

Q781

A

1005-7021(2016)01-0062-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.01.011