蘇 悟 鄭小芬 徐睿烜 蔣立文 郭 華 周建平

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院1，長(zhǎng)沙 410128)

(食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，長(zhǎng)沙 410128)

(湖南省發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心3，長(zhǎng)沙 410128)

微生物利用油茶籽油工藝水產(chǎn)堿性蛋白酶初探

蘇 悟1,2鄭小芬1,2徐睿烜1,2蔣立文2,3郭 華1,2周建平1,2

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院1，長(zhǎng)沙 410128)

(食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，長(zhǎng)沙 410128)

(湖南省發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心3，長(zhǎng)沙 410128)

通過(guò)對(duì)4種產(chǎn)蛋白酶微生物的篩選，選擇具有較高產(chǎn)堿性蛋白酶能力的枯草芽孢桿菌。接種到水酶法提取油茶籽油的工藝水中使其產(chǎn)蛋白酶，并通過(guò)產(chǎn)酶條件優(yōu)化提高蛋白酶產(chǎn)量。在原有產(chǎn)酶培養(yǎng)液配方(酵母浸粉2%、蔗糖1.0%、吐溫-80 0.5%、硫酸鎂 0.02%、pH 9.0、接種量4%(V/V))的基礎(chǔ)上，得到最佳產(chǎn)酶條件為：工藝水預(yù)先白土處理2 h，5 000 r/min離心10 min，按80%的比例添加到水中、培養(yǎng)時(shí)間96 h，枯草芽孢桿菌在該產(chǎn)酶條件下最高酶活力為34.8 u/mL。

油茶籽油 工藝水 微生物 蛋白酶活力

目前，茶籽油的提取方法主要有壓榨法和浸提法，壓榨法存在出油率和原料利用率低的問(wèn)題，而浸提法所用的有機(jī)溶劑存在一定的安全隱患。水酶法提取油脂是一種研究較多的油脂制取方式。此法具有條件溫和、設(shè)備簡(jiǎn)單、保護(hù)環(huán)境、油品質(zhì)高、最大限度保存營(yíng)養(yǎng)成分等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。目前水酶法提取油茶籽油的研究已取得了一定的成效并實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，但水酶法提油過(guò)程中產(chǎn)生的工藝廢液的處理技術(shù)逐步被人們所關(guān)注。

采用水酶法提取油茶籽油后的工藝水為粘稠的漿液，其中含有大量的粗蛋白、碳水化合物和茶皂素等活性功能成分。油茶籽中的大分子糖類(lèi)，在油脂提取過(guò)程中被糖化酶水解為還原糖類(lèi)，若不及時(shí)處理，極易滋生腐敗微生物，尤以產(chǎn)酸細(xì)菌和霉菌為甚，直接排放將給環(huán)境造成污染[3]。油茶籽油提取廢水中含有較高的皂素，是一種較好的清洗劑原料，單獨(dú)提取成本較高，況且目前洗滌劑基本上以蛋白酶和脂肪酶為主，茶籽油工藝水中含有的大量蛋白質(zhì)、多糖可以被微生物利用，將具有產(chǎn)酶能力的微生物接種到工藝水中，進(jìn)行蛋白酶、脂肪酶的優(yōu)化培養(yǎng)，以達(dá)到產(chǎn)酶的目的，結(jié)合工藝水中的茶皂素，使工藝水具有一定的去污效果，并應(yīng)用到目前的洗滌產(chǎn)品中，應(yīng)該是目前處理該類(lèi)廢水較佳途徑。

堿性蛋白酶是目前應(yīng)用較為廣泛的一種洗滌產(chǎn)品用酶，微生物蛋白酶均為胞外酶，與動(dòng)、植物源蛋白酶相比具有下游技術(shù)處理相對(duì)簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、來(lái)源廣、菌體易于培養(yǎng)、產(chǎn)量高、高產(chǎn)菌株選育簡(jiǎn)單、快速，具有動(dòng)植物蛋白酶所具有的全部特性，同時(shí)易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大批量生產(chǎn)。而且堿性蛋白酶比中性蛋白酶具有更強(qiáng)的水解能力和耐堿能力，有較大耐熱性，有一定的酯酶活力。因此，堿性蛋白酶研究成為蛋白酶研究的熱點(diǎn)[4-6]。本研究通過(guò)微生物的篩選，選擇具有較高產(chǎn)堿性蛋白酶能力的微生物，接種到水酶法提取油茶籽油的工藝水中使其產(chǎn)堿性蛋白酶，并通過(guò)產(chǎn)酶條件優(yōu)化提高蛋白酶產(chǎn)量，為今后油茶籽油工藝水的有效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

1.1.1 原料：新鮮油茶籽油工藝水(蛋白質(zhì)4%～6%、總糖6%～8%、油脂0.7%[7]、茶皂素0.6%)：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)糧食油脂實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 菌種：地衣芽孢桿菌(CGMCC20004)，枯草芽孢桿菌(CGMCC23708)，銅綠假單胞菌(CGMCC 20546)：中國(guó)微生物菌種保藏管理中心，納豆芽孢桿菌：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%，蛋白胨0.5%，氯化鈉0.5%；枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶培養(yǎng)基[8]：酵母浸粉2%，蔗糖1.0%，吐溫-80 0.5%，硫酸鎂0.02%，pH 9.0，接種量4%(V/V)；地衣芽孢桿菌產(chǎn)酶培養(yǎng)基[9]：葡萄糖1.5%，豆粕6%，乳糖4%，磷酸銨1.2%， KCl 0.03%，CaCl20.07%，MgSO40.02%，吐溫-80 0.05%，pH 9.0,接種量4%(V/V)；銅綠假單胞菌產(chǎn)酶培養(yǎng)基[10]：蛋白胨 1%, 酵母膏 0.5%，氯化鈉0.5% (W/V), 吐溫-80 0.5%，pH 8.5,接種量5%(V/V)。

納豆芽孢桿菌產(chǎn)酶培養(yǎng)基[11]：可溶性淀粉3.41%，麩皮2%，黃豆粉2.26%，CaCl20.2%，K2HPO40.24%，吐溫-80 0.2%，pH 8.5,接種量4%(V/V)。

1.1.4 試劑：L-酪氨酸：Sigma公司；干酪素、福林酚試劑：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水碳酸鈉，氫氧化鈉，硼酸，三氯乙酸，鹽酸(分析純)：廣東光華科技股份有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

101-2AB型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；TDZ5-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)：湘儀離心機(jī)廠；SKY-2102恒溫?fù)u床：上海速坤儀器儀表有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 4種微生物生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

采用比濁法[12]分別測(cè)定枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和納豆芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線，方法步驟如下：

菌種活化24 h→接種于培養(yǎng)液中(接種量2.5%)→培養(yǎng)12 h后在波長(zhǎng)320～420 nm下進(jìn)行掃描→得出最大吸收波長(zhǎng)。

菌種活化24 h→接種于培養(yǎng)液中(接種量2.5%)→每隔2 h在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度→記錄到30 h并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.2 微生物在培養(yǎng)液中堿性蛋白酶活力的測(cè)定

根據(jù)微生物生長(zhǎng)曲線判斷不同微生物產(chǎn)酶的最佳時(shí)間，將微生物活化液接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)液中，在產(chǎn)酶條件下進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定每種微生物的蛋白酶活力，比較得出產(chǎn)酶活力最高的微生物，作為工藝水利用的微生物菌種。

1.3.3 不同比例工藝水添加對(duì)蛋白酶活力的影響

按20%，40%，60%，80%的添加量將工藝水添加到水中，根據(jù)微生物產(chǎn)酶培養(yǎng)基配比進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)化，按最適宜接種量將活化后的微生物液體培養(yǎng)液接入工藝水培養(yǎng)液中，以不添加工藝水的培養(yǎng)液作為對(duì)照，在產(chǎn)酶條件下進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定酶活力，制作蛋白酶活力條形圖，進(jìn)行比較，得出最佳工藝水添加量。

1.3.4 不同方法處理工藝水對(duì)蛋白酶活力的影響

對(duì)生產(chǎn)后的工藝水分別進(jìn)行白土處理(添加量6%，室溫處理2 h)，活性炭處理(炭層厚度 7.5 cm,室溫處理4 h)，硫酸鋁處理(添加量0.5%，50 ℃水浴處理2 h)，蛋白質(zhì)沉淀劑處理(乙酸鋅、亞鐵氰化鉀各5%，70 ℃水浴處理1 h)處理后將工藝水離心(5 000 r,10 min)去下層沉淀，再按產(chǎn)酶培養(yǎng)基配比進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)化，接種培養(yǎng)，測(cè)定酶活力值，比較不同方法處理工藝水后蛋白酶活力值是否有較大提高，并得出最佳的工藝水預(yù)處理方法。

1.3.5 不同培養(yǎng)時(shí)間蛋白酶活力的變化

按工藝水添加的最佳比例配制產(chǎn)酶培養(yǎng)基，在微生物產(chǎn)酶條件下進(jìn)行培養(yǎng)，分別在24、48、72、96、120 h測(cè)定蛋白酶活力，制作蛋白酶活力變化曲線，判斷產(chǎn)酶菌種在工藝水中的最佳產(chǎn)酶時(shí)間。

1.3.6 茶皂素對(duì)微生物產(chǎn)酶的影響

配制茶皂素0%，0.25%，0.5%，0.75%的濃度梯度，按不同濃度添加到配制好的微生物產(chǎn)酶培養(yǎng)液中，在微生物產(chǎn)酶條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)到最佳產(chǎn)酶時(shí)間后，分別測(cè)定不同濃度茶皂素添加量培養(yǎng)液中的蛋白酶活力，分析茶皂素對(duì)微生物產(chǎn)酶的影響。

1.4 蛋白酶活力測(cè)定[13]

利用回歸方程，計(jì)算出當(dāng)吸光度為1時(shí)的酪氨酸量(μg)，即為吸光常數(shù)K值。應(yīng)在95～100范圍內(nèi)。將培養(yǎng)一定時(shí)間的含菌工藝水或培養(yǎng)液離心(5 000 r/min,10 min)，靜置，取上清液液1.0～2.0 mL，稀釋一定倍數(shù)，推薦濃度為酶活力10～15 u/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種微生物生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

4種微生物的最大吸收波長(zhǎng)在370～400 nm之間，將活化24 h菌懸液接種于工藝水中(接種量2.5%)，每隔2 h在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，記錄到30 h并繪制生長(zhǎng)曲線。4種微生物的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。

由4種微生物的生長(zhǎng)曲線可以看出，枯草芽孢桿菌在培養(yǎng)液中培養(yǎng)16 h開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期，第22小時(shí)達(dá)到最大吸光值，地衣芽孢桿菌在生長(zhǎng)的14 h進(jìn)入穩(wěn)定期，20 h達(dá)到最大吸光值，銅綠假單胞菌在培養(yǎng)后12 h達(dá)到穩(wěn)定期，20 h達(dá)到最大吸光值。納豆芽孢桿菌在培養(yǎng)的16 h達(dá)到最大吸光值。由于微生物的產(chǎn)酶代謝積累一般是在穩(wěn)定期末期達(dá)到最多，通過(guò)4種微生物最大吸光值的判斷，初步確定在培養(yǎng)24 h后對(duì)其進(jìn)行酶活力測(cè)定。

圖1 4種微生物的生長(zhǎng)曲線

2.2 4種微生物堿性蛋白酶活力的測(cè)定

將4種微生物的活化液分別接種于各自的產(chǎn)酶培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為：36 ℃，200 r/min，初始pH = 9，培養(yǎng)24 h，測(cè)定蛋白酶活力，蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2，蛋白酶活力值見(jiàn)圖3。

圖2 L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算K值，得到K=97在允許范圍(95～100)內(nèi)，符合要求。

圖3 不同微生物產(chǎn)蛋白酶活力比較

由圖3可以看出，4種微生物中，枯草芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶的活性最高，因此選擇枯草芽孢桿菌作為工藝水利用的菌種。

2.3 不同比例工藝水添加對(duì)蛋白酶活力的影響

按20%，40%，60%，80%的添加量將工藝水添加到水，根據(jù)枯草芽孢桿菌的產(chǎn)酶培養(yǎng)基的配比進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)化，按4%接種量將活化后的微生物液體培養(yǎng)液接入工藝水培養(yǎng)液中，以不添加工藝水的培養(yǎng)液作為對(duì)照，在36 ℃，200 r/min產(chǎn)酶條件下進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定酶活力，蛋白酶活力柱形圖見(jiàn)圖4。

圖4 不同工藝水添加量對(duì)蛋白酶活力的影響

圖4顯示，工藝水的添加不利于枯草芽孢桿菌的產(chǎn)酶，與對(duì)照組相比，添加組的蛋白酶活力明顯較低，可能是由于工藝水中的茶皂素或油脂導(dǎo)致添加工藝水后酶活力普遍較低。相對(duì)來(lái)看，80%的添加量的酶活力高于其他添加量，而隨著添加比例的上升，酶活力并無(wú)明顯相關(guān)性。

2.4 不同方法處理工藝水對(duì)蛋白酶活力的影響

對(duì)生產(chǎn)后的工藝水分別進(jìn)行白土處理(添加量6%，室溫處理2 h)，活性炭處理(炭層厚度 7.5 cm,室溫處理4 h)硫酸鋁處理(添加量0.5%，50 ℃水浴處理2 h)，處理后將工藝水離心(5 000 r,10 min)去下層沉淀，再接種培養(yǎng)，測(cè)定酶活力值，酶活力柱形圖見(jiàn)圖5。不同方法處理過(guò)后，可以看出，白土、活性炭和硫酸鋁處理后，酶活力與處理前相比有一定的提高，白土處理的酶活力增幅最大，為40%，活性炭和硫酸鋁分別為6%和18.9%，而乙酸鋅和亞鐵氰化鉀處理過(guò)后蛋白酶活力反而減弱，可能是由于亞鐵離子的加入抑制了微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶能力，因此選擇白土處理為最佳的工藝水處理辦法。

圖5 不同處理方法對(duì)蛋白酶活力的影響

2.5 不同發(fā)酵時(shí)間蛋白酶活力的變化

將工藝水用白土處理過(guò)后，按80%的添加比例配制產(chǎn)酶培養(yǎng)基，在36 ℃，200 r/min產(chǎn)酶條件下進(jìn)行培養(yǎng)，分別在24、48、72、96、120 h測(cè)定蛋白酶活力，制作蛋白酶活力變化曲線，判斷枯草芽孢桿菌在工藝水中的最佳產(chǎn)酶時(shí)間，蛋白酶活力曲線見(jiàn)圖6。

圖6 枯草芽孢桿菌不同發(fā)酵時(shí)間產(chǎn)酶活力曲線圖

從圖6可以看出，枯草芽孢桿菌在工藝水中前發(fā)酵24 h未測(cè)出明顯酶活力，由于在接種初期微生物處于遲緩期和對(duì)數(shù)期，代謝產(chǎn)酶量未積累，因此酶活力無(wú)法測(cè)出。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力逐漸上升，到第96小時(shí)達(dá)到最高，然后逐漸下降，可以大致判斷，枯草芽孢桿菌在營(yíng)養(yǎng)化后的工藝水中產(chǎn)酶的最佳時(shí)間約為培養(yǎng)后的96 h。

2.6 茶皂素對(duì)微生物代謝產(chǎn)酶的影響

在枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶培養(yǎng)液中添加濃度梯度為：0%，0.25%，0.5%，0.75%的茶皂素，按其最佳培養(yǎng)時(shí)間和條件進(jìn)行培養(yǎng)，96 h后測(cè)定蛋白酶活力，不同濃度茶皂素對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶的影響見(jiàn)圖7。

圖7 不同濃度茶皂素對(duì)產(chǎn)酶的影響

不同批次以及不同保存方法和取樣部位的工藝水中，茶皂素含量有不同。本試驗(yàn)所用批次的茶籽油工藝水中茶皂素含量約為0.6%，因此選擇0%～1.0%的濃度范圍，由圖7可以看出，隨著茶皂素添加比例的增加，枯草芽孢桿菌的產(chǎn)酶活力并未受到明顯抑制，濃度達(dá)到0.5%之后，隨著濃度的增加產(chǎn)酶活力稍有下降，但在添加茶皂素的培養(yǎng)液中，酶活力高于未添加茶皂素的培養(yǎng)液，因此初步判斷茶皂素對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶不存在明顯的抑制作用。

2.7 重現(xiàn)性

蛋白酶活力測(cè)定重現(xiàn)性見(jiàn)表1～表3。

表1 4種微生物蛋白酶活力測(cè)定重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

表2 不同比例工藝水中酶活力測(cè)定重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

表3 不同處理方法酶活力重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)4種微生物蛋白酶活力的測(cè)定，選擇了產(chǎn)堿性蛋白酶活力較高的枯草芽孢桿菌接種到水酶法提取茶籽油產(chǎn)生的工藝水中，經(jīng)過(guò)產(chǎn)酶條件的優(yōu)化和廢水的預(yù)處理，得出最佳的預(yù)處理辦法為：白土預(yù)處理2 h(添加量6%)，按80%的工藝水添加比例在原有產(chǎn)酶培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上配制工藝水優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)液，相對(duì)有利于枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶，在工藝水中最佳的產(chǎn)酶時(shí)間約為培養(yǎng)后96 h，測(cè)出枯草芽孢桿菌在優(yōu)化后的工藝水培養(yǎng)基中最高產(chǎn)酶活力為34.8 u/mL。在枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液中添加不同比例的茶皂素，培養(yǎng)后顯示茶皂素對(duì)其產(chǎn)蛋白酶沒(méi)有明顯的抑制作用。目前，在工藝水中培養(yǎng)微生物所測(cè)出的蛋白酶活力偏低，可能是由于工藝水中除了殘余油脂和茶皂素以外，還有某種成分不利于微生物的產(chǎn)酶，因此接下來(lái)可以對(duì)工藝水的成分做進(jìn)一步的分析，確定抑制產(chǎn)酶的成分，在最大限度保存茶皂素的前提下，優(yōu)化產(chǎn)蛋白酶活性，達(dá)到更好的利用和處理水酶法提取茶籽油工藝水的目的。

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[13]GB/T 23527-2009, 蛋白酶制劑[S]

[14]GB/T 601-2002, 化學(xué)試劑標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備[S].

Microorganism Producing Alkaline Protease Using Waste Water Produced by Extraction of Camellia Oil in Aqueous Enzymatic Method

Su Wu1,2Zheng Xiaofen1,2Xu Ruixuan1,2Jiang Liwen2,3Guo Hua1,2Zhou Jianping1,2

(College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University1, Changsha 410128)(Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology2, Changsha 410128)(Hunan Provincial Research Center of Engineering and Technology for Fermented Food3, Changsha 410128)

Four kinds of protease producing microorganisms have been screened to find the kind with the highest yield of alkaline protease in the paper. The bacillus subtilis has been selected after the screening. It was inoculated to the waste water produced from extraction of Camellia oil through aqueous enzymatic method to produce protease; improved protease production by optimizing the enzyme production conditions. The optimal enzyme production conditions were as follows: the waste water adsorbed by bleaching earth for 2 h, centrifuged at 5 000 r/min for 10 minutes, added to the water in the proportion of 80%, incubation time for 96 h. On the basis of the original enzyme production nutrient solution formula (yeast leaching powder 2%, sugar 1.0%, 0.5% tween-80, 0.02% magnesium sulfate, pH 9.0, inoculums size 4% (V/V)), bacillus subtilis could achieve the highest enzyme activity of 34.8 u/mL on the conditions of the enzyme production.

camellia oil, waste water, microorganism, protease activity

TS225.1

A

1003-0174(2016)03-0059-05

國(guó)家863計(jì)劃(2012AA102107)

2014-08-20

蘇悟，女，1990年出生，碩士，糧食油脂植物蛋白工程

蔣立文，男，1968年出生，教授，食品生物技術(shù)