郭佳培，吳景華，李雷雷，郭 彬

（華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，河北唐山063000）

·基礎(chǔ)研究·

AKT-GSK-3β信號途徑在下調(diào)肝癌細胞化療敏感性中的作用研究

郭佳培，吳景華，李雷雷，郭 彬

（華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，河北唐山063000）

目的觀察AKT-GSK-3β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對化療后肝癌細胞凋亡的影響，進一步探討該通路在肝癌細胞化療敏感性中的調(diào)控作用。方法應(yīng)用細胞培養(yǎng)與Western blot技術(shù)，檢測肝癌細胞化療后凋亡情況并分析其與AKT-GSK-3β信號通路活化的關(guān)系，通過特異性阻斷信號通路方法，對AKT-GSK-3β通路調(diào)節(jié)肝癌細胞化療敏感性進行驗證。結(jié)果肝癌細胞經(jīng)奧沙利鉑化療后發(fā)生凋亡，表現(xiàn)為BAX蛋白表達增加和Bcl-2蛋白表達減少，同時AKT-GSK-3β通路磷酸化激活。阻斷該通路后，化療后肝癌細胞凋亡明顯增加。結(jié)論AKT-GSK-3β信號途徑可以下調(diào)肝癌細胞化療敏感性，與其化療效果有密切聯(lián)系。

AKT-GSK-3β； 肝癌； 化療； 凋亡； 敏感性

肝癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，起病隱匿，進展迅速，病死率極高，在癌癥死因中位居第二位[1]。發(fā)達國家僅有20%～30%的患者可在早期確診并手術(shù)治療[2]，對于中晚期患者多應(yīng)用化療。奧沙利鉑由于副作用少在臨床上得到廣泛應(yīng)用，然而由于肝癌細胞的化療抵抗現(xiàn)象，治療效果并不十分理想。因此，減少化療抵抗是提高肝癌系統(tǒng)治療效果的一個關(guān)鍵問題。糖原合成激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）是PI3K／AKT信號通路中重要的具有調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡等功能的調(diào)節(jié)分子，該通路與抑制細胞凋亡及促進增殖密切相關(guān)。為了研究肝癌化療抵抗與GSKS-3β之間的關(guān)系，本文將從細胞及分子水平進行分析，進一步探究AKT-GSK-3β信號途徑在下調(diào)肝癌細胞化療敏感性中的作用及機制。

材料和方法

1 研究對象

SMMC-7721傳代肝癌細胞（上海細胞庫）、HepG2傳代肝癌細胞（上海細胞庫）。

2 主要試驗儀器與試劑

生物安全柜、細胞培養(yǎng)箱、離心機、電泳儀（Biorad）、Image Lab凝膠成像系統(tǒng)（Bio-rad）、高糖DMEM（Gibco，美國）、胎牛血清（BI，美國）、0．25%胰蛋白酶、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（索來寶，北京）、0．45nm PVDF膜、脫脂奶粉、蛋白上樣緩沖液（索來寶，北京）、ECL發(fā)光顯影液（索來寶，北京）。

3 研究方法

3．1 肝癌細胞培養(yǎng) 采用高糖DMEM和10%胎牛血清加青鏈霉素混合液制成完全培養(yǎng)液，于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)SMMC-7721和HepG2細胞。取對數(shù)生長期細胞進行試驗。

3．2 奧沙利鉑作用后肝癌細胞凋亡的檢測

取對數(shù)生長期的SMMC-7721和HepG2細胞分別制成細胞懸液，以2．5×105個／孔數(shù)量加入六孔板中。細胞融合率50%～70%時，以20μg／mL奧沙利鉑分別作用18h。Western blot檢測肝癌細胞中Bcl-2、BAX蛋白的表達情況。

3．3 檢測奧沙利鉑作用下肝癌細胞AKT／GSK-3β通路的激活情況 按上述步驟以奧沙利鉑作用肝癌細胞，Western-blot檢測總 AKT、p-AKT及p-GSK-3β蛋白的表達情況。

3．4 阻斷通路后肝癌細胞的凋亡情況 于奧沙利鉑作用前1h應(yīng)用PI3K／AKT特異抑制劑LY294002阻斷該通路后，按上述步驟以奧沙利鉑作用肝癌細胞，再次行Western-blot檢測肝癌細胞中Bcl-2、BAX蛋白的表達情況，以觀察AKT／GSK-3β信號通路對化療效果的影響。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

Western-blot檢測圖像用Image Lab化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)處理并計算灰度值；采用SPSS17．0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。資料經(jīng)檢驗均服從正態(tài)分布，用±s表示。采用兩獨立樣本t檢驗和完全隨機設(shè)計方差分析統(tǒng)計灰度值。所有結(jié)果以P＜0．05有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 奧沙利鉑誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡情況

取經(jīng)奧沙利鉑作用的細胞，提取細胞總蛋白，進行Western blot檢測。結(jié)果顯示，肝癌細胞SMMC-7721及HepG2經(jīng)奧沙利鉑化療后，抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯降低，凋亡相關(guān)蛋白BAX表達明顯升高。統(tǒng)計分析其灰度值，Bcl-2和BAX的改變均有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）見圖1。

2 奧沙利鉑誘導(dǎo)AKT／GSK-3β信號通路蛋白表達情況

經(jīng)奧沙利鉑作用后，肝癌細胞中SMMC-7721及Hep G2 AKT蛋白表達水平?jīng)]有明顯（P＞0．05），而p-AKT和p-GSK-3βser9蛋白表達增加（P＜0．01），說明奧沙利鉑可以誘導(dǎo)該通路活化。見圖2。

3 AKT／GSK-3β信號通路影響肝癌細胞化療敏感性的情況

應(yīng)用 AKT／GSK-3β特異阻斷劑 LY294002阻斷該通路后，奧沙利鉑作用的肝癌細胞凋亡蛋白BAX表達明顯增加（P＜0．01），而抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯減少（P＜0．05），說明奧沙利鉑作用后AKT／GSK-3β信號通路的激活明顯抑制了其凋亡敏感性。見圖3。

討 論

肝癌是全球最常見的腫瘤之一，且發(fā)病率逐年增加。通常肝癌確診時已發(fā)展至晚期，手術(shù)療效不佳。盡管索拉菲尼可提高晚期患者生存率已被肯定，但此幾率極低（2%～3%）；并且，已有研究指出PI3K／AKT通路可介導(dǎo)肝癌細胞對索拉菲尼產(chǎn)生抵抗。因此，肝癌患者對化療產(chǎn)生抵抗的機制及新的治療方法仍需探究[3]。

PI3K／AKT通路是包括肝癌在內(nèi)的人類腫瘤中主要信號通路之一，細胞靜止時，AKT位于胞漿內(nèi)；細胞受生長因子等刺激后，AKT由胞漿轉(zhuǎn)移至胞膜內(nèi)側(cè)，PH域與PlS結(jié)合，暴露磷酸化位點，被 PDK-1激活后離開細胞膜進入細胞核發(fā)揮作用。PI3K／AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要作用包括促進細胞增長、抑制細胞凋亡和下調(diào)細胞周期抑制性調(diào)控因子，與乳腺癌、卵巢癌、肝癌、大腸癌等多種腫瘤關(guān)系密切。其中GSK-3β蛋白是PI3K／AKT信號通路中的重要節(jié)點蛋白，GSK-3β在許多腫瘤細胞和人類腫瘤組織中高表達[4]。GSK-3β在靜止細胞中一般較活躍，受磷酸化修飾調(diào)節(jié)，9位絲氨酸的磷酸化使其活性受抑制。GSK-3β磷酸化活化后，可降解抗凋亡蛋白Bcl-2，從而增加細胞凋亡。隨著與 GSK-3β相互作用分子的不斷發(fā)現(xiàn)，GSK-3β在腫瘤形成中的重要作用受到越來越多的關(guān)注。本次研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞經(jīng)奧沙利鉑化療后，AKT被激活，GSK-3β 9位絲氨酸磷酸化增加，GSK-3β活性被抑制，使Bcl-2降解減少，細胞凋亡減少。相反，LY294002特異性阻斷AKT活性后，細胞凋亡明顯增加，可見肝癌細胞對奧沙利鉑的敏感性與該通路有某種聯(lián)系，即化療后AKT／GSK-3β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化可抑制肝癌細胞凋亡，表明該通路可調(diào)節(jié)細胞對化療藥的敏感性，與化療后肝癌細胞的生長和患者生存期和復(fù)發(fā)率密切相關(guān)。這與Soto-Cerrato等[5]研究結(jié)果一致。另外，LY294002本身并不會引起細胞凋亡，特異性阻斷AKT／GSK-3β信號通路后，凋亡蛋白表達增加，而抗凋亡蛋白明顯減少，提示兩種肝癌細胞凋亡均顯著增加，說明干擾AKT／GSK-3β的表達可誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的發(fā)生，這與Dan[6]研究結(jié)果一致。

綜上，AKT／GSK-3β信號途徑可使肝癌細胞抵抗化療引起的凋亡，抑制該通路可提高肝癌細胞化療敏感性。

[1]Jemal A，Bray F，Center M M，et al．Global cancer statistics．CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90．

[2]Xiu P，Dong X F，Li X P，et al．Clusterin：Review of research progress and looking ahead to direction in hepatocellular carcinoma．World J Gastroenterol，2015，21（27）：8262-8270．

[3]Du H，Yang W，Chen L，et al．Role of autophagy in resistance to oxaliplatin in hepatocellular carcinoma cells．Oncol Rep，2012，27（1）：143-150．

[4]Chiara F，Rasola A．GSK-3 and mitochondria in cancer cells．Front Oncol，2013，3：16．

[5]Soto-Cerrato V，Vi?als F，Lambert J R，et al．Prodigiosin induces the proapoptotic gene NAG-1 via glycogen synthase kinase-3beta activity in human breast cancer cells．Mol Cancer Ther，2007，6（1）：362-369．

[6]Dan S，Yoshimi H，Okamura M，et al．Inhibition of PI3K by ZSTK474 suppressed tumor growth not via apoptosis but G0／G1 arrest．Biochem Biophys Res Commun，2009，379（1）：104-109．

（潘子昂編輯）

Effect of AKT-GSK-3β Signaling Pathway on Down-regulating Chemo-sensitivity of Hepatocellular Carcinoma

GUO Jia-pei，WU Jing-hua，LI Lei-lei，GUO Bin
（Clinical Laboratory of Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology，Tangshan 063000，China）

ObjectiveTo investigate the effects of AKT-GSK-3β signaling pathway on hepatocellular carcinoma cell apoptosis after chemotherapy．MethodsCell culture and western blot were used to detect apoptosis of hepatocellular carcinoma cells induced by oxaliplatin，and the relationship between apoptosis and AKT-GSK-3β signaling pathway activation were analyzed．Through inhibiting signaling pathway specifically，regulation effects of AKT-GSK-3β signaling pathway on sensitivity of hepatocellular carcinoma cells to chemotherapy was verified．ResultsHepatocellular carcinoma cells appeared apoptosis after chemotherapy，showing increase of BAX protein and decrease of Bcl-2 protein as well as phosphorylation of AKT-GSK-3β signaling pathway．However，Hepatocellular carcinoma cells apoptosis increased obviously after chemotherapy．ConclusionAKTGSK-3β signaling pathway could down-regulate sensitivity of hepatocellular carcinoma cells to chemotherapy and may have closely relationship with therapeutic effect．

AKT-GSK-3β； Hepatocellular carcinoma； Chemotherapy； Apoptosis； Sensitivity

10．11748／bjmy．issn．1006－1703．2016．03．025

2015-10-09；

2015-11-22

郭佳培（1991—），女，在讀醫(yī)學(xué)碩士。研究方向：腫瘤免疫。

吳景華（1976—），醫(yī)學(xué)博士，副教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：腫瘤免疫。E-mail：tswujinghua＠163．com