王計(jì)平 張玲慧 趙 靜 王彥尊 李潤植

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,太谷 030801)

紫蘇種子脂肪酸代謝及關(guān)鍵酶基因調(diào)控油脂合成規(guī)律的研究

王計(jì)平 張玲慧 趙 靜 王彥尊 李潤植

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,太谷 030801)

為了研究種子油脂及脂肪酸生物合成機(jī)制，特別是α-亞麻酸的高水平積累，采用氣相色譜法分析7個(gè)紫蘇品種的成熟種子及晉蘇1號(hào)種子不同發(fā)育時(shí)期脂肪酸組成、含量及其動(dòng)態(tài)變化；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TAG生物合成關(guān)鍵酶基因在紫蘇不同組織及種子發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)特性，分析基因表達(dá)與脂肪酸及α-亞麻酸合成積累之間的關(guān)系。結(jié)果表明，紫蘇種子中不飽和脂肪酸(18∶1，18∶2，18∶3)含量占總脂肪酸90%以上，種子發(fā)育過程中，總脂肪酸含量隨著鮮重增加而不斷增加，種子形態(tài)也經(jīng)歷由多水透明狀轉(zhuǎn)變?yōu)槿榘咨蛏钭仙詈蟪蔀楹稚?；隨著種子不斷發(fā)育，亞油酸含量逐漸降低，而α-亞麻酸含量不斷增加，到種子成熟時(shí)達(dá)總脂肪酸質(zhì)量的60%以上。晉蘇1號(hào)作為高含α-亞麻酸的優(yōu)質(zhì)品種，α-亞麻酸含量達(dá)456.6 mg/g，亞麻酸與亞油酸之比為9∶1。Real-time PCR 分析結(jié)果顯示PfDGAT1和PfPDAT在紫蘇莖和根系中的表達(dá)量均很低，而在葉片和種子中高量表達(dá)，在種子發(fā)育不同時(shí)期，PfDGAT1表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，開花后30 d，表達(dá)量最高。PfDGAT1基因超量表達(dá)之后緊接著α-亞麻酸和總油脂快速積累，表明PfDGAT1在紫蘇α-亞麻酸和總油脂積累過程中起關(guān)鍵作用。

紫蘇 種子油脂 脂肪酸 二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因(DGAT1) 磷脂二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(PDAT)

紫蘇(PerillafrutescensL.)是唇形科紫蘇屬一年生草本植物，有較強(qiáng)的適應(yīng)性，可藥食兩用，廣泛分布于東亞各國，在我國已有2 000多年的栽培歷史。紫蘇籽出油率高達(dá)45%～55%，含有豐富的不飽和脂肪酸，占總脂肪酸含量的90%以上，其中α-亞麻酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)55%～65%，α-亞麻酸是人體組織細(xì)胞必需的脂肪酸，在體內(nèi)參與磷脂的合成和代謝。更為重要的是，α-亞麻酸在人體細(xì)胞組織內(nèi)可進(jìn)一步合成人體必需的2種生命活性因子，即二十二碳六烯酸(22∶6 n-3,DHA)和二十碳五烯酸(20∶5 n-3, EPA)。因此，開發(fā)基于植物源的α-亞麻酸營養(yǎng)保健醫(yī)療產(chǎn)品，越來越引起國內(nèi)外學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的高度關(guān)注。作為一種營養(yǎng)保健食用油，紫蘇籽油具有降血壓、降低膽固醇、促進(jìn)視網(wǎng)膜發(fā)育、提高記憶力、增強(qiáng)免疫力、延緩衰老、預(yù)防老年癡呆等功效[1-2]。目前，關(guān)于植物種子脂肪酸合成積累機(jī)制及代謝工程的研究已成為當(dāng)今植物油脂化學(xué)與分子生物學(xué)，生物技術(shù)和油料作物遺傳育種研究的重點(diǎn)領(lǐng)域[3-7]，但有關(guān)紫蘇α-亞麻酸生物合成積累及調(diào)控機(jī)制的研究相對(duì)較少。本試驗(yàn)通過研究控制紫蘇種子α-亞麻酸合成及積累的關(guān)鍵酶基因，即選擇性轉(zhuǎn)移α-亞麻酸于三?；视椭?TAG)分子中的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT1)和磷脂二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(PDAT)的表達(dá)特性，結(jié)合紫蘇種子含油率及脂肪酸成分變化，揭示油脂合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)對(duì)油脂合成的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

Agilent 7890A氣相色譜儀：美國安捷倫科技公司；Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System(實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀)：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.2 供試材料

試驗(yàn)所用材料由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供，紫蘇品種為中北2號(hào)、晉蘇1號(hào)、Y-早、Y-7、Y-4、Y-2、白蘇。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 脂肪酸提取

選取紫蘇7個(gè)品種的成熟種子及于盛花期標(biāo)記始開花朵，開花后10、20、30、40 d，分別取發(fā)育中的蒴果(四棱種)15粒于EP管中，立即放入液氮中速凍(-80 ℃保存)，每次取材3次重復(fù)。樣品經(jīng)真空冷凍干燥過夜，稱取凍干種子樣品(8～12 mg)置于干燥玻璃試管中。加入Tri17∶0(用于內(nèi)對(duì)照)，每mg干樣品加10 μg Tri17∶0(即每mg樣品加1 μL 10 mg/mL Tri17∶0溶液)，在玻璃試管內(nèi)小心研磨。加入1 mL氯仿∶甲醇(2∶1)溶液，用玻璃棒攪拌幾分鐘后靜置，加0.9% KCl 0.5 mL攪拌后再加入1 mL氯仿，混勻，離心，使其分層。用玻璃吸管將底部氯仿相吸出，并移至另一個(gè)新的玻璃管。將含有氯仿相的試管置于室溫下自然蒸發(fā)(留下10～20 μL即可)。向上述試管中加入0.5 mL甲醇鈉(含BHT)，混勻后置于搖床上震蕩20～45 min。之后加入0.5 mL異辛烷，混勻后，離心，使溶液分層，再加入0.9% KCl 1 mL，混勻，再離心至分層。吸取上層(含有脂肪酸甲酯)，放入GC小瓶保存待測(cè)。

1.3.2 脂肪酸成分測(cè)定

通過安捷倫7890A氣相色譜儀進(jìn)行分析，條件為VF-23MS毛細(xì)管柱30 m×0.25 mm×0.25 μm。進(jìn)樣口溫度為260 ℃，載氣為高純氮?dú)?，分流?0∶1，進(jìn)樣體積1 μL，恒壓22 psi。程序升溫:初溫為110 ℃，保持3 min，以4 ℃/min升至220 ℃，保持15 min。FID檢測(cè)器溫度為260 ℃，尾吹氣N245 mL/min，空氣450 mL/min，氫氣40 mL/min。用安捷倫軟件進(jìn)行分析，各種脂肪酸的鑒定通過標(biāo)樣保留時(shí)間確認(rèn)，同樣條件下平行測(cè)定3次。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

通過脂肪酸組分及含量測(cè)定優(yōu)選品種晉蘇1號(hào)，取其根、莖、葉、花，并于盛花期標(biāo)記始開花朵，10、20、30、40 d后取發(fā)育中的蒴果(四棱種)，每次取材分3次重復(fù)。RNA提取及第一鏈cDNA的合成分別按照TIAN Gen Biotech公司TRIZOL及FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進(jìn)行。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物分別為：PfDGAT1F:5’-TGGTGGAATGCGAGGACA-3’/PfDGAT1R:5’-GACACAAGAAACGCGATCAA-3’，PfPDATF:5’-GGCATTCCAACTGAAAGAGC-3’/PfPDATR:5’-GTTTTTCCACGCCACCCT-3’，18S rRNAF:5’-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3’/18S rRNAF:5’-GCTGGAATTACCGCGGCT-3’。反應(yīng)體系為：SYBR Premix EX TaqⅡ(Tli RnaseH Plus)(2×) 5 μL，10 μmol/L引物對(duì)各0.4 μL，模板cDNA 1 μL，ROX Reference Dye(50×) 0.2 μL，無菌純水補(bǔ)足10 μL；反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)(95 ℃ 30 s；60 ℃ 30 s；72 ℃ 20 s)，10 ℃保溫。所用引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種紫蘇成熟種子中脂肪酸組分分析

通過氣相色譜儀對(duì)7個(gè)不同品種紫蘇種子脂肪酸組成進(jìn)行分析，結(jié)果表明：紫蘇籽油中含有棕櫚酸(C16∶0)、棕櫚一烯酸(C16∶1)、硬脂酸(C18∶0)、油酸(C18∶1)、亞油酸(C18∶2)、亞麻酸(C18∶3)、花生酸(C20∶0)、花生一烯酸(C20∶1)(表1)。其中，棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸含量較高，而棕櫚一烯酸、花生酸、花生一烯酸為微量脂肪酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，<1%)。飽和脂肪酸棕櫚酸和硬脂酸的含量明顯較低，在總脂肪酸中分別占6%～7%和2%～3%。7個(gè)品種中晉蘇1號(hào)亞麻酸含量最高，占總脂肪酸質(zhì)量的60.7%，達(dá)到456.6 mg/g，亞麻酸與亞油酸的比值為9∶1，其中不飽和脂肪酸占總脂肪酸的91%，7個(gè)品種總不飽和脂肪酸均達(dá)到90%以上(圖1)，上述結(jié)果與已有研究結(jié)果一致[8-10]。

表1 不同品種紫蘇成熟種子脂肪酸組成及含量測(cè)定結(jié)果

2.2 紫蘇種子發(fā)育過程中脂肪酸組分分析

晉蘇1號(hào)果實(shí)發(fā)育初期4個(gè)果實(shí)晶瑩剔透，小如針尖；中期果實(shí)膨大，由透明狀轉(zhuǎn)向半透明或乳白色，通常同一基座上的4個(gè)果實(shí)發(fā)育大小不一；后期果實(shí)達(dá)到最大，為褐色，表皮有褐色網(wǎng)紋突出；末期果實(shí)不再增大，表皮的網(wǎng)紋變淡，果實(shí)全褐。在種子發(fā)育過程中定期取樣，通過氣相色譜進(jìn)行脂肪酸組分分析(圖2)。結(jié)果表明，種子發(fā)育前期，隨著時(shí)間的推移，種子鮮重逐漸增大，到開花后30 d達(dá)到最大，然后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。而脂肪酸含量從開花后10 d開始緩慢增加，開花后30 d以后，種子鮮重降低的同時(shí)脂肪酸總量的積累迅速增大。

在種子發(fā)育過程中，脂肪酸積累量不斷增加，5種主要脂肪酸含量也在發(fā)生變化(圖3)，每克種子中棕櫚酸(C16∶0)和亞油酸(C18∶2)的含量逐漸降低，硬脂酸(C18∶0)呈緩慢上升趨勢(shì)，油酸(C18∶1)開始增加緩慢，到了后期增加較快，變化趨勢(shì)與α-亞麻酸(C18∶3)類似。α-亞麻酸含量整體呈上升趨勢(shì)，開花后10 d種子中α-亞麻酸含量占總脂肪酸質(zhì)量的40%，20 d的種子中 α-亞麻酸質(zhì)量占53%，到開花后40 d時(shí)，平均每克鮮種子中α-亞麻酸質(zhì)量達(dá)100.1 mg，占總脂肪酸質(zhì)量的84%。

2.3 調(diào)控脂肪酸代謝關(guān)鍵酶時(shí)空表達(dá)分析

PfDGAT1在紫蘇不同組織的表達(dá)情況如圖4顯示，PfDGAT1在種子形成后期(開花后30 d)表達(dá)量最高，是葉片表達(dá)量的4.3倍，在花中表達(dá)量相對(duì)下調(diào)了1.1倍，該基因在紫蘇莖和根系中的表達(dá)量很低，分別是葉片表達(dá)量的0.32倍和0.53倍，說明種子是TAG合成的主要場(chǎng)所，PfDGAT1在紫蘇種子總油脂積累過程中行使重要功能。在種子發(fā)育過程中，PfDGAT1基因表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。

圖4 晉蘇1號(hào)不同組織器官PfDGAT1相對(duì)表達(dá)量的變化

根據(jù)圖5結(jié)果分析，紫蘇不同組織器官中PfPDAT基因表達(dá)量存在差異。在不同組織中表達(dá)量

圖5 晉蘇1號(hào)不同組織器官PfPDAT相對(duì)表達(dá)量的變化

以葉片最高，莖和根系中表達(dá)量比較低，種子發(fā)育初期(開花后10 d)表達(dá)量最高，是葉片表達(dá)量的1.4倍，隨著種子逐漸成熟，PfPDAT基因呈下調(diào)表達(dá)，到開花后40 d，該基因表達(dá)量?jī)H為種子發(fā)育初期的0.006倍。

3 討論與結(jié)論

通過氣相色譜分析得出紫蘇種子中主要含有棕櫚酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、油酸(C18∶1)、亞油酸(C18∶2)、亞麻酸(C18∶3)5種脂肪酸，其中不飽和脂肪酸含量高，占總脂肪酸的90.5%～92.4%。晉蘇1號(hào)α-亞麻酸含量高，可達(dá)到456.6 mg/g，亞麻酸與亞油酸之比為9∶1，是高含α-亞麻酸的優(yōu)質(zhì)品種。紫蘇種子發(fā)育過程中各脂肪酸組分隨著種子發(fā)育呈現(xiàn)一定變化規(guī)律，飽和脂肪酸如棕櫚酸、硬脂酸含量較為穩(wěn)定，不飽和脂肪酸如油酸含量隨著種子發(fā)育，前期積累量增長(zhǎng)緩慢，后期顯著增加，而α-亞麻酸含量不斷增加直至種子成熟，亞油酸含量呈連續(xù)下降趨勢(shì)，這可能與種子發(fā)育過程中大量亞油酸向 α-亞麻酸快速轉(zhuǎn)化積累有關(guān)，而亞麻酸含量的增加抑制了亞油酸的合成，從而導(dǎo)致ALA與LA之間的比例差距加大[11]。從總體來看，脂肪酸累積過程較長(zhǎng)，在進(jìn)入開花期后需要30～40 d才能完成。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)隨著種子的發(fā)育，種子鮮重呈先升高后降低的趨勢(shì)，開花后30 d達(dá)到最大，種子形態(tài)也由多水透明狀轉(zhuǎn)變?yōu)槿榘谆蛏钭仙詈笞兂珊稚?，同時(shí)種子逐漸變得硬實(shí)，脂肪酸的積累量迅速增加，到種子發(fā)育后期脂肪酸含量達(dá)到最大。

α-亞麻酸等脂肪酸合成后，經(jīng)一系列酶促反應(yīng)，最終轉(zhuǎn)入甘油-3-磷酸分子(glycerol-3 phosphate, G3P)而生成三?；视?TAG)，貯存于油體中。研究表明，PDAT 和DGAT1 是控制模式植物擬南芥種子油合成積累的關(guān)鍵酶[12-13]。王安可[14]在棉花中的研究發(fā)現(xiàn)在油脂儲(chǔ)存的主要器官種子中DGAT1表達(dá)量較高。Wang等[15]提取開花后10、20和30 d的大豆豆莢RNA，檢測(cè)了GmDGAT1基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)隨著豆莢的發(fā)育表達(dá)量遞增，且在30 d時(shí)，基因的表達(dá)量達(dá)到最高。蓖麻種子中的DGAT1的表達(dá)量是從種子發(fā)育開始逐漸上升，在中期達(dá)到最大[16]。有研究報(bào)道PDAT 能選擇性積累羥化脂肪酸[17]。本研究對(duì)紫蘇不同器官及種子發(fā)育不同時(shí)期PfDGAT1及PfPDAT基因表達(dá)特性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，二者在種子中均大量表達(dá)，PfDGAT1表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在開花后30 d，表達(dá)量最高，緊接PfDGAT1基因高峰表達(dá)期的是α-亞麻酸和總油脂快速積累期。這表明PfDGAT1在紫蘇α-亞麻酸和總油脂積累過程中行使重要功能。

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Regulation of Controlling Oil Synthesis by Fatty Acid Metabolism of Perilla Seed and Key Enzyme Gene

Wang Jiping Zhang Linghui Zhao Jing Wang Yanzun Li Runzhi

(College of Agronomy, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801)

In order to study the biosynthesis mechanism of grease and fatty acids in seeds, especially the high-level accumulation of α- linolenic acid, this paper adopted gas chromatography method to analyze composition, content and dynamic change of fatty acid in the mature seeds of seven perrila varieties and Jinsu No. 1 seed at different development stages; the developing seeds so as to investigate physiological-biochemical features of perilla seed oil and fatty acid biosynthesis. Expression pattern of key genes in fatty acid metabolism was analyzed. The results showed that unsaturated fatty acids (18∶1, 18∶2, 18∶3) made up 90% of total seed oil in perilla. Following seed developing, seed fresh weight and total fatty acid content were increased, and seed morphology was also changed from aqueous and transparent forms to milky white or dark purple and finally brown matured seeds. During seed development and maturation, linoleic (18∶2) content was gradually reduced while the level of α-linolenic acid (18∶3) was correspondingly increased up to more than 60% of the total fatty acids in the mature seeds. Of seven perilla varieties tested, variety Jinsu1 contained the highest level of α-linolenic acid (456.6 mg/g). The ratio of α-linolenic acid to linoleic acid is 9∶1. Real-time PCR analysis showed that small expression ofPfDGAT1 andPfPDATwas in root and stems while large expression of the genes was in leaves and seeds. Following seed development,PfDGAT1 expression increased slowly at the earlier stages, and then increased vastly at mid stages and reduced slowly at late stages, with the peak expression level in the seed at 30 days after flowering. ThePfDGAT1 highly expression stage was just ahead of the high accumulation stage of α-linolenic acid and total oil in seed development, indicating thatPfDGAT1 function importantly in perilla seed oil and α-linolenic acid accumulation.

PerillafrutescensL., seed oil, fatty acid, diacylglycerol acyltransferase enzyme (DGAT1), phospholipids diacylglycerol acyltransferase (PDAT)

S565.8

A

1003-0174(2016)03-0091-05

時(shí)間：2015-12-28 17:06:54

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.2864.TS.20151228.1706.002.html

國家青年科學(xué)基金(31201266)

2014-12-26

王計(jì)平，女，1974年出生，博士，副教授，植物生理與分子生物學(xué)

李潤植，男，1959年出生，博士，教授，植物分子遺傳與基因工程