程 莎 高基民

(浙江省立同德醫(yī)院，杭州310012)

ICOS在健康人外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上的生物學(xué)特征初探①

程 莎 高基民

(浙江省立同德醫(yī)院，杭州310012)

目的：研究ICOS在健康人外周血Treg離體培養(yǎng)中的作用，了解mTOR對離體培養(yǎng)Treg ICOS表達(dá)的調(diào)控。方法：MACS分選Treg后經(jīng)anti-CD3+anti-CD28磁珠刺激后第3、7天流式檢測Treg表面ICOS表達(dá)情況；anti-CD3+anti-CD28抗體或anti-CD3+ICOSL-Fc刺激3 d，流式檢測Treg ICOS表達(dá)情況；雷帕霉素處理離體培養(yǎng)Treg，流式分析其對Treg ICOS表達(dá)作用。CFSE標(biāo)記人PBMC細(xì)胞，并與離體培養(yǎng)Treg混合培養(yǎng)，流式檢測Treg的接觸抑制活性。結(jié)果：anti-CD3+anti-CD28磁珠刺激Treg 3 d，ICOS+Treg中活、死細(xì)胞的比例分別為(92.00±2.69)%和(2.20±0.56)%，在ICOS-Treg中比例為(90.30±3.53)%和(1.77±0.78)%，兩者無顯著差異；培養(yǎng)第7天，ICOS+Treg細(xì)胞比例從第3天(40.20±1.83)%降至(11.60± 1.10)%；anti-CD3 +ICOSL-FC刺激Treg 3 d后，ICOS MFI為(403.30±74.42)，anti-CD3+anti-CD28刺激組為(2 410.0±746.4)，anti-CD3+ICOSL-FC刺激后Treg ICOS表達(dá)相比anti-CD3+anti-CD28組顯著下降；雷帕霉素處理離體培養(yǎng)Treg細(xì)胞3 d后， ICOS表達(dá)下調(diào)。此外，雷帕霉素處理的離體培養(yǎng)Treg均能有效抑制PBMC中Tcon的分裂增殖。結(jié)論：ICOS表達(dá)高低對人外周血Treg存活率影響無顯著差異，mTOR信號并非調(diào)控人Treg離體培養(yǎng)ICOS表達(dá)的唯一因素，CD28協(xié)同信號對調(diào)控離體培養(yǎng)人Treg 。表達(dá)比ICOSL信號更為重要，雷帕霉素處理的離體培養(yǎng)人Treg 仍具有細(xì)胞接觸抑制活性。

人調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；雷帕霉素；可誘導(dǎo)共刺激分子；可誘導(dǎo)共刺激分子配體

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)是T細(xì)胞的一個(gè)亞群，約占CD4+T細(xì)胞的5%～10%，表達(dá)CD4、CD25、GITR/AITR、CTLA-4、ICOS和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，其中Foxp3為Treg的主要標(biāo)志蛋白[1,2]。Treg能抑制對自身或外源抗原有害的免疫反應(yīng)，在維持免疫耐受和預(yù)防自身免疫性疾病中起著重要的作用[3]。

可誘導(dǎo)共刺激分子(Inducible costimulator，ICOS)是CD28家族的第3成員，由德國學(xué)者Hutloff于1999年在人活化后的外周血T細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)，由于ICOS-ICOSL提供正向刺激信號，有許多研究通過阻斷ICOS-ICOSL共刺激通路誘導(dǎo)受體對移植物免疫耐受或治療自身免疫病[4，5]。然而，ICOS不但表達(dá)于效應(yīng)T細(xì)胞，在Treg細(xì)胞也有表達(dá)，有研究表明 ICOS缺陷的病人體內(nèi)Treg功能明顯缺陷，且易發(fā)生自身免疫性疾病[6]。在小鼠體內(nèi)，高表達(dá)ICOS的Treg細(xì)胞具有存活率高、接觸抑制功能和分裂增殖能力強(qiáng)的特點(diǎn)[7]。而在小鼠哮喘模型中，ICOS-ICOSL通過調(diào)節(jié)Treg的功能引起呼吸道免疫耐受[8]。并且近年來越來越多的數(shù)據(jù)顯示，ICOS-ICOSL對Treg免疫抑制的功能起著不可或缺的作用[9]。但以往的研究結(jié)果主要集中在闡明ICOS在CD4+T細(xì)胞上的表達(dá)變化及ICOS-ICOSL共刺激途徑對CD4+T細(xì)胞的功能作用。在本研究中觀察健康人外周血中Treg細(xì)胞體外刺激時(shí)ICOS的表達(dá)變化，為ICOS-ICOSL共刺激途徑對Treg功能作用的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑 健康人外周血100 ml/人，共20例，本研究經(jīng)過浙江省立同德醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均知情并簽署知情同意書；淋巴細(xì)胞分離液購于TBD公司；Treg Expansion Kit、CD4+CD25+CD127dim/-Regulatory T Cell Isolation Kit Ⅱ human、MACS Buffer購自美天旎公司；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、IMDM培養(yǎng)基、β-巰基乙醇購于Gibco公司；重組人ICOSL-FC購于R&D公司；重組人IL-2購自Peprotech公司；anti-human CD3單抗和anti-human CD28單抗購自BioLegend公司；PE-anti-human Foxp3、APC-anti-human ICOS、FITC-anti-human CD4、Hu-man Regulatory T cell Staining Kit購自eBios-cience公司；LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit(L/D)購于Invitrogen公司。 儀器：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；FACS Aria流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外周血Treg的體外分離與流式抗體熒光染色 抽取健康人外周血100 ml，密度梯度離心法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞，MASC法分離CD4+CD25+CD127dim/-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，按MACS磁珠分選試劑盒說明書操作。取一小部分分選后的Treg細(xì)胞重懸后加入CD4-FITC、ICOS-APC流式抗體和L/D染料，4℃避光孵育30 min，PBS洗滌2遍。胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子Foxp3按照eBioscience Treg染色試劑盒說明染色，將上述PBS洗滌后的細(xì)胞中加入新鮮配置的破膜固定緩沖液，4℃避光破膜固定2 h，再將細(xì)胞用1×破膜緩沖液洗滌2遍，并重懸于1×破膜緩沖液，加入Foxp3-PE流式抗體4℃避光孵育30～60 min后，1×破膜緩沖液洗滌2遍，細(xì)胞重懸于PBS中,流式細(xì)胞術(shù)檢測磁珠分選效果。

1.2.2 ICOS在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面表達(dá)情況檢測 分選得到的Treg細(xì)胞以1×105/孔接種于96孔板(平底)，培養(yǎng)體積為200 μl/孔。培養(yǎng)液為IMDM完全培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清，青、鏈霉素各50 U/ml，β-巰基乙醇55 μmol/L,IL-2:500 U/ml)。anti-CD3+anti-CD28抗體 MACSiBead與細(xì)胞的比例為 4∶1。分別取體外培養(yǎng)3、7 d Treg細(xì)胞，進(jìn)行CD4、ICOS、L/D和Foxp3染色后，流式細(xì)胞儀檢測ICOS在Treg細(xì)胞表面表達(dá)情況。流式抗體和L/D染料染色方法同上。

1.2.3 ICOSL Fc對離體培養(yǎng)Treg中ICOS表達(dá)的影響 將1 μg/ml anti-human CD3+ 0.5 μg/ml anti-human CD28或1 μg/ml anti-human CD3+ 5 μg/ml ICOSL FC預(yù)包板過夜(4℃)。分選后Treg細(xì)胞以1×105/孔接種于包被有anti-human CD3+anti-human CD28或anti-human CD3+ ICOSL-FC的96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)方法同1.2.2。將實(shí)驗(yàn)分為anti-human CD3+anti-human CD28刺激組和anti-human CD3+ ICOSL-FC刺激組。第3天，收集細(xì)胞，進(jìn)行CD4、ICOS、L/D和Foxp3染色，流式細(xì)胞儀檢測ICOS在Treg細(xì)胞表面表達(dá)情況。

1.2.4 雷帕霉素對外周血離體培養(yǎng)Treg中ICOS表達(dá)的影響 分選后Treg培養(yǎng)方法同1.2.2，anti-CD3+anti-CD28抗體 MACSiBead與細(xì)胞的比例為 4∶1。培養(yǎng)第1天，在上述培養(yǎng)細(xì)胞中加入雷帕霉素，分為雷帕霉素處理組(1、10和100 nmol/L雷帕霉素)和未處理組。收集培養(yǎng)第3天的細(xì)胞，進(jìn)行CD4、ICOS、L/D和Foxp3染色，流式細(xì)胞儀檢測ICOS在Treg細(xì)胞表面表達(dá)情況。

1.2.5 雷帕霉素處理后離體培養(yǎng)的Treg接觸抑制活性檢測 將新鮮分離的PBMC與5 μmol/L CFSE 37℃ 避光孵育9 min，加入1 ml 胎牛血清終止反應(yīng)，并用IMDM完全培養(yǎng)液洗滌2遍后，收集以1 nmol/L雷帕霉素?cái)U(kuò)增培養(yǎng)14 d的Treg，按4∶1、8∶1、16∶1比例(PBMC/Treg)混合，并加入1 μg/ml anti-human CD3刺激4 d。同時(shí)，設(shè)立PBMC單獨(dú)刺激組為陽性對照組，以PBMC未刺激組為陰性對照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 流式細(xì)胞數(shù)據(jù)用Tree star Flowjo 7.5軟件進(jìn)行分析處理，分析后實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ICOS在健康人外周血Treg上的表達(dá)與細(xì)胞生存之間的關(guān)系 為研究健康人外周血Treg在刺激活化后ICOS的表達(dá)與Treg細(xì)胞在體外存活之間的關(guān)系，我們對10例健康人外周血的Treg離體培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，刺激3 d后ICOS+Treg細(xì)胞中活細(xì)胞比例為(92.00±2.69)%，死細(xì)胞比例為(2.20±0.56)%，而ICOS+Treg細(xì)胞中活細(xì)胞比例為(90.30±3.53)%，死細(xì)胞比例為(1.77±0.78)%。ICOS+Treg細(xì)胞與ICOS-Treg細(xì)胞在細(xì)胞存活率上并無顯著差異(圖1A～C)。此外，在新鮮分離的健康人外周血Treg細(xì)胞中，ICOS+Treg與ICOS-Treg細(xì)胞的存活率之間也無顯著性差異(圖1D～F)。

圖1 健康人外周血Treg中ICOS表達(dá)及細(xì)胞存活率檢測Fig.1 Detection of cell survival and ICOS expression level on human blood Treg cellsNote:A-C.The viability of Treg was stimulated with anti-CD3+anti-CD28 beads for 3 days;D-F.The viability of fresh isolated Treg from human PBMC with MACS protocol were analyzed by flow cytomertry.

2.2 ICOS在健康人外周血Treg細(xì)胞表面表達(dá)的時(shí)效性 為研究Treg體外刺激活化后ICOS的表達(dá)變化情況，分選得到的Treg用anti-CD3+anti-CD28磁珠刺激培養(yǎng)后，分別在第3天和第7天檢測Treg細(xì)胞表面ICOS的表達(dá)情況。結(jié)果表明，刺激后的第3天ICOS+Treg比例為(40.20±1.83)%，而在第7天， ICOS+Treg 細(xì)胞比例下降為(11.60± 1.10)%，相對于第3天顯著降低(P=0.000 2)，見圖2。

2.3 ICOSL對健康人Treg細(xì)胞ICOS表達(dá)的影響 分選后的 Treg，分別用anti-CD3+anti-CD28單抗和anti-CD3單抗+ICOSL-FC刺激，第3天流式細(xì)胞術(shù)檢測ICOS表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，刺激3 d后， anti-CD3+anti-CD28刺激組中Treg細(xì)胞ICOS MFI(2 410.0±746.4，n=3)，而加入anti-CD3+ICOSL-FC刺激后Treg細(xì)胞的ICOS MFI為(403.30±74.42，n=3)，相對于anti-CD3+anti-CD28 刺激組顯著下降(P=0.027 7)，見圖3。

2.4 雷帕霉素處理離體培養(yǎng)的Treg接觸抑制功能檢測 將雷帕霉素處理的離體培養(yǎng)Treg細(xì)胞與CFSE標(biāo)記的新鮮分離人外周血PBMC混合刺激培養(yǎng)4 d，分析CFSE陽性細(xì)胞群PBMC中CD4、CD8 T細(xì)胞的分裂增殖峰發(fā)現(xiàn)，未混有Treg的PBMC中，CD4和CD8刺激4 d后均產(chǎn)生3個(gè)分裂峰。在Treg和PBMC混合培養(yǎng)的細(xì)胞中，PBMC細(xì)胞的分裂增殖能力隨著Treg細(xì)胞比例的增加而逐漸降低，1∶4和1∶8的混合比例中，Treg仍然具有較好的抑制活性，尤其對CD8 T細(xì)胞的抑制作用更為顯著(圖4A、B)。

2.5 雷帕霉素處理離體培養(yǎng)的Treg中ICOS表達(dá)的檢測 分選后的Treg離體培養(yǎng)時(shí)經(jīng)1、10、100 nmol/L，雷帕霉素處理，培養(yǎng)3 d后流式細(xì)胞分析發(fā)T現(xiàn)，三種不同的雷帕霉素濃度均能導(dǎo)致離體培養(yǎng)后Treg中ICOS表達(dá)的下調(diào)，但兩者并未呈劑量依賴的關(guān)系。該結(jié)果表明，mTOR信號通路與離體培養(yǎng)中Treg細(xì)胞ICOS表達(dá)有關(guān)，但并非唯一的調(diào)控信號(圖5)。

圖2 離體培養(yǎng)的Treg中ICOS表達(dá)的時(shí)效性Fig.2 Effectiveness of ICOS expression on in vitro cultured Treg cellsNote:A.ICOS expression on purified Treg was stimulated with anti-CD3+anti-CD28 beads on day 3 and day 7；B.The ICOS+ Treg-cell percentage.

圖3 ICOSL Fc對分選后離體培養(yǎng)的Treg中ICOS表達(dá)的影響Fig.3 Influence of ICOS expression on in vitro cultured Treg cells by ICOSL FcNote:A.ICOS expression on purified Treg was stimulated with anti-CD3+anti-CD28 or anti-CD3+ICOSLFc on day 3；B.The MFI of ICOS+ Treg.

圖4 Treg 接觸抑制活性檢測Fig.4 Test of Treg cells suppress capacityNote:A. PBMC proliferation assay；B.Treg/Tcon contact inhibition assay were analyzed by FACS via Rapamycin treatment.

圖5 不同濃度雷帕霉素處理對離體培養(yǎng)Treg細(xì)胞ICOS表達(dá)的影響Fig.5 Influence of ICOS expression on in vitro cultured Treg cells by treatment of different concentration of rapamycin

3 討論

ICOS為兩個(gè)同源二聚體同源跨膜蛋白，分為胞外區(qū)和胞漿區(qū)，其胞外區(qū)能與ICOSL結(jié)合，而胞漿區(qū)含有YMFM基序，能與PI3K激酶結(jié)合，啟動下游信號通路[10-12]。ICOS為誘導(dǎo)表達(dá)，常見于活化后的T細(xì)胞和記憶性T細(xì)胞表面， 而在初始T細(xì)胞表面無表達(dá)。ICOS的配體ICOSL在B細(xì)胞表面持續(xù)表達(dá)，在單核細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞表面一般為可誘導(dǎo)表達(dá)，且表達(dá)水平較低[13,14]。

目前有關(guān)ICOS與Treg的作用關(guān)系尚未被闡明，Chen等[7]發(fā)現(xiàn)小鼠外周Treg中，存在高表達(dá)ICOS和低表達(dá)ICOS兩種Treg分群，前者能增強(qiáng)Treg細(xì)胞的免疫抑制活性和分裂增殖能力，提高Treg細(xì)胞的存活率。而Ito等[15]發(fā)現(xiàn)在人外周血中胸腺發(fā)育來源天然Treg分為ICOS+和ICOS-兩群，兩類Treg細(xì)胞在接觸抑制功能方面存在不同。而我們也發(fā)現(xiàn)在體外刺激的Treg中也存在ICOS+/ICOS-兩類Treg細(xì)胞，但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)上述兩類Treg的存活率未存在顯著的差異。Chen等[7]在其報(bào)道中雖然指出小鼠外周高表達(dá)ICOS的Treg細(xì)胞與低表達(dá)ICOS的Treg細(xì)胞存在功能差異，但我們并不確定這種差異也存在人外周血Treg。至此，我們的研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證和完善了Ito[15]和Chen[7]這兩個(gè)研究小組的發(fā)現(xiàn)，即小鼠脾臟和淋巴結(jié)Treg細(xì)胞和人外周血Treg細(xì)胞可能存在功能上的差異，并且在體外刺激培養(yǎng)的Treg中也是如此。Hu等[16]發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞中特異性敲除Raptor導(dǎo)致Treg中ICOS表達(dá)下調(diào)，mTORC1對小鼠Treg細(xì)胞的發(fā)育和功能有重要作用。我們對人外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞經(jīng)mTOR抑制劑雷帕霉素處理并離體培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞的ICOS表達(dá)下調(diào)，因此，mTOR信號通路不僅對小鼠脾臟和淋巴結(jié)中Treg細(xì)胞ICOS表達(dá)有關(guān)[17，18]，同樣在離體培養(yǎng)的人外周血Treg中，雷帕霉素能部分抑制Treg細(xì)胞ICOS的表達(dá)，表明除mTOR信號外還有其他的通路參與調(diào)控離體培養(yǎng)人外周血Treg細(xì)胞ICOS的表達(dá)。ICOSL是ICOS的特異配體，Colbeck[19]和Miller[20]等研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，ICOSL/ICOS信號途徑對Treg細(xì)胞抑制功能的發(fā)揮和維持及Treg誘導(dǎo)的腫瘤免疫耐受有重要作用，其具體機(jī)制尚未明確。我們研究發(fā)現(xiàn)ICOSL-Fc代替CD28刺激離體人外周血Treg細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，與CD28刺激組相比，Treg細(xì)胞ICOS表達(dá)下調(diào)，表明雖然ICOSL為ICOS的特異配體，能刺激ICOS的表達(dá)，但與CD28信號相比還不足以完全上調(diào)離體培養(yǎng)的人外周血Treg細(xì)胞ICOS的表達(dá)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)雷帕霉素處理后離體培養(yǎng)的人外周血Treg細(xì)胞仍然具有細(xì)胞接觸抑制活性，且相比CD4 T細(xì)胞，對CD8 T細(xì)胞的抑制作用更為顯著，其原因可能是由于CD8 T細(xì)胞對Treg細(xì)胞更為敏感，另外也可能是健康人PBMC中CD8 T細(xì)胞比例低于CD4 T細(xì)胞所引起的。

綜上所述，ICOS 對調(diào)節(jié)人Treg細(xì)胞功能有重要作用，而有關(guān)機(jī)制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)mTOR信號是離體培養(yǎng)的人Treg細(xì)胞ICOS表達(dá)的重要調(diào)控信號，但并非唯一調(diào)控因素，而ICOS表達(dá)在離體培養(yǎng)的人Treg細(xì)胞存活率無顯著作用，且CD28協(xié)同信號比單一ICOSL信號對ICOS的表達(dá)更為重要。因此，本研究對進(jìn)一步闡明mTOR-ICOS/ICOSL信號在人外周血Treg細(xì)胞中的作用和影響有重要意義，并為推動以ICOS和Treg切入點(diǎn)，對自身免疫性疾病和腫瘤開展靶向治療提供科學(xué)依據(jù)。

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[收稿2015-12-29 修回2016-04-20]

(編輯 倪 鵬)

Role of ICOS on in-vitro cultured human PBMC Treg

CHENG Sha，GAO Ji-Min.

Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou 310012,China

Objective:To investigate the role of mTOR in regulation of ICOS expression in human blood regulatory T cells.Methods:Isolation of Treg cells from human PBMC using MACS beads.We detected the ICOS expression on purified Treg cells and Treg cells viability using flow cytometry in anti-CD3 plus anti-CD28 (antibody or beads) or anti-CD3 plus ICOSL-Fc for 3 days and 7 days.CFSE labeling human PBMC cells and in vitro cultured Treg mixed,Treg contact inhibition activity was detected by flow analysis.Results:After in vitro stimulation of Treg cells in the presence of anti-CD3+anti-CD28 for 3 days,there was no significant statistic difference in viability between ICOS+(92.00±2.69)% and ICOS-(90.30±3.53)% Treg-cells.After cultured for 7 days,the decreased ICOS+Treg cells percentage within total Treg cells from(40.20±1.83)% to (11.60± 1.10)% compared with that of 3 days.Further more,the ICOS expression level between stimulated with anti-CD28 or ICOSL-Fc condition group,compared with the ICOS MFI in the condition of anti-CD3 plus anti-CD28 treatment for 3 days was (2410.0±746.4) obviously higher than (403.30±74.42),that of the group treated with anti-CD3 plus ICOSL-FC.Rapamycin could partially suppress Treg cells ICOS expression,but unaffected the Treg suppression ability.Conclusion:ICOS expression level may not important for in vitro cultured human PBMC Treg cells survival although mTOR signling is important for regulation ICOS expression on in-vitro cultured Treg cells,but the ICOS expression on Treg regulated by multiply signaling pathways.CD28 signaling is the key stimulation factor for ICOS upregulation on in-vitro cultured Treg cells compared to ICOSL signaling.

Human regulatory T-cell；Rapamycin；ICOS；ICOSL

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.005

①本文受浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃(2014KYA237)資助。

程 莎 (1982年-)，女，碩士，檢驗(yàn)師，主要從事調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)育調(diào)控及其在自身免疫性疾病中的作用研究。

及指導(dǎo)教師：高基民 (1964年-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事T淋巴細(xì)胞發(fā)育調(diào)控及其在腫瘤、器官移植和自身免疫性疾病中的作用研究，E-mail：jimingao64@163.com。

R932.1

A

1000-484X(2016)12-1753-05