產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌的篩選鑒定及肉兔飼喂效果研究

■楊佳蕾 張學(xué)雯 李術(shù)娜*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071001)

我國(guó)的畜禽主要食用玉米-豆粕型日糧，這種飼料富含半纖維素。木聚糖是半纖維素的一種主要組成部分，占植物干重的35%，是自然界中第二豐富的物質(zhì)資源[1-3]。研究表明畜禽食用木聚糖后使消化道內(nèi)容物具有較強(qiáng)的黏性，導(dǎo)致畜禽消化道功能減弱，影響畜禽的生長(zhǎng)性能與飼料利用率。動(dòng)物自身分泌的酶不能將攝入的木聚糖完全消化，畜禽會(huì)出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率降低，生長(zhǎng)性能下降等現(xiàn)象。

大量研究證實(shí)，飼糧中輔加相應(yīng)酶制劑，能夠提高動(dòng)物對(duì)飼料的利用率，進(jìn)而提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能。譚權(quán)等[4]在日糧中添加木聚糖酶，發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)肉雞生長(zhǎng)性能；李建民等[5]在日糧中添加混合飼用酶制劑，結(jié)果表明可促進(jìn)肉兔生長(zhǎng)性能；胡向東等[6]在飼糧中添加木聚糖酶，證實(shí)可促進(jìn)生長(zhǎng)豬生長(zhǎng)性能；張仁祥等[7]在日糧中添加復(fù)合酶，證實(shí)可促進(jìn)泰山肉兔增重。但此法成本較高，因此有學(xué)者[8-9]嘗試在日糧中直接添加益生菌、產(chǎn)酶菌的方式來(lái)促進(jìn)動(dòng)物的健康節(jié)糧養(yǎng)殖，這種方法對(duì)菌劑提出了更高的要求：菌株不僅具有明確的產(chǎn)酶能力，還要易于生產(chǎn)，最重要的是要耐受動(dòng)物胃腸道的極端環(huán)境。目前已報(bào)道的木聚糖菌株中[10-11]，學(xué)者們多注重對(duì)酶活力與酶性質(zhì)的研究，缺少對(duì)耐受動(dòng)物胃腸道能力、生產(chǎn)能力及安全性的考察。

本研究通過(guò)篩選耐受動(dòng)物胃腸道環(huán)境的產(chǎn)木聚糖酶的芽孢桿菌，并對(duì)菌株進(jìn)行菌種鑒定與安全性試驗(yàn)，為飼用產(chǎn)酶菌劑的研制開(kāi)發(fā)積累菌種資源，奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌源樣品

用對(duì)角線法采集保定市南市區(qū)牛糞便以及長(zhǎng)期堆放腐敗秸稈、樹葉的10～15 cm深處土壤，大約各取50～100 g保存在采樣袋中，分別編號(hào)并記錄采集地點(diǎn)和時(shí)間。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 菌株篩選培養(yǎng)基

NB培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5.0 g，加水至1 000 ml，pH值7.2～7.4。

NA培養(yǎng)基：為NB培養(yǎng)基加入2%的瓊脂。

產(chǎn)木聚糖酶富集培養(yǎng)基：玉米芯木聚糖10.0 g，氯化鈉5.0 g，蛋白胨3.0 g，硝酸銨2.0 g，磷酸氫二鉀 2.0 g，七水合硫酸鎂 0.2 g，蒸餾水 1 000 ml，pH值自然。

產(chǎn)木聚糖酶分離培養(yǎng)基：瓊脂20.0 g，玉米芯木聚糖10.0 g，硝酸鉀1.0 g，磷酸氫二鉀0.5 g，氯化鈉0.5 g，七水合硫酸鎂0.2 g，蒸餾水1 000 ml，pH值自然。

1.1.2.2 菌株生理生化試驗(yàn)培養(yǎng)基

參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》配制。

1.1.3 試劑

菌種鑒定試劑：根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》配制，包括本尼迪克特氏試劑、格里斯氏試劑、Kovac's試劑、甲基紅試劑、V-P測(cè)定試劑等。

人工胃液、人工腸液參照Galindo A B方法配制[12]。

膽酸鹽溶液配制：在100 mlNB培養(yǎng)基中加入膽酸鹽，配成濃度分別為0.5%、0.3%、0.1%的溶液，115℃滅菌30 min。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)小鼠：購(gòu)買60只健康小白鼠，體重為(20±2)g，購(gòu)回后進(jìn)行3 d預(yù)飼養(yǎng)，然后分組進(jìn)行試驗(yàn)。房間溫度為（20±1）℃，相對(duì)濕度為50%。

肉兔：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本園養(yǎng)殖基地購(gòu)買的60日齡肉兔60只，隨機(jī)分為6組，每組10只，不分公母。采用籠內(nèi)飼養(yǎng)。

肉兔飼料：河北省禽塔集團(tuán)購(gòu)買。

配方見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.1.5 試驗(yàn)菌粉

由河北民得富生物科技有限公司進(jìn)行液體發(fā)酵，噴霧干燥，制成菌粉，最終制得含生物量為1.5×1011cfu/g的試驗(yàn)菌粉。

1.2 產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌的分離篩選

1.2.1 產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌的富集培養(yǎng)與分離

將菌源樣品5.00 g放入含100 ml無(wú)菌水的三角瓶中，充分搖勻使成菌懸液，置80℃水浴20 min。進(jìn)行稀釋涂布，培養(yǎng)到長(zhǎng)出菌落，挑取形態(tài)不同的單菌落編號(hào)保藏于NA培養(yǎng)基斜面上。

1.2.2 產(chǎn)木聚糖酶芽孢細(xì)菌的篩選

分別挑取初篩菌株點(diǎn)種在產(chǎn)木聚糖酶分離培養(yǎng)基平板上，然后37℃培養(yǎng)48 h，用1.0%剛果紅溶液覆蓋培養(yǎng)基平板表面30 min，培養(yǎng)基表面用飽和氯化鈉溶液沖洗，觀察是否存在透明圈，將產(chǎn)生透明圈的菌株進(jìn)行菌種保藏，并編號(hào)。

將初篩菌株接種于NB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)12 h，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，同樣條件培養(yǎng)24 h，取發(fā)酵液10 000 r/min離心5 min，取上清液測(cè)定木聚糖酶活力，選用GB/T23874—2009飼料添加劑木聚糖酶活力方法測(cè)定。

1.3 菌株的種屬鑒定

1.3.1 形態(tài)觀察

從NA培養(yǎng)基斜面上挑取菌株于NB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)24 h，稀釋涂布，倒置培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)。挑取單菌落進(jìn)行制片，革蘭氏染色后觀察單菌體形態(tài)。

1.3.2 生理生化試驗(yàn)

參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版[13]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[14]，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行生理生化鑒定。

1.3.3 菌株DNA提取和16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹繪制

參考李云程等[15]方法進(jìn)行菌株DNA提取和16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹繪制。

1.4 產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌菌株安全性、胃腸道環(huán)境耐受性試驗(yàn)

菌株A-5種子液的制備：從活化好的菌株A-5斜面挑取少量菌苔于NB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h，在超凈臺(tái)中用無(wú)菌水稀釋成濃度為1.0×108cfu/ml的種子液。

菌株的安全性試驗(yàn)：根據(jù)GB159193.3—2003窛氏（KORBOR）法對(duì)菌株A-5進(jìn)行毒性、一般體征和臟器安全性檢測(cè)。試驗(yàn)小鼠灌入劑量分別為0.5、1.0 g/kg和5.0 g/kg體重，連續(xù)喂養(yǎng)14 d。試驗(yàn)開(kāi)始后每天觀察小鼠精神狀態(tài)、是否有中毒癥狀、生長(zhǎng)及排便狀況。在小鼠斷頸處死前12 h對(duì)小鼠進(jìn)行禁食，然后稱量各組小鼠重量，并對(duì)臟器進(jìn)行觀察和稱重。

菌株人工胃液耐受性：將接種量1%菌株A-5種子液接入到人工胃液中，搖床培養(yǎng)并進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

菌株耐膽酸鹽試驗(yàn)：將菌株A-5種子液按1%的接種量接種至膽鹽濃度分別為0.5%、0.3%、0.1%的NB培養(yǎng)基于37℃、200 r/min培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

菌株人工腸液耐受性：將接種量1%菌株A～5種子液按1%的接種量接入到人工腸液中，搖床培養(yǎng)并進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.5 產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌制劑的肉兔飼喂效果

1.5.1 肉兔的分組和飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)設(shè)計(jì)成6組。對(duì)照組：飼喂全價(jià)飼料。試驗(yàn)1～5組在全價(jià)飼料的基礎(chǔ)上添加A-5菌劑：添加量分別為0.10%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%，即分別配制成活菌體生物量為1.500×108、3.750×108、7.500×108、1.125×109、1.500×109cfu/g的飼料。

飼喂：每天飼喂肉兔3次，保持水槽內(nèi)水量充足。預(yù)試期2 d，正試期28 d。

1.5.2 試兔生長(zhǎng)性能測(cè)定

試驗(yàn)前后對(duì)肉兔分別稱重，記錄給料量。計(jì)算肉兔平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）和料重比（F/G）。

平均日采食量[g/(d·只)]=(給料量-剩料量)/(天數(shù)·只數(shù))；

平均日增重[g/(d·只)]=(試驗(yàn)后體重-試驗(yàn)初體重)/(天數(shù)·只數(shù))；

料重比=采食量/增重。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)生長(zhǎng)指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05，表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌的篩選

在篩到的芽孢桿菌中用剛果紅法進(jìn)行初篩，得到有透明圈菌株的48株（見(jiàn)圖1）。篩到的菌株大多數(shù)符合細(xì)菌的菌株形態(tài)。

圖1 菌株剛果紅初篩照片

將在產(chǎn)木聚糖酶發(fā)酵培養(yǎng)基中酶活力較高的14株菌株重新編號(hào)(見(jiàn)表2)，其中菌株A-5酶活力最高，達(dá)到56.848 U/ml。

表2 木聚糖酶活力測(cè)定結(jié)果

2.2 菌株的種屬鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)觀察

圖2 菌株A-5的單菌落及菌體形態(tài)

由圖2可見(jiàn)，菌株A-5表面呈乳白色，光滑，邊緣呈鋸齒狀，菌體成桿狀，革蘭氏染色反應(yīng)呈陽(yáng)性，大小為5.1×0.9 μm。

2.2.2 菌株的生理生化試驗(yàn)

參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行了生理生化鑒定。主要進(jìn)行蔗糖發(fā)酵、V-P試驗(yàn)、甲基紅、乳糖發(fā)酵、明膠液化等20多項(xiàng)試驗(yàn)。以Bacillus subtilis標(biāo)準(zhǔn)菌株36K（登陸號(hào)EF433406）作為對(duì)照，見(jiàn)表3。2.2.3 菌株的16S rDNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

表3 菌株A-5生理生化試驗(yàn)結(jié)果

將菌株A-5的16S rDNA序列結(jié)果放在GenBank上進(jìn)行序列比對(duì)，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（見(jiàn)圖3）。

圖3 菌株A-5的系統(tǒng)發(fā)育樹

經(jīng)過(guò)序列比對(duì)，供試菌株A-5應(yīng)屬于芽孢桿菌屬。另外，供試菌株A-5與Bacillus subtilis36K的標(biāo)準(zhǔn)菌株16S rDNA序列的同源相似性高達(dá)99.95%，因此鑒定此菌株為Bacillus subtilis。

2.3 產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌菌株安全性、胃腸道環(huán)境耐受性試驗(yàn)

2.3.1 菌株安全性試驗(yàn)

小鼠攝入含菌株A-5的菌粉后呼吸平穩(wěn)，沒(méi)有出現(xiàn)中毒癥狀，更無(wú)死亡現(xiàn)象，無(wú)異常表現(xiàn)，生長(zhǎng)狀況良好。經(jīng)過(guò)稱重，對(duì)照組和空白組體重相近。

2.3.2 菌株人工胃液耐受性情況

菌株A-5在pH值為3.0的人工胃液中0、1、2 h后平均存活率分別為100%、95.66%、90.13%，在pH值為2.0的人工胃液中0、1、2 h后平均存活率分別為100%、97.58%、92.07%。

2.3.3 菌株耐膽酸鹽試驗(yàn)情況

菌株A-5在濃度分別為0.1%、0.3%、0.5%膽鹽溶液中，平均存活率分別為91.75%、16.55%、5.00%。

2.3.4 菌株人工腸液耐受性情況

菌株A-5在人工腸液中0、1、2 h后平均存活率分別為100%、92.35%、88.45%。

2.4 產(chǎn)木聚糖酶芽孢制劑的肉兔飼喂效果（見(jiàn)表4）

由表4可知，各試驗(yàn)組平均日增重較對(duì)照組都有提高，料重比較對(duì)照組均有降低，試驗(yàn)1～5組日均增重較對(duì)照組分別提高 5.57%（P＜0.01）、7.92%（P＜0.01）、5.48%（P＜0.01）、4.74%（P＜0.05）和 2.48%（P＞0.05），料重比較對(duì)照組分別降低了5.23%（P＜0.01）、6.09%（P＜0.01）、4.38%（P＜0.05）、4.03%（P＜0.05）和2.01%（P＞0.05）。菌劑添加量太少，產(chǎn)酶量過(guò)低，不能充分酶解飼料中的木聚糖；菌劑添加量太多，會(huì)使動(dòng)物胃本身腸道菌群失衡。所以菌劑添加量太少或太多都不能使試驗(yàn)動(dòng)物生長(zhǎng)性能達(dá)到最佳。

表4 試兔生長(zhǎng)性能變化統(tǒng)計(jì)

3 討論

由于微生物來(lái)源的木聚糖酶是目前工業(yè)生產(chǎn)中木聚糖酶的主要來(lái)源。而微生物來(lái)源的木聚糖酶其產(chǎn)生菌則以芽孢桿菌屬菌株為主。前人已有對(duì)木聚糖酶生產(chǎn)菌株的報(bào)道，如羅玲等[16]獲得一株木聚糖酶生產(chǎn)菌株LMZY為異硫鏈霉菌，酶活力達(dá)3.543 U/ml；戚永躍等[17]得到一株產(chǎn)木聚糖酶菌株50647，鑒定其屬于擬盤多毛孢屬，木聚糖酶的酶活峰值為49.3 U/ml；鐘敏等[18]分離到一株產(chǎn)木聚糖酶的霉菌菌株X-1，木聚糖酶酶活達(dá)724.63 U/ml等。本研究獲得了產(chǎn)木聚糖酶的野生菌株，酶活力較高。但是在飼料中直接添加木聚糖酶產(chǎn)酶菌劑的研究卻未見(jiàn)報(bào)道，此法較酶制劑法成本更低。

目前，越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注腸道微生物結(jié)構(gòu)與動(dòng)物生長(zhǎng)與健康的相關(guān)性的關(guān)系。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在肉兔日糧中添加比例為0.25%木聚糖酶產(chǎn)酶菌劑可以提高肉兔的平均日增重，促進(jìn)肉兔生長(zhǎng)。分析原因可能是隨著菌劑的添加，會(huì)改善試兔的腸道菌群構(gòu)成，同時(shí)，菌劑進(jìn)入兔的腸道環(huán)境后定植并產(chǎn)酶，增加了腸道消化酶的活力，雙方面的共同作用，致使動(dòng)物增加了對(duì)日糧的消化利用能力，最終達(dá)到促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的目的。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)篩選得到一株產(chǎn)木聚糖酶的野生菌株A-5，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌，其產(chǎn)酶活力為56.848 U/ml。在肉兔日糧中添加該菌劑對(duì)肉兔的生長(zhǎng)性能有顯著促進(jìn)作用，研究結(jié)果為肉兔飼料的合理利用、肉兔的高效養(yǎng)殖提供了新的思路。