張 渝，劉玉潔，郭丹妮，覃信梅，韓 愈，李惠敏，秦新民

(1.廣西師范大學生命科學學院，廣西桂林541006；2.廣西師范大學珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護教育部重點實驗室，廣西桂林541006)

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沙田柚WRKY轉(zhuǎn)錄因子的克隆與序列分析

張 渝1，2，劉玉潔1，2，郭丹妮1，2，覃信梅1，2，韓 愈1，2，李惠敏1，2，秦新民1，2

(1.廣西師范大學生命科學學院，廣西桂林541006；2.廣西師范大學珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護教育部重點實驗室，廣西桂林541006)

利用高通量測序技術(shù)對沙田柚自交和異交花柱進行轉(zhuǎn)錄組測序，差異分析得到沙田柚WRKY轉(zhuǎn)錄因子的序列。該基因的全長序列為1 178 bp (GenBank accession No. KU173833)，含有993 bp的開放閱讀框(ORF)可編碼330個氨基酸，編碼蛋白的相對分子質(zhì)量為37.00 ku，理論等電點為5.79。與未授粉的花柱相比，沙田柚異花授粉1、2、3 d花柱中WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的表達量(RPKM)分別為5.67、26.04、17.08；而自花授粉1、2、3 d花柱中WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的表達量(RPKM)分別為15.67、14.96、3.89。氨基酸序列分析表明，該氨基酸序列與甜橙、金桔的同源性分別為98%、97%。系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)沙田柚WRKY轉(zhuǎn)錄因子與甜橙、金桔的親緣關(guān)系很近，屬于一個分支。

沙田柚；WRKY；轉(zhuǎn)錄因子；自交不親和性

沙田柚為蕓香科柑橘屬植物，是配子體自交不親和性的果樹之一。遺傳學方面的研究發(fā)現(xiàn)，自交不親和性是由單一多態(tài)性的位點即S位點的基因所控制。在不同的植物中，人們相繼發(fā)現(xiàn)了多種S決定因子的基因：十字花科等植物中的孢子體自交不親和決定因子基因SCR/SP11(S-locus cystine rich)、SLG(S-linked Glycoprotein)和SRK(S-locus receptor kinase)[1-3]；茄科、薔薇科、車前草科、蕓香科等植物中的配子體自交不親和S基因S-RNase和SLF/SFB(S-locus F-box/S-haplotype specific F-box)[4-7]；罌粟科S糖蛋白介導的特殊的配子體自交不親和S決定因子PrpS和PrsS[8]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)植物自交不親和性是一個復雜的、多基因、多種因子相互協(xié)同作用的結(jié)果，一些非S因子也參與了植物自交不親和過程。如HT-B是首次在花煙草中鑒定的雌蕊表達的非S因子[9]，其功能為破壞花粉管液泡的穩(wěn)定狀態(tài)，導致液泡破裂并將S-RNase釋放到自我花粉管的細胞質(zhì)中[10]。其他的非S因子如花柱120 kD糖蛋白和4936因子也參與了花粉的拒絕反應[11]。另外，一些脅迫誘導基因、轉(zhuǎn)錄因子、鈣離子和激素信號相關(guān)的基因也可能參與自交不親和反應[12]。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是WRKY超家族成員之一，首次從甘薯克隆，后來相繼從野生的燕麥、荷蘭芹和擬南芥中克隆到WRKY cDNAs[13-16]。結(jié)構(gòu)剖析發(fā)現(xiàn)在WRKY轉(zhuǎn)錄因子的N端是WRKY結(jié)構(gòu)域，C端含有1個鋅指結(jié)構(gòu)域，其WRKY結(jié)構(gòu)域能特異性識別下游靶基因的W-box域(含TTGACC/T序列)[14]。大量研究表明，WRKY蛋白在植物的多種生理過程中有重要的調(diào)控作用，如生物、非生物脅迫反應和植物的發(fā)育和物質(zhì)代謝過程，包括毛狀體和種皮的發(fā)育、衰老、生物合成途徑及激素信號的調(diào)節(jié)等[17-19]。

目前，有關(guān)WRKY轉(zhuǎn)錄因子與植物授粉以及自交不親和性的研究報道不多。我們對沙田柚自交和異交花柱進行轉(zhuǎn)錄組測序，通過對所測的Unigenes功能注釋，獲得1個沙田柚WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因；并對其編碼的蛋白質(zhì)進行理化特征，對WRKY轉(zhuǎn)錄因子在沙田柚自交與異交花柱中的表達進行分析，旨在為深入研究WRKY轉(zhuǎn)錄因子的生理功能，以及該WRKY轉(zhuǎn)錄因子與沙田柚自交不親和性的關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為沙田柚自交和異交花柱，采集與處理方法按秦新民等[7]報道進行。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取、建庫和測序

沙田柚總RNA的提取參照改良Trizol法[20]進行，轉(zhuǎn)錄組的建庫和測序參考文獻[7]。

1.2.2 基因序列分析和系統(tǒng)樹構(gòu)建

序列和蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的分析分別采用DNAman、ORF finder、NetPhos2.0、SWISS-MODEL、TMPRED等軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的生物信息學分析

NCBI ORF Finder等軟件的分析結(jié)果表明：沙田柚WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因(ID：Unigene6821_All)全長序列為1 178 bp(GenBank登錄號：KU173833)， 該序列含有一個可編碼330個氨基酸的開放閱讀框(993 bp)(圖1)。

圖1 沙田柚WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因序列和推測的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence of WRKY transcription factor gene and the deduced amino acid sequence in Citus grandis var. Shatinyu

2.2 編碼蛋白的分析及疏水性的預測

在線軟件protparam分析結(jié)果證明該基因編碼的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量(Mr)為37.00 ku，分子式為C1578H2484N456O532S17，等電點pI為5.79。帶負電的氨基酸殘基(Asp+Glu)數(shù)目為45，帶正電的氨基酸殘基(Arg+Lys)數(shù)目為37。蛋白質(zhì)的疏水性分析見圖2。預測該蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為58.57，屬不穩(wěn)定蛋白。

圖2 沙田柚WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白的疏水性分析Fig.2 Hydrophobicity analysing of WRKY transcription factor in Citus grandis var. Shatinyu

2.3 編碼蛋白的功能結(jié)構(gòu)域分析

采用NCBI的Conserved Domain Architecture Retrieval Tool對編碼蛋白進行功能結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)在該蛋白的N端含有一個WRKY結(jié)構(gòu)域(如圖3)。

圖3 沙田柚WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 Conserved domains of WRKY transcription factor in Citus grandis var. Shatinyu

2.4 跨膜結(jié)構(gòu)的預測

跨膜蛋白數(shù)據(jù)庫(TMHMM)預測結(jié)果表明該蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)(圖4)。

圖4 沙田柚WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白的跨膜區(qū)預測Fig.4 Result of TMpred prediction on WRKY transcription factor in Citus grandis var. Shatinyu

2.5 編碼蛋白質(zhì)的磷酸化位點預測

采用NetPhos 2.0 Server分析軟件對WRKY transcription factor基因所編碼的蛋白進行磷酸化預測，發(fā)現(xiàn)分值在0.5以上的可能的磷酸化位點在該多肽鏈中共有31個。其中，色氨酸(Ser)可能的磷酸化位點共有22個(11、13、45、81、85、107、110、111、113、114、131、136、202、243、248、264-267、290、306和309位)；蘇氨酸(Thr)可能的磷酸化位點有6個(46、 115、167、193、199和230位)；酪氨酸(Tyr)可能的磷酸化位點為3個(101、195、270位)。

2.6 編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的預測

Predict protein分析的結(jié)果表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白的二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占10.00%、β-折疊為6.97%、無規(guī)則卷曲所占比例最高為83.03%。

編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)SWISS-MODEL軟件預測的結(jié)果表明，該蛋白的單體結(jié)構(gòu)包含了1個α-螺旋和5個β-折疊結(jié)構(gòu)，其余的為無規(guī)則卷曲(圖5)。

圖5 沙田柚WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白的三級結(jié)構(gòu)Fig.5 The tertiary structure of protein in Citrus grandis var. Shatianyu

2.7 同源性分析

將沙田柚WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因編碼的氨基酸與GenBank數(shù)據(jù)庫中11種植物的WRKY蛋白的氨基酸序列進行序列同源性分析，結(jié)果表明沙田柚WRKY轉(zhuǎn)錄蛋白的氨基酸與甜橙和金桔的同源性分別為98%和97%。運用DNAman軟件基于序列的同源性構(gòu)建系統(tǒng)樹，結(jié)果表明沙田柚WRKY轉(zhuǎn)錄因子與甜橙(Citrussinensis， XP_006481203)和金桔(C._japonica，AKA59519)的親緣關(guān)系很近，屬于一個分支(圖6)。

Unigene6821_All(沙田柚，KU173833)， C._sinensis(甜橙，XP_006481203)， C._japonica(金桔，AKA59519)，Solanum tuberosum (馬鈴薯，NP_001275414)， Solanum lycopersicum (番茄， NP_001266272)， Prunus_mume (梅，XP_008244778)， Pyrus_bretschneideri(梨，XP_009372032)， Malus_domestica(蘋果， XP_008388360)， Nicotiana_sylvestris(美花煙草，XP_009793854)， Nicotiana_tomentosiformis(絨毛煙草，XP_009586653)，Glycine soja (野生大豆， KHN42136)， Glycine max(大豆， XP_006599732)圖6 基于氨基酸序列的WRKY轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of transcription factor

3 討論

植物自交不親和是多基因相互協(xié)同作用的過程，除了雌蕊和雄蕊決定因子外，其他一些基因如NADPH氧化酶、DELLA、鈣離子依賴性的蛋白激酶、鈣調(diào)蛋白等基因也參與自交不親和過程[21-22]。WRKY家族是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，通過一系列的信號轉(zhuǎn)導調(diào)控參與了植物體內(nèi)許多生理過程，在植物的抗逆反應、抗病性以及生長發(fā)育等方面均表現(xiàn)出重要的調(diào)控作用[23-24]。在植物生殖方面，Guan等發(fā)現(xiàn)擬南芥的WRKY34和WRKY2轉(zhuǎn)錄因子在花粉的發(fā)育、萌發(fā)和花粉管的生長中起著重要的作用，WRKY34和WRKY2的基因突變會造成花粉的成活力下降，影響了花粉的萌發(fā)和花粉管的生長[25]。此外，AtWRKY10在擬南芥中還具有調(diào)控胚乳增值的功能[26]。

本文克隆的WRKY轉(zhuǎn)錄因子在沙田柚自交花柱和異交花柱中的表達有較為明顯的差異：在未授粉花柱中其表達量(RPKM)為0.257，自花授粉1、2、3 d花柱中的表達量(RPKM)分別為15.67、14.96、3.89，在自花授粉1 d迅速升高，隨后逐步降低。而在異交授粉過程中該WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達模式與自花授粉花柱不同，在異花授粉1、2、3 d花柱中基因的表達量(RPKM)則分別為5.67、26.04和17.08。異花授粉過程中除了第1天花柱中該WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達量比自花授粉1 d花柱低外，異花授粉2、3 d花柱中該WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達量則明顯高于自花授粉花柱。此外，沙田柚無論自花授粉或異花授粉后花柱中該WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達均顯著提高。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子還參與植物的衰老過程，Robatzek等[27]發(fā)現(xiàn)AtWRKY6與擬南芥葉片的衰老有關(guān)，李歡等[28]發(fā)現(xiàn)NtWRKY40a與多花水仙花瓣衰老過程相關(guān)。形態(tài)學觀察沙田柚自花授粉后2～3 d花粉管停止生長，花柱隨后衰老脫落[29]。沙田柚自花授粉花柱中WRKY轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄水平在授粉的第2、3天明顯低于異花授粉花柱，與花柱的衰老過程相關(guān)。但該WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因與沙田柚自交不親和性的關(guān)系尚待進一步研究。

[1] PAETSCH M， MAYLAND-QUELLHORST S， NEUFFER B. Evolution of the self-incompatibility system in the Brassicaceae, identification of S-locus receptor kinase(SRK) in self-incompatible Capsella grandiflora[J]. Heredity， 2006，97：283-290.

[2] SHIBA H， PARK J I， SUZUKI G， et al. Duplicated SP11genes produce alternative transcripts in the S15 haplotype ofBrassicaoleracea[J]. Genes and Systems， 2004，79：87-93.

[3] SHIMOSATO H， YOKOTA N， SHIBA H， et al. Characterization of the SP11/SCR high-affinity binding site involved in self/nonself-recognition in brassica self-incompatibility[J]. The Plant Cell， 2007，19：107-117.

[4] ANDERSON M A， CORNISH E C， MAU S L， et al. Cloning of cDNA for a stylar glycoprotein associated with expression of self-incompatibility inNaicotianaalal[J]. Nature，1986，321：38-44.

[5] HUA Z， MENG X， KAO T H. Comparison of Petunis inflata S-locus F-box protein(Pi SLF) with Pi SLFlike proteins reveals its unique function in S-RNase based self-incompatibility[J]. The Plant Cell， 2007：19：3593-3609.

[6] VAUGHAN S P， RAMANE H， WATARI A， et al. The S haplotype-specific F-box protein gene， SFB， is defective in self-compatible haplotypes ofPrunusaviumandP.mume[J]. The Plant Journal， 2004，39：573-586.

[7] 秦新民，張渝，劉玉潔，等.沙田柚S-RNase基因的克隆及序列分析[J].廣西師范大學學報(自然科學版)，2015，33(1)：139-145.

[8] DE GRAFF B H， VATOVEC S， JUAREZ-DIAZ J A， et al. The Papaver self-incompatibility pollen S-determinant， PrpS， function inArabidopsisthaliana[J]. Current Biology， 2012，22：154-159.

[9] MCCLURE B， MOU B， CANEVASCINI S， et al. A small asparagine-rich protein required for S-allele-specific pollen rejection in Nicotiana[J]. Proc Natl Acad Sci USA ，199，96：13548-13553.

[10] GOLDRAIJ A， KONDO K， LEE C B， et al. Compartmentalization of S-RNase and HT-B degradation in self-incompatible Nicotiana[J]. Nature， 2006，439：805-810.

[11] NATHAN HANCOCK C， KENT L， MCCLURE B A. The stylar120 kDa glycoprotein is required for S-specific pollen rejection in Nicotiana[J]. Plant J， 2005，43：716-723.

[12] DISTEFANO G， CARUSO M， LA MALFA S， et al. Histological and molecular analysis of pollen-pistil interaction in Clementine[J]. Plant Cell Rep， 2009，281：439-1451.

[13] ISHIGURO S， NAKAMURA K. Characterization of a cDNA encoding a novel DNA-binding protein， SPF1， that recognizes SP8 sequences in the 5’upstream regions of genes coding for sporamin and b-amylase from sweet potato[J]. Mol Gen Genet， 1994，244：563-571.

[14] RUSHTON P J，MACDONALD H， HUTTLY A K， et al. Members of a new family of DNA-binding proteins bind to a conserved cis-element in the promoters of a-Amy2 genes[J]. Plant Mol Biol， 1995，29：691-702.

[15] RUSHTON P J， TORRES J M， WERNERT P， et al. Interaction of elicitor-induced DNA binding proteins with elicitor response elements in the promoters of parsley PR1 genes[J]. EMBO J， 1996，15：5690-5700.

[16] DE PATER S， GRECO V， PHAM K， et al. Characterization of a zinc-dependent transcriptional activator from Arabidopsis[J]. Nucleic Acids Res， 1996，24：4624-4631.

[17] BAKKHI M， OELMULLER R. WRKY transcription factors： Jack of many trades in plants[J]. Plant Signaling and Behavior， 2014， 9(2)： e27700.

[18] 宋鈺，荊邵娟，余迪求.水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因功能研究進展[J]. 中國水稻科學，2009，23(5)：447-455.

[19] ZHOU X， JIANG Y， YU D. WRKY22 transcription factor mediates dark-induced leaf senescence in Arabidopsis[J]. Molecules and Cells， 2011， 31： 303-313.

[20] BARIOLA P A， HOWARD C J， TAYLOR C B， et al. The Arabidopsis ribonuclease gene RNS1 is tightly controlled in response to phosphate limitation[J]. The Plant Journal， 1994， 6： 673-685.

[21] ZHANG S W， HUANG G X， DING F， et al. Mechanism of seedlessness in a new lemon cultivar‘Xiangshui’ [Citruslimon(L.) Burm. F][J]. Sex Plant Reprod，2012， 25：337-345.

[22] ZHANG S， DING F， HE X， et al. Characterization of the ‘Xiangshui’lemon transcriptome by de novo assembly to discover genes associated with self-incompatibility[J]. Molecular Genetics and Genomics， 2015， 290： 365-375.

[23] AGARWAL P， REDDY M P， CHIKARA J. WRKY： its structure， evolutionary relationship， DNA-binding selectivity， role in stress tolerance and development of plants[J]. Molecular biology reports， 2011， 38： 3883-3896.

[24] RUSHTON P J， SOMSSICH I E， RINGLER P， et al. WRKY transcription factors[J]. Trends in Plant Science， 2010， 15： 247-258.

[25] GUAN Y， MENG X， KHANNA R， et al. Phosphorylation of a WRKY transcription factor by MAPKs is required for pollen development and function in Arabidopsis[J]. Plos Genetics， 2014， 10：1-12.

[26] LUO M， DENNIS E S， BERGER F， et al. MINISEED3 (MINI3)， a WRKY family gene， and HAIKU2 (IKU2)， a leucine-rich repeat (LRR) KINASE gene， are regulators of seed size in Arabidopsis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2005， 102： 17531-17536.

[27] ROBATZEK S， SOMSSICH I E. A new member of the Arabidopsis WRKY transcripyion factor family， AtWRKY6， is associated with both senescence-and defence-related processes[J]. The Plant Journal， 2001， 2：123-133.

[28] 李歡，何炎森，李科，等. 多花水仙WRKY轉(zhuǎn)錄因子的克隆與序列分析[J]. 熱帶作物學報，2014，35(12)：2378-2383.

(責任編輯 馬殷華)

Cloning and Sequence Analysis of WRKY Transcription Factor fromCitrusgrandisvar.ShatinyuHort

ZHANG Yu1，2， LIU Yujie1，2， GUO Danni1，2， QIN Xinmei1，2，HAN Yu1，2， LI Huimin1，2， QIN Xinmin1，2

(1.College of Life Science， Guangxi Normal University， Guilin Guangxi 541006，China; 2.Key Laboratory of Ecology of Rare and Endangered Species and Environmental Protection(Ministry of Education)， Guangxi Normal University， Guilin Guangxi 541006，China)

In this study， the transcriptome of the self-pollinated styles and cross-pollinated styles ofCitrusgrandisvar.ShatinyuHort were sequenced by high-throughput sequencing technology. WRKY transcription factor gene ofCitrusgrandisvar.ShatinyuHort was obtained through variance analysis method. It is 1 178 bp in length with an open reading frame (ORF) of 993 bp， encoding 330 amino acids with deduced molecular weight of 37.00 ku， and theoretical pI value of 5.79. Compared with un-pollinated styles， the expression (RPKM) of WRKY transcription factor gene is respectively 5.67， 26.04 and 17.08 in 1， 2， 3 days cross-pollinated styles， and expression (RPKM) of the gene is respectively 15.67， 14.96 and 3.89 in 1， 2， 3 days self-pollinated styles. The homology analysis of amino acid sequence indicated that the WRKY transcription factor protein shared higher homology with that ofCitrussinensis(98%) andCitrusjaponica(97%). Phylogenetic analysis revealed that WRKY transcription factor gene showed closer kinship with that ofCitrussinensisandCitrus_japonica，indicating that they belong to the same evolutionary branch．

Citrusgrandisvar.ShatinyuHort; WRKY; transcription factor; self-incompatibility

10.16088/j.issn.1001-6600.2016.03.019

2015-11-27

國家自然科學基金資助項目(31360477)；廣西教育廳項目基金資助(2013YB036)

秦新民(1956—)，男，廣西靈川人，廣西師范大學教授，博士。E-mail：xmqin@mailbox.gxnu.edu.cn

Q946

A

1001-6600(2016)03-0131-07