比索洛爾聯(lián)合培哚普利對阿霉素誘導(dǎo)的心力衰竭大鼠心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

吳錦波， 葉小漢， 冼紹祥， 董明國

(1 廣州中醫(yī)藥大學博士后流動站，廣東 廣州 510405； 2東莞市中醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 東莞 523000；3廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510405)

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比索洛爾聯(lián)合培哚普利對阿霉素誘導(dǎo)的心力衰竭大鼠心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

吳錦波1, 2△， 葉小漢2， 冼紹祥3， 董明國2

(1廣州中醫(yī)藥大學博士后流動站，廣東 廣州 510405；2東莞市中醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 東莞 523000；3廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510405)

目的： 探討比索洛爾聯(lián)合培哚普利對心力衰竭大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響。方法:采用阿霉素腹腔注射法建立大鼠心力衰竭模型，隨機分為正常對照組、假手術(shù)組、模型組、比索洛爾組、培哚普利組和比索洛爾+培哚普利治療組，按分組設(shè)置分別以蒸餾水、比索洛爾、培哚普利和比索洛爾+培哚普利連續(xù)灌胃35 d。觀察大鼠心功能指標，ELISA法檢測血漿腦鈉肽水平，TUNEL法檢測心肌細胞凋亡并計算凋亡指數(shù)，Western blot法檢測心肌GRP78、CHOP、SERCA2a、JNK和caspase-12表達水平。結(jié)果:與正常對照組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠心輸出量、左室短軸縮短率和射血分數(shù)顯著降低，心肌細胞凋亡指數(shù)顯著升高，心肌SERCA2a表達顯著降低，GRP78、CHOP、JNK和caspase-12表達顯著升高(P<0．01)。與模型組比較，比索洛爾治療組、培哚普利治療組和比索洛爾+培哚普利治療組大鼠心輸出量、左室短軸縮短率和射血分數(shù)顯著升高，心肌細胞凋亡指數(shù)顯著降低，SERCA2a表達顯著升高，GRP78、CHOP、JNK和caspase-12表達顯著降低(P<0．05)；除JNK外，比索洛爾+培哚普利治療組的其余各個指標與比索洛爾組和培哚普利組比較均有顯著差異(P<0．05)。結(jié)論:比索洛爾聯(lián)合培哚普利可以明顯改善阿霉素誘導(dǎo)的心力衰竭大鼠的心功能，兩藥合用效果更顯著，機制可能與下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白表達，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平，減少心肌細胞凋亡有關(guān)。

比索洛爾； 培哚普利； 心力衰竭； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激； 細胞凋亡

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是多種心血管疾病的終末期表現(xiàn)，隨著人口老齡化，CHF的患病人數(shù)不斷增加；雖然醫(yī)學發(fā)展改善了CHF患者的預(yù)后，但其5年病死率仍高達50%[1]。動物實驗和人體研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)啟動細胞凋亡參與CHF的病理生理過程[2]。氧化應(yīng)激、缺血、鈣穩(wěn)態(tài)失衡等各種刺激因素均可導(dǎo)致ERS，適度的ERS是細胞的一種自我保護性機制，可以修復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)；而持續(xù)或嚴重的ERS則可誘導(dǎo)C/EBP同源蛋白 (C/EBP homologous protein，CHOP) 、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(caspase-12)等促凋亡因子的表達和活化，介導(dǎo)心肌細胞凋亡[3-5]。肌漿網(wǎng)鈣ATP酶2a (sarcoplasmic reticulum calcium ATPase 2a，SERCA2a)的表達水平和活性降低可以導(dǎo)致鈣穩(wěn)態(tài)失衡而引發(fā)ERS[6]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (glucose-regulated protein 78，GRP78) 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的感受器，是ERS的標志性蛋白[3]。

β-腎上腺素受體(β-adrenergic receptor，β-AR)阻滯劑可以上調(diào)衰竭心臟β1-AR密度并恢復(fù)其正常功能，改善心功能，提高左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)[7]；β受體阻滯劑還可以使衰竭心臟SERCA2a的蛋白水平和活性正?；?，恢復(fù)鈣穩(wěn)態(tài)，減輕ERS，改善心功能[6]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin-converting enzyme inhibitors，ACEIs)可以降低腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)活性，減少血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)的生成，抑制心肌重構(gòu)，改善心功能。其中，培哚普利在改善心功能的同時，可以降低GRP78和caspase-12的表達，提示培哚普利可以阻斷ERS，保護心肌細胞[8]。β受體阻滯劑和ACEIs常聯(lián)合應(yīng)用，已經(jīng)成為治療CHF的基石[7]。然而，比索洛爾聯(lián)合培哚普利對阿霉素引起的心功能障礙有何影響？尚缺乏研究。 本實驗通過阿霉素腹腔注射法建立大鼠CHF模型，觀察比索洛爾聯(lián)合培哚普利治療對阿霉素誘導(dǎo)的心功能障礙大鼠的心功能和ERS的影響，探討比索洛爾聯(lián)合培哚普利治療阿霉素性CHF的分子機制。

材 料 和 方 法

1 實驗動物和藥物

健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠80只，平均體質(zhì)量(230±20)g，由廣州中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供[動物許可證號：SCXK(粵)2013-0020；動物合格證號：No.440059000]。SPF級凈化空間，生長條件為12 h/12 h光照周期，溫度(22±3) ℃，相對濕度(40～70)%，自由攝食、飲水。動物飼養(yǎng)及動物實驗方案遵循國家《實驗動物管理條例》和廣州中醫(yī)藥大學倫理委員會動物實驗規(guī)范。

比索洛爾(Merck Serono)189 mg加無菌蒸餾水2 100 mL，制成濃度為0.09 g/L的溶液，灌胃劑量為0.9 mg·kg-1·d-1。

培哚普利[施維雅(天津)制藥有限公司]151.2 mg加無菌蒸餾水2 100 mL，制成濃度為0.072 g/L的溶液，灌胃劑量為0.72 mg·kg-1·d-1。

阿霉素(Medchemexpress LLC)；氯胺酮(福建古田藥業(yè))；地西泮(天津金耀藥業(yè))。

2 試劑和儀器

大鼠腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP) ELISA 試劑盒購自RayBiotech.Inc.。TUNEL試劑盒購自Roche；二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色試劑盒購自博士德生物技術(shù)有限公司。二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白濃度測定試劑盒由碧云天生物技術(shù)研究所提供；GRP78抗體、CHOP抗體、JNK抗體、caspase-12、SERCA2a抗體和β-actin抗體均購自Santa Cruz；GAPDH由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供；辣根過氧化物酶抗體購自Jackson。增強化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence, ECL)試劑盒購自Millipore。HP5500心臟超聲儀(HP)；GDS7600凝膠掃描系統(tǒng)(UVP)。

3 動物造模及分組

雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用阿霉素腹腔注射法(用滅菌注射用水溶解成0.25 g/L溶液,每次注射劑量為2.5 mg/kg，2周內(nèi)分6次注射，總劑量15 mg/kg)建立CHF大鼠模型。首次腹腔注射5周后應(yīng)用心臟超聲儀檢測并計算左室短軸縮短率(fractional shortening,FS)，以心腔擴大，F(xiàn)S<30%作為CHF成模標準[9]。80只大鼠分別隨機選取10只作為正常對照組，10只作為假手術(shù)組，假手術(shù)組腹腔注射10 mL/kg的生理鹽水。剩余60只大鼠用于造模，將成功造模大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為4組：模型組、比索洛爾組、培哚普利組和比索洛爾+培哚普利組，分別以比索洛爾(0.9 mg·kg-1·d-1)、培哚普利(0.72 mg·kg-1·d-1)和比索洛爾(0.9 mg·kg-1·d-1)+培哚普利(0.72 mg·kg-1·d-1)灌胃，每天1 次，連續(xù)35 d；其余各組以10 mL/kg的蒸餾水灌胃。

4 大鼠心功能指標檢測

干預(yù)前后采用腹腔注射氯胺酮(50 mg/kg)和地西泮(5 mg/kg)混合麻醉大鼠，胸前剃毛，大鼠取仰臥位，固定在木板上，應(yīng)用心臟超聲儀，分別測量左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)和左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter，LVESD)，計算FS、心輸出量(cardiac output, CO)和左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)。

5 ELISA法檢測血漿BNP水平

處死大鼠時腹主動脈取血，肝素抗凝，靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，取上清-20 ℃冰箱保存，按試劑盒說明書進行操作。

6 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡

大鼠超聲心動圖檢測結(jié)束后，立即注射2 mmol/L的KCl，使大鼠心臟停搏在舒張末期，迅速開胸離斷心臟，PBS沖洗干凈后，石蠟包埋、切片，5% BSA封閉30 min，加TUNEL反應(yīng)混合液37 ℃ 1 h，加Converter-POD反應(yīng)液37℃ 30 min，DAB顯色液室溫反應(yīng)約10 min，透明封片，鏡檢顯示凋亡的心肌細胞核呈棕黃色。計算凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)，AI=凋亡陽性細胞數(shù)目/總細胞數(shù)目，每張切片觀察6個視野求均值。

7 Western blot 檢測心肌細胞的蛋白表達水平

取100 mg心肌組織，加入裂解液，冰上裂解1h，提取細胞內(nèi)蛋白，用BCA法進行蛋白定量。取各組蛋白樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后用牛血清蛋白封閉，經(jīng)Ⅰ抗結(jié)合后洗膜，Ⅱ抗結(jié)合，洗膜后采用ECL 法顯色，軟件分析。并分別以GRP78、CHOP、JNK和caspase-12的平均灰度值與相應(yīng)內(nèi)參照蛋白GAPDH的平均灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量，SERCA2a平均灰度值與相應(yīng)內(nèi)參照蛋白β-actin的平均灰度值的比值表示蛋白的相對表達量。

8 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析，多組間比較采用單因素方差(one-way ANOVA)分析， LSD法進行組間兩兩比較，率的比較采用χ2檢驗，以P<0．05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 一般情況

采用阿霉素腹腔注射法造模共60只，造模過程中有15只大鼠死于嚴重心力衰竭和肝硬化腹水，死亡率為25%；FS不達標5只，成模率為67%。40只成功造模大鼠按隨機數(shù)字表法分成4組：模型組、比索洛爾組、培哚普利組和比索洛爾+培哚普利組，每組10只，在隨后的實驗干預(yù)中，每組各有1只大鼠因灌胃不當而死亡。CHF大鼠出現(xiàn)不同程度的食欲減退、精神較差、張口呼吸和乏力等癥狀。模型組、比索洛爾組、培哚普利組和比索洛爾+培哚普利組術(shù)后體重分別為(325.0+50.8)g、(338.6±57.4)g、(340.9±52.6)g和(332.7±68.5)g，均明顯低于正常對照組的(443.2±69.3)g和假手術(shù)組的(444.7±44.5)g (P<0．01)；術(shù)后5周內(nèi)模型組、比索洛爾組、培哚普利組和比索洛爾+培哚普利組大鼠體重有不同程度回升，分別為(343.5±86.1)g、(475.2±32.7)g、(478.8±25.8)g和(481.3+26.5)g，后3組明顯高于模型組(P<0．01)。

2 大鼠心功能指標

干預(yù)后，模型組FS、CO和LVEF明顯低于正常對照組和假手術(shù)組(P<0．01)；比索洛爾組、培哚普利組和比索洛爾+培哚普利組FS、CO和LVEF明顯高于模型組(P<0．01)，比索洛爾+培哚普利組明顯高于比索洛爾組和培哚普利組(P<0．05)，見表1。

3 血漿BNP水平

模型組血漿BNP水平顯著高于正常對照組和假手術(shù)組(P<0．01)，比索洛爾組、培哚普利組和比索洛爾+培哚普利組顯著低于模型組(P<0．01)，比索洛爾+培哚普利組明顯低于比索洛爾組和培哚普利組(P<0．05)，見表1。

表1 大鼠心功能指標與血漿BNP水平

4 心肌細胞凋亡

光鏡下觀察，凋亡細胞核呈棕黃色，見圖1。模型組心肌細胞凋亡指數(shù)顯著高于正常對照組和假手術(shù)組(P<0.01)；比索洛爾組、培哚普利組和比索洛爾+培哚普利組顯著低于模型組(P<0.01)，比索洛爾+培哚普利組顯著低于比索洛爾組和培哚普利組(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.Apoptosis of cardiomyocytes of rats in different groups (TUNEL staining,×400).

圖1 各組大鼠心肌細胞凋亡情況

5 大鼠心肌細胞的蛋白表達水平

模型組GRP78、CHOP、JNK和caspase-12的蛋白表達水平顯著高于正常對照組和假手術(shù)組(P<0.01)，比索洛爾組、培哚普利組和比索洛爾+培哚普利組顯著低于模型組(P<0.05)。比索洛爾+培哚普利組GRP78、CHOP和caspase-12的蛋白表達水平顯著低于比索洛爾組和培哚普利組(P<0.05)。模型組SERCA2a的蛋白表達水平顯著低于正常對照組和假手術(shù)組(P<0.01)，比索洛爾組、培哚普利組和比索洛爾+培哚普利組顯著高于模型組(P<0.01)，比索洛爾+培哚普利組顯著高于比索洛爾組和培哚普利組(P<0.05)，見圖2～4。

討 論

CHF以其龐大的患病人數(shù)、沉重的社會經(jīng)濟負擔和居高不下的死亡率，成為全球性的公共衛(wèi)生問題。受益于循證醫(yī)學的發(fā)展和大規(guī)模臨床試驗的開展，CHF的治療方案得到不斷優(yōu)化。CHF的現(xiàn)有治療方法，包括β受體阻滯劑和ACEIs/血管緊張素受體阻滯劑、醛固酮拮抗劑，可以明顯改善心功能、提高生活質(zhì)量、減少住院時間、改善預(yù)后，降低死亡率。然而，CHF的發(fā)病率卻有增無減，這與人口老齡化加劇，多種類型的心血管疾病最終演變成CHF有關(guān)[1]。神經(jīng)內(nèi)分泌過度激活和細胞凋亡是CHF的2個關(guān)鍵過程，它們共同參與的病理性心肌重構(gòu)是CHF的主要病理生理機制；抑制神經(jīng)內(nèi)分泌過度激活和細胞凋亡是有效預(yù)防和治療CHF的基礎(chǔ)[7]。β受體阻滯劑和ACEIs聯(lián)合應(yīng)用既可以阻斷CHF患者神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的過度激活，又可以減輕ERS介導(dǎo)的細胞凋亡，已成為CHF的常規(guī)治療手段，但其具體分子機制仍未完全明確。

Figure 2.Relative expression of GRP78 and CHOP in the myocardium of rats. Mean±SD.n=9～10.*P<0.05,**P<0.01vssham；#P<0.05,##P<0.01vsDOX；△P<0.05vsDOX+Bis+Per.

圖2 大鼠心肌細胞GRP78和CHOP的相對表達水平

Figure 3.Relative expression of caspase-12 and JNK in the myocardium of rats. Mean±SD.n=9～10.**P<0.01vssham；#P<0.05,##P<0.01vsDOX；△P<0.05vsDOX+Bis+Per.

圖3 大鼠心肌細胞caspase-12和JNK的相對表達水平

Figure 4.Relative expression of SERCA2a in the myocardium of rats. Mean±SD.n=9～10.**P<0.01vssham；##P<0.01vsDOX；△P<0.05vsDOX+Bis+Per.

圖4 大鼠心肌細胞SERCA2a的相對表達水平

衰竭心臟中SERCA2a的含量和/或活性降低使肌漿網(wǎng)攝取Ca2+減少[10]，導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣超載，鈣穩(wěn)態(tài)失衡可引發(fā)ERS。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生是CHF的一個突出組織學表現(xiàn)，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負荷；衰竭心臟中的氧化應(yīng)激、缺氧、蛋白質(zhì)合成增加都可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡，誘發(fā)或加重ERS[11]。ERS通過CHOP、JNK和caspase-12途徑誘發(fā)細胞凋亡[12]。在CHF早期，心肌細胞凋亡輕度增加，隨著時間推移，累計的細胞凋亡導(dǎo)致心肌細胞顯著減少，促進心肌重構(gòu)[13]，使心功能進一步惡化。研究顯示，在終末期心肌病心衰患者的心臟中每100萬個心肌細胞就有673～6 549個細胞核中出現(xiàn)了凋亡現(xiàn)象,平均是正常心臟的232倍[14]。減輕ERS可以抗凋亡，能減輕或逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)，改善心功能[15]。

本實驗通過阿霉素腹腔注射法建立大鼠CHF模型，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠心肌SERCA2a蛋白含量降低，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙；GRP78升高提示發(fā)生了ERS，ERS的發(fā)生與SERCA2a的降低相關(guān)；雖然SERCA2a降低不是破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)和誘發(fā)ERS的唯一因素，但是可以推斷，ERS的發(fā)生至少部分歸因于SERCA2a的降低。本實驗中，模型組大鼠心肌細胞凋亡明顯增加，可能是大鼠心功能惡化的重要原因。另外，大鼠心肌CHOP、JNK和caspase-12升高提示這3條細胞凋亡信號通路均被激活，均參與介導(dǎo)心肌細胞凋亡；其中，caspase-12僅特異性地與ERS相關(guān)，與非ERS介導(dǎo)的細胞凋亡無關(guān)[16]，更顯示出ERS在細胞凋亡和CHF發(fā)生發(fā)展過程中的重要性。本實驗中，比索洛爾和培哚普利均可以提高心肌SERCA2a蛋白含量，降低GRP78、CHOP、JNK和caspase-12水平，提示比索洛爾和培哚普利可以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，減輕ERS，減輕心肌細胞凋亡，改善心功能；其中，比索洛爾聯(lián)合培哚普利的抗ERS、抗凋亡作用效果最強。本實驗提示：SERCA2a、CHOP、JNK和caspase-12均參與了ERS和心肌細胞凋亡過程，比索洛爾和培哚普利的干預(yù)可以調(diào)控這幾種蛋白的表達，減輕ERS和心肌細胞凋亡。這也許是比索洛爾和培哚普利改善CHF患者心功能的一種分子機制。

此外，本實驗使用動物樣本量少，而且是小動物，只針對阿霉素誘導(dǎo)的特定心衰模型，比索洛爾和培哚普利的效應(yīng)及其治療心衰的分子機制有待大規(guī)模的動物實驗和臨床試驗來進一步驗證和解答。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effects of bisoprolol plus peridopril on myocardial endoplasmic reticulum stress in rats with doxorubicin-induced heart failure

WU Jin-bo1, 2, YE Xiao-han2, XIAN Shao-xiang3, DONG Ming-guo2

(1PostdoctoralResearchStation,GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510405,China;2DepartmentofCardiology,DongguanHospitalofTraditionalChineseMedicine,Dongguan523000,China;3DepartmentofCardiology,TheFirstClinicalMedicalHospital，GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510405,China.E-mail：wujinbocn@163.com)

AIM: To investigate the effects of bisoprolol (Bis) plus peridopril (Per) on myocardial endoplasmic reticulum stress (ERS) in rats with heart failure．METHODS: Male SD rats were randomly divided into normal control group, sham group, doxorubicin (DOX) group, bisoprolol treatment group (DOX+Bis group), peridopril treatment group (DOX+Per group) and bisoprolol plus peridopril treatment group (DOX+Bis+Per group). A rat model of heart failure was induced by intraperitoneal injection of DOX. Distilled water, bisoprolol, peridopril, and bisoprolol plus peridopril were administrated by gastric gavage for 35 d, respectively. The indexes of cardiac functions and plasma levels of brain natriuretic peptide (BNP) were measured, myocardial apoptosis was analyzed by TUNEL assay and myocardial protein expression of GRP78, CHOP, JNK, caspase-12 and SERCA2a was detected by Western blot.RESULTS: Compared with normal control group and sham group, cardiac output (CO), left ventricular fractional shortening (FS), and left ventricular ejection fraction (EF) of the rats in DOX group decreased significantly (P<0．01), the cardiomyocyte apoptotic index increased significantly (P<0．01), the myocardial protein levels of SERCA2a decreased significantly, and GRP78, CHOP, JNK and caspase-12 increased significantly (P<0.01). Compared with DOX group, CO, FS and EF of the rats in DOX+Bis group, DOX+Per group and DOX+Bis+Per group increased significantly (P<0．01), cardiomyocytes apoptotic indexes in DOX+Bis group, DOX+Per group and DOX+Bis+Per group decreased significantly (P<0．01), myocardial protein levels of SERCA2a in DOX+Bis group, DOX+Per group and DOX+Bis+Per group increased significantly, while GRP78, CHOP, SERCA2a, JNK and caspase-12 decreased significantly (P<0．05). Indicators except JNK in DOX+Bis+Per group were changed more significantly than those in DOX+Bis group or DOX+Per group (P<0．05). CONCLUSION: Bisoprolol plus peridopril therapy improves cardiac functions in a rat model of doxorubicin-induced heart failure with more significant effectiveness than using bisoprolol or peridopril alone, which may be related to inhibition of myocardial ERS and apoptosis.

Bisoprolol; Peridopril; Heart failure; Endoplasmic reticulum stress; Apoptosis

1000- 4718(2016)11- 1939- 06

2016- 08- 17

2016- 09- 02

541.6

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.004

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