周齊洋，張娜娜

（1．江蘇省醫(yī)療器械檢驗所，江蘇南京210012；2．蘇州長光華醫(yī)生物醫(yī)學工程有限公司，江蘇蘇州215163）

丙型肝炎病毒抗體雙抗原夾心法化學發(fā)光檢測的應用

周齊洋1，張娜娜2

（1．江蘇省醫(yī)療器械檢驗所，江蘇南京210012；2．蘇州長光華醫(yī)生物醫(yī)學工程有限公司，江蘇蘇州215163）

目的探討丙型肝炎病毒抗體雙抗原夾心法化學發(fā)光檢測的應用。方法利用重組融合HCV抗原分別標記生物素及吖啶酯，建立起雙抗原夾心法化學發(fā)光檢測試劑盒，與間接法同時檢測了866例陰性標本，440例陽性標本，3套BBI陽轉血清盤。結果雙抗原夾心法與間接法靈敏度分別為100%、100%，特異性分別為99．9%、98．7%，特異性差別1．2%（95%可信區(qū)間：0．5%～2．1%），BBI陽轉血清相對敏感性系數(shù)為－1．33。結論雙抗原夾心法特異性及早期感染檢測能力優(yōu)于間接法，將會成為丙型肝炎病毒抗體檢測的主要方法。

丙型肝炎病毒抗體； 雙抗原夾心法； 化學發(fā)光

丙型肝炎病毒（HCV）感染呈世界性分布，我國感染者約有4000萬。丙型肝炎病毒抗體是丙型肝炎病毒感染機體后出現(xiàn)的特異性抗體[1]，目前常用的丙型肝炎病毒抗體（Anti-HCV）檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法、化學發(fā)光法和時間分辨熒光免疫分析法，但均采用間接法檢測，但由于間接法存在假陽性率高的不足，增加了臨床檢驗成本，也造成患者不必要的精神負擔。建立一種高特異性高靈敏性的Anti-HCV檢測方法尤其重要。本文利用重組融合HCV抗原一種標記生物素、一種標記吖啶酯，利用雙抗原夾心原理建立起吖啶酯化學發(fā)光檢測方法，并與間接法化學發(fā)光檢測試劑盒同時檢測866例陰性標本、440例陽性標本及3套陽轉血清盤。研究兩者在特異性、靈敏度及早期感染檢測能力方面的差異。

材料和方法

1 材料

1．1 主要試劑 兩種重組融合HCV抗原（包含core、NS3、NS5片段）購自芬蘭Hytest公司；吖啶酯及生物素購自Sigma公司；化學發(fā)光激發(fā)液1、化學發(fā)光激發(fā)液2及親和素磁顆粒由蘇州長光華醫(yī)生物醫(yī)學工程有限公司提供；間接法化學發(fā)光檢測試劑盒由Abbott公司生產的丙型肝炎病毒抗體測定試劑盒（化學發(fā)光微粒子免疫檢測法）。

1．2 標本來源 標本來源于東南大學醫(yī)學院附屬江陰醫(yī)院、吉林大學第一醫(yī)院、北華大學附屬醫(yī)院3家醫(yī)院，其中陰性標本包含老年人、乙型肝炎病毒陽性、戊型肝炎病毒陽性、梅毒抗體陽性、類風濕患者等具有干擾性質的標本；所有陽性標本來自中檢血清盤及經臨床診斷確認的丙肝患者血清；陽轉血清盤購自BBI公司，CatNo：PHV906、PHV919、PHV924。

2 方法

2．1 吖啶酯標記抗原的制備 取一定量重組融合HCV抗原，采用 0．05mol／L pH9．5 CB調整濃度為1mg／mL；按抗原∶吖啶酯 ＝1∶10～20摩爾比加入已活化吖啶酯，室溫反應0．5～1．0h；將反應液移至透析袋（截留分子量8000～12000），采用0．05mol／L pH9．5 CB透析24h，加入等量甘油，放置－20℃以下保存。

2．2 生物素標記抗原的制備 取一定量重組融合HCV抗原，采用 0．05mol／L pH9．5 CB調整濃度為1mg／mL；按抗體：生物素＝1：10～20摩爾比加入已活化生物素，室溫反應0．5～1．0h；將反應液移至透析袋（截留分子量8000～12000），采用0．05mol／L pH9．5 CB透析24h，加入等量甘油，放置－20℃以下保存。

2．3 操作步驟 第一步反應：將樣本和生物素標記重組丙型肝炎抗原及吖啶酯標記重組丙型肝炎抗原進行反應后，形成抗原－抗體－抗原夾心復合體。再加入鏈霉親和素磁微粒，復合體在鏈霉親和素和生物素相互作用下形成固相。再將反應液置于一個磁場內，檢測中的磁微粒將被吸附，通過洗滌，將未結合物沖洗除去；然后，注入化學發(fā)光激發(fā)液1及化學發(fā)光激發(fā)液2，檢測其化學發(fā)光光子強度，根據(jù)臨界值判定樣本中是否含有Anti-HCV，樣本的RLU值隨Anti-HCV濃度的增加而升高。

2．4 特異性及靈敏度試驗方法 采用兩種檢測方法對所選擇標本進行同步盲法檢測，對兩者不符的標本采用RIBA確認試劑進行確認。試驗結束后揭盲，對試驗結果采用EXCEL軟件進行比對分析統(tǒng)計，計算兩種方法臨床診斷靈敏度及特異性、兩者之間差別及95%可信區(qū)間[2]。

2．5 陽轉血清相對敏感性系數(shù)試驗方法 采用本方法對3套陽轉血清盤進行檢測，根據(jù)檢測結果，并參照WHO對陽轉血清相對敏感系數(shù)的計算方法來評估本方法對HCV早期感染的能力。

結 果

1 特異性及靈敏度

采用兩種檢測方法同步對866例陰性標本，440例陽性標本進行檢測，對11例不確定標本，均采用RIBA確認試劑進行確認為陰性。結果顯示在診斷靈敏度上，兩種檢測方法無差別，由于特異性的置信限不包括“0”，有證據(jù)說明兩種檢測方法特異性有差別。并采用EXCEL軟件統(tǒng)計分析兩種方法特異性及靈敏度、兩者的差別及95%可信區(qū)間。結果見表1。

表1 兩種檢測方法結果統(tǒng)計情況

2 陽轉血清相對敏感性系數(shù)

以Abbott公司的Architect HCV為對照，分析本方法的陽轉血清相對敏感性系數(shù)。對每一陽轉血清盤，對照試劑檢出的第一份系列血清定為0，將本方法檢測結果與其作對比，確定本方法的第一份系列血清與對照試劑的0血清的位置關系。對任一陽轉血清盤而言，若本方法檢測出第一份為陽性的樣品的位置在對照試劑的0血清位置前2位，則該轉血清盤的相對敏感性系數(shù)為-2。反之，若在對照試劑的0血清位置后3位，則相對敏感性系數(shù)為＋3。求出3套血清盤相對敏感性系數(shù)的均值，以此來評價試劑對窗口期樣品的檢測能力，數(shù)值越小，試劑越靈敏。統(tǒng)計結果為-1．33。實驗結果見表2。

表2 陽轉血清相對敏感系數(shù)統(tǒng)計結果

討 論

丙型肝炎呈全球性流行，全球HCV的感染率約為3%，我國一般人群 Anti-HCV陽性率為3．2%，丙型肝炎慢性化率為50%～85%，慢性丙型肝炎的肝硬化率為10%～15%，失代償期肝硬化的10年生存率僅為25%，慢性丙型肝炎導致的肝硬化患者中，每年肝癌發(fā)生率為1%～7%[3]。HCV常呈隱匿性感染，容易被忽視。一旦感染HCV，病程越長，越難治愈；慢性丙型肝炎可逐漸進展成肝硬化、肝細胞癌等嚴重肝臟疾患，從而造成沉重的身心負擔，故應重視丙型肝炎的篩查[4]。丙型肝炎已有有效的治療藥物，如能及早治療，可防止其發(fā)展為肝硬化和肝癌。對丙型肝炎早期篩查、早期診斷、早期治療十分重要[5]。因此，研制一種高靈敏度、高特異的試劑盒對丙型肝炎的防治有著重要的意義。

目前臨床檢測 Anti-HCV方法原理多為間接法[6]，即采用了抗人IgG與示蹤物聯(lián)接作為標志物，此種檢測原理由于血清中IgG含量高，故少量的非特異吸附即易造成假陽性結果，血清中類風濕因子等也可能干擾檢測結果。雖然，目前間接法檢測技術已更新至第三代，其特異性達到99%以上，但仍有研究表明，在Anti-HVC流行率＜10%的免疫活性人群中，HCV EIA2．0和HCV ELISA3．0的假陽性率平均約為35%（15%～60%）[7]。雙抗原夾心法由于采用兩種重組抗原分別標記生物素及吖啶酯，從而有效杜絕IgG及類風濕因子的影響，從而提高臨床診斷特異性。從本文實驗結果也證實了此差別。

雙抗原夾心法檢測的是血清中總抗體，包含IgG抗體和IgM抗體，且不受不同患者對HCV反應時產生不同IgG亞型的限制，這有別于多數(shù)間接法僅能檢測IgG抗體。Anti-HCV IgG在丙型肝炎患者血清中出現(xiàn)較晚。雖然Anti-HCV IgM不僅存在急性HCV感染者，而且在慢性HCV感染者亦有較高檢出率，不能作為急性感染的指標，但IgM檢測有利于急性感染的輔助診斷，因此雙抗原夾心法有利于提高早期感染的檢出率，縮短病毒感染檢出的“窗口期 ”[8-10]。

本文研究表明，丙型肝炎病毒抗體雙抗原夾心法的特異性要優(yōu)于傳統(tǒng)間接法檢測，其早期感染檢測能力同樣優(yōu)于間接法，將會成為丙型肝炎病毒抗體檢測的主要方法學。

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[2]楊有業(yè)，張秀明．臨床檢驗方法學評價．人民衛(wèi)生出版社，2008：296-312．

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（潘子昂編輯）

Application of Double Antigen Sandwich Chemiluminescence Detection for Hepatitis C Virus Antibody

ZHOU Qi-yang，ZHANG Na-na
（Jiangsu Institute of Medical Device Testing，Nanjing 210012，China）

ObjectiveTo explore the application of double antigen sandwich chemiluminescence detection for hepatitis C virus（HCV）antibody．MethodsTwo recombinant fusion antigens of HCV were labeled with biotin and acridine ester respectively to establish double antigen sandwich method for chemiluminescence detection．866 cases of negative samples，440 cases of positive samples，3 sets of BBI blood liquidation were detected by method developed in this study and indirect method respectively．ResultsBoth double antigen sandwich method and indirect method had a high sensitivity of 100%，and the specificity of double antigen sandwich method was 99．9%，and indirect method was 98．7%，which is 1．2%lower than that of double antigen sandwich method（95%confidence interval：0．5-2．1%）．The Relative sensitivity coefficient of BBI turn-positive serum was-1．33．ConclusionThe specificity and early detection ability of double antigen sandwich method are super than indirect method，and it will become the main detection method for hepatitis C virus antibody detection．

Hepatitis C virus antibody； Double antigen sandwich method； Chemiluminescence

10．11748／bjmy．issn．1006－1703．2016．03．027

2015-10-22；

2015-12-14