沈俊炳

(詔安縣質(zhì)量計量檢驗檢測所，福建 詔安 363500)

毛細管電泳電化學發(fā)光檢測魚露中的L-羥脯氨酸含量的不確定度評定

沈俊炳*

(詔安縣質(zhì)量計量檢驗檢測所，福建 詔安 363500)

為驗證檢驗機構(gòu)的毛細管電泳檢測能力及進行毛細管電泳檢測能力比對，按照JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》、CNAS-GL05:2011《測量不確定度要求的實施指南》及CNAS-GL06：2006《化學分析中不確定度的評估指南》，對新開發(fā)的毛細管電泳電化學發(fā)光檢測魚露中的L-羥脯氨酸含量的不確定度進行評定。不確定度來源主要有標準溶液、移取定容體積、試樣重復(fù)測定、回收率和最小二乘法擬合標準曲線。結(jié)果表明，該方法中最小二乘法擬合標準曲線求試樣含量引入的不確定度uc對合成標準不確定度的貢獻最大，其次為試樣重復(fù)測定引入的不確定度urep，而L-羥脯氨酸標準溶液配制過程中引入的不確定度us也不容小覷。上述3個方面應(yīng)該在實驗過程中加以注意，以提高實驗的準確度。本研究對各個不確定度分量進行量化，得出魚露中的L-羥脯氨酸含量為(50.44±8.80) mg/L，k=2.576。研究結(jié)果為L-羥脯氨酸含量測定新方法的質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)。[中國漁業(yè)質(zhì)量與標準，2016,6(4):31-36]

毛細管電泳；電化學發(fā)光；L-羥脯氨酸；不確定度；魚露

L-羥脯氨酸，又稱順式-4-羥基-L-脯氨酸，分子式C5H9NO3，是一種亞氨基酸[1]，白色片狀結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，呈苦味中的獨特甜味，可作香料。L-羥脯氨酸是膠原蛋白的主要成分，廣泛存在于動物皮[2]、膠原海綿[3]、魚皮[4]等水解液中，其他普通蛋白質(zhì)中含量極少[5]，是動物水解蛋白的指示性氨基酸[6]，檢測其在食品中的含量，可用于判定在食品加工過程中是否違法添加了動物水解蛋白以提高蛋白質(zhì)含量[7-9]。因此要求L-羥脯氨酸的檢測方法具有更高的準確度。

不確定度是表征合理地賦予被測量之值的分散性，與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)[10]。不確定度評定作為一種科學的方法，不但能給出測量結(jié)果可信度，還能有效地評定測量結(jié)果的質(zhì)量[11]。同時不確定度評定也使得國內(nèi)國際間不同檢測機構(gòu)的實驗數(shù)據(jù)得以共享[12]。因此，不確定度評定在各個領(lǐng)域都倍受關(guān)注[13-15]。

目前有的L-羥脯氨酸的檢測方法主要有分光光度法、高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法、氨基酸自動分析儀法及毛細管電泳法[16-17]。但目前國家只頒布了GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量測定》[18](國家標準)和SN/T 3929—2014《出口食品中L-羥脯氨酸的測定 液相色譜-質(zhì)譜法/質(zhì)譜法》[19](進出口行業(yè)標準)這兩個標準。而上述兩個標準并不適用于水產(chǎn)品中L-羥脯氨酸含量的檢測。因此開發(fā)適用于水產(chǎn)品中L-羥脯氨酸含量檢測的標準方法尤為重要。同時為驗證檢驗機構(gòu)的毛細管電泳檢測能力及進行毛細管電泳檢測能力比對，本研究以新開發(fā)的魚露中L-羥脯氨酸含量的毛細管電泳電化學發(fā)光檢測方法為例，按照JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[20]、CNAS-GL05:2011《測量不確定度要求的實施指南》[21]及CNAS-GL06:2006《化學分析中不確定度的評估指南》[22]，建立了毛細管電泳電化學發(fā)光檢測魚露中L-羥脯氨酸含量的不確定度測量模型，分析各個不確定度來源，量化各個不確定度分量，最終對測量結(jié)果進行不確定度分析和評定。不僅驗證了不同檢驗機構(gòu)的毛細管電泳檢測能力，也為新開發(fā)的毛細管電泳電化學發(fā)光檢測魚露中L-羥脯氨酸含量檢測方法的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)，同時也為開發(fā)其他毛細管電泳電化學發(fā)光檢測方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

MPI-A型毛細管電泳電化學發(fā)光檢測儀(西安瑞邁分析儀器有限責任公司)；75 cm×25 μm (id.)無涂層石英熔融毛細管(永年縣銳灃色譜器件有限公司)；MS105DU電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；1～10 mL移液器(德國Eppendorf公司)；pH211C酸度計(意大利HANNA公司)；KQ2100E超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司)。

氯化三(2,2′-聯(lián)吡啶)釕(II)六水合物(Ru(bpy)32+)、L-羥脯氨酸(美國Sigma-Aldrich公司，純度≥99%)；NaH2PO4、Na2HPO4、NaOH、HCl(國藥集團化學試劑有限公司，AR)。

實驗用水均為純水，魚露購自超市。

1.2 實驗方法

1.2.1 L-羥脯氨酸標準溶液配制

L-羥脯氨酸標準儲備溶液(1 000 mg/L)：準確稱取0.100 0 g L-羥脯氨酸標準品(精確到0.1 mg)，用純水溶解并定容至100 mL。

L-羥脯氨酸標準工作溶液：用純水按比例稀釋標準儲備溶液，分別配制成10、25、50、100、250、500 mg/L的標準工作溶液。

1.2.2 試樣處理

魚露用純水稀釋后即可進行測定。

1.3 毛細管電泳電化學發(fā)光檢測條件

檢測條件：光電倍增管高壓為800 V；檢測電位為1.20 V；Ru(bpy)32+濃度為6 mmol/L；緩沖溶液濃度為50 mmol/L PBS；緩沖溶液pH為8.0。進樣條件：10 kV×12 s。分離條件：運行高壓為14 kV；運行緩沖溶液濃度為50 mmol/L；運行緩沖溶液pH為8.5。所有進入毛細管的溶液均需超聲波脫氣，并用0.22 μm醋酸纖維膜過濾。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學模型

試樣中L-羥脯氨酸含量的計算公式見式(1)。

式(1)

式(1)中：X為試樣中的L-羥脯氨酸含量(mg/L)；c為試樣稀釋液中的L-羥脯氨酸含量(mg/L，根據(jù)標準曲線計算得出)；V為移取的試樣體積(mL)；n為試樣稀釋液體積(mL)。

2.2 不確定度來源分析

經(jīng)過對測定步驟和2.1中數(shù)學模型進行分析，影響L-羥脯氨酸檢測結(jié)果的不確定度因素主要有：L-羥脯氨酸標準溶液配制過程中引入的不確定度、試樣移取定容過程中引入的不確定度、試樣重復(fù)測定產(chǎn)生的不確定度、L-羥脯氨酸回收率引入的不確定度和最小二乘法擬合標準曲線求試樣含量引入的不確定度。

2.3 不確定度分度量化

2.3.1 L-羥脯氨酸標準溶液配制過程中引入的相對標準不確定度us

2.3.1.1 L-羥脯氨酸標準品純度引入的相對標準不確定度us1分析

2.3.1.2 L-羥脯氨酸標準品稱量引入的相對標準不確定度us2分析

2.3.1.3 L-羥脯氨酸標準溶液配制過程中器具引入的相對標準不確定度us3分析

本實驗過程中配制L-羥脯氨酸標準溶液使用容量瓶和移液器所引入的不確定度分量主要有3個方面：1)使用的容量瓶和移液器體積校準不確定引入的標準不確定分量us3(1)；2)使用的容量瓶和移液器重復(fù)性引入的標準不確定分量us3(2)；3)配制過程中L-羥脯氨酸標準溶液溫度與檢定標準溫度(20 ℃)不同引入的標準不確定分量us3(3)。3個不確定度分量的計算如下。

表1 容量瓶和移液器的相對標準不確定度

Tab.1 The relative standard uncertainty of volumetric flask and pipette

器具Container容量允差/容量允許誤差Tolerance/Allowableerrorus3(1)us3(2)us3(3)合成相對標準不確定度us3(Vr)Relatedcombineduncertainty100mL容量瓶(A級)±0．10mL0．04080．00040．0606us3(V100)=0．000710mL容量瓶(A級)±0．020mL0．00820．00070．0061us3(V10)=0．00101mL移液器±1．0%0．00410．00290．0006us3(V1)=0．00512．5mL移液器±0．5%0．00510．00120．0015us3(V2．5)=0．00225mL移液器±0．6%0．01220．00120．0030us3(V5)=0．0025

2.3.2 試樣移取定容過程中引入的相對標準不確定度uv

2.3.3 試樣重復(fù)測定產(chǎn)生的相對標準不確定度urep

按上述實驗方法進行試樣測定，試樣平行檢10次，測定結(jié)果，計算結(jié)果見表2。

表2 試樣中L-羥脯氨酸含量重復(fù)檢測結(jié)果

Tab.2 L-hydroxyproline content of the sample parallel test

平行實驗/(mg·L-1)Paralleltest12345678910平均值/(mg·L-1)Averagevalue相對標準偏差/%RSD50．06251．55848．42452．02251．29852．30251．47848．72050．27848．24450．443．03

根據(jù)A類不確定度評定，計算出相對標準不確定度如下：

=0.009 6(n=10)。

2.3.4 L-羥脯氨酸回收率引入的相對標準不確定度urec

由于是新開發(fā)的L-羥脯氨酸檢測方法，方法的回收率是否符合相關(guān)要求也是需要考慮的重點，需進

行不確定度評定。本實驗根據(jù)測定試樣的L-羥脯氨酸含量，分別進行了10、20、30 mg/L 3個水平的添加，每個添加水平做4次平行實驗，計算回收率，計算結(jié)果見表3。

=0.005 2(n=12)。

顯著性檢測是用來確定平均回收率是否與理想狀態(tài)100%回收有顯著性差異。采用t-檢驗確定平均回收率與理想狀態(tài)100%回收是否有顯著性差異。假設(shè)顯著性水平α=0.05，查表得n-1自由度的雙邊臨界值tcrit=2.201(n=12)。

表3 試樣回收率測定結(jié)果

Tab.3 Recovery test results of samples

編號No．加標量/(mg·L-1)Addingstandard回收量/(mg·L-1)Recovery回收率/%Recoveryrate平均回收率/%Averagerecoveryrate1109．7897．802109．8998．903109．7297．204109．7797．7052020．02100．1062019．8999．4572020．05100．2597．8182019．7698．8093028．9196．37103028．7898．09113028．6395．43123029．0496．80

平均回收率與理想狀態(tài)100%回收有顯著性差異，必須考慮L-羥脯氨酸回收率引入的不確定度。

2.3.5 最小二乘法擬合標準曲線求試樣含量引入的相對標準不確定度uc

將10、25、50、100、250、500 mg/L的標準溶液工作液各測定3次，得到相應(yīng)的電化學發(fā)光強度，其結(jié)果見表4。

根據(jù)表4的測定數(shù)據(jù)，用最小二乘法擬合求出標

表4 L-羥脯氨酸標準溶液質(zhì)量濃度和相應(yīng)的電化學發(fā)光強度

Tab.4 L-hydroxyproline standard mass concentration and corresponding ECL intensity

質(zhì)量濃度/(mg·L-1)MassconcentrationI1I2I3I1032．131．633．132．32581．982．782．182．250164．5167．8167．4166．6100330．1322．7328．7327．2250845．2840．9837．6841．25001744．21759．61740．81749．7

注：I為實驗條件下的L-羥脯氨酸標準溶液的電化學發(fā)光強度。

對試樣進行10次平行測定，測得試樣檢測液中的L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度為25.22 mg/L，則魚露中的L-羥脯氨酸含量為50.44 mg/L。標準曲線擬合的相對標準不確定度如下：

2.3.6 計算相對合成標準不確定度及擴展不確定度

不確定度各分量按正態(tài)分布處理，取置信因子k=2.576(置信區(qū)間99%)，則擴展不確定度U=c0×k×uc=8.80 mg/L。

2.3.7 不確定度分量比例

圖1 各個不確定度分量分布圖Fig.1 Distribution diagram of each component of uncertainty

通過對魚露中L-羥脯氨酸含量測定過程中各個不確定度來源進行分析，將各個不確定度分量按比例繪制成圖，如圖1所示。由圖1可以看出，最小二乘法擬合標準曲線求試樣含量引入的不確定度uc對合成標準不確定度的貢獻最大，其次是試樣重復(fù)測定引入的不確定度urep，再者L-羥脯氨酸標準溶液配制過程中引入的不確定度us也不容小覷。

3 結(jié)論

本實驗中，魚露中的L-羥脯氨酸含量為(50.44±8.80) mg/L，k=2.576。新開發(fā)的毛細管電泳電化學發(fā)光檢測魚露中的L-羥脯氨酸檢測方法的準確度得到驗證。通過對實驗過程中的不確定度分析發(fā)現(xiàn)，此新開發(fā)的L-羥脯氨酸檢測方法中最小二乘法擬合標準曲線求試樣含量引入的不確定度uc對合成標準不確定度的貢獻最大，其次是試樣重復(fù)測定引入的不確定度urep，再者L-羥脯氨酸標準溶液配制過程中引入的不確定度us也不容小覷，對此以后改進此新方法的過程中，需要特別注意在測定標準曲線過程中要規(guī)范操作及增加平行實驗次數(shù)。本研究為此L-羥脯氨酸測定新方法的質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)。

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Evaluation of uncertainty in detection of L-hydroxyproline in fish sauce by capillary electrophoresis electrochemiluminescence

SHEN Junbing*

(Zhao’an Institute of Quality Inspection and Metrological Verification, Zhao’an 363500, China)

In order to verify the ability of capillary electrophoresis of the inspection body and compare the ability of capillary electrophoresis, the uncertainty evaluation of the new method for detection of L-hydroxyproline in fish sauce through capillary electrophoresis electrochemiluminescence was conducted in accordance with JJF 1059.1—2012 "Evaluation and Expression of Uncertainty in Measurement", CNAS-GL05:2011 "Guidance on the Application of the Requirements for Measurement Uncertainty" and CNAS-GL06:2006 "Guidance on Evaluating the Uncertainty in Chemical Analysis". After the analysis of L-hydroxyproline measurement, the uncertainty sources included standard solution, pipetting volume by volume, repetitive sample measurement, recovery and least-squares fitting standard curve. The results showed that in the L-hydroxyproline detection method, the uncertaintyucintroduced for the mea-surement of content by the least square method to fit the standard curve contributes highest to combined standard uncertainty, followed by uncertaintyurepintroduced for repeated measurement. Furthermore, the uncertaintyusintroduced for the L-hydroxyproline standard solution preparation process should not be underestimated. Attention should be paid to the above three aspects in the experiment process, in order to improve the accuracy of the experiment. Through each quantified uncertainty components on fish sauce, the results showed that L-hydroxyproline content was (50.44±8.80) mg/L,k=2.576. The research results provide a theoretical basis for the quality control of new determination methods of L-hydroxyproline content. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2016, 6(4):31-36]

capillary electrophoresis; electrochemiluminescence; L-hydroxyproline; uncertainty; fish sauce

SHEN Junbing, cysjbsjb@163.com

2016-04-27；接收日期：2016-06-16

詔安縣質(zhì)量計量檢驗檢測所事業(yè)發(fā)展基金〔2016〕004號

沈俊炳(1989-)，男，碩士，助理工程師，研究方向為食品可追溯體系和食品檢驗質(zhì)量控制，cysjbsjb@163.com

S94

A

2095-1833(2016)04-0031-06