李 晶 徐洪玉 吳振濤

·論著·

XIAP和caspase-9在尖銳濕疣組織中的表達(dá)

李 晶1徐洪玉1吳振濤2

目的： 檢測(cè)XIAP和caspase-9在CA組織中的表達(dá)。方法： 采用免疫組化方法分別檢測(cè)72例CA組織和20例正常包皮組織中XIAP和caspase-9蛋白的表達(dá)。結(jié)果： CA組織中XIAP蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率(56.94%)高于對(duì)照組(15.00%)，其差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而caspase-9蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率(37.50%)較對(duì)照組(70.00%)低，其差別亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩種蛋白在CA組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.83，P<0.05)。結(jié)論： XIAP抑制caspase-9的活性和表達(dá)，兩者共同參與CA的發(fā)病過(guò)程。

尖銳濕疣； XIAP； caspase-9； 凋亡

尖銳濕疣(Condyloma Acuminatum, CA)是由人乳頭瘤病毒(Human Papilloma virus, HPV)感染引起的一種慢性良性增殖性疾病，臨床上易反復(fù)發(fā)作，平均復(fù)發(fā)率高達(dá)40%[1]。角質(zhì)形成細(xì)胞感染HPV后失去正常凋亡的功能，CA的發(fā)病和復(fù)發(fā)與此密切相關(guān)。其生物學(xué)行為類(lèi)似良性腫瘤。Caspase家族的激活是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的中心環(huán)節(jié)，X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族中抑制凋亡最有力的成員，可直接結(jié)合并抑制凋亡起始因子caspase-9，caspase-9是線粒體凋亡通路中重要的啟動(dòng)者，可激活其下游的效應(yīng)caspase，從而啟動(dòng)細(xì)胞死亡程序[2,3]。目前，有關(guān)XIAP 、caspase-9與CA的關(guān)系國(guó)內(nèi)外報(bào)道鮮見(jiàn)。本研究采用免疫組化方法檢測(cè)CA皮損中XIAP和caspase-9的表達(dá)，初步探討其在CA發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 資料及分組 72例CA標(biāo)本均來(lái)源于2014年6月至2015年4月山東省交通醫(yī)院性病門(mén)診就診患者，皮損位于外生殖器部位?；颊呔鶠槌醮伟l(fā)病，就診前未做任何治療，無(wú)系統(tǒng)性疾病史，不合并有其他外生殖器疾病或性病。其中男42例，女30例，年齡20～45歲，平均年齡27.6歲，病程0.5～6個(gè)月，平均2.3個(gè)月。臨床表現(xiàn)典型，醋酸白試驗(yàn)陽(yáng)性，組織病理證實(shí)為CA(圖1)。20例包皮標(biāo)本作為對(duì)照組，取自我院泌尿外科行包皮環(huán)切術(shù)者，患者系健康男性，既往無(wú)CA等外生殖器疾病，經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實(shí)為正常上皮。

1.2 試劑 兔抗人XIAP多克隆抗體、兔抗人caspase-9多克隆抗體及SV超敏兩步法免疫組化試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 所有標(biāo)本均連續(xù)切片3張，切片厚度4 μm，2張用于免疫組化研究，1張行HE染色，進(jìn)行組織病理確診。免疫組化操作均嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。用已知陽(yáng)性標(biāo)本做陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗做空白對(duì)照(圖2)。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) XIAP蛋白陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞漿或細(xì)胞膜，caspase-9蛋白陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞漿或細(xì)胞核。細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度按照以下方法進(jìn)行半定量分析：①按細(xì)胞著色強(qiáng)度：淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；②按陽(yáng)性細(xì)胞百分比：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分，兩者分值的乘積即為細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度，其分級(jí)方法為：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽(yáng)性(+)，6～8分為陽(yáng)性(++)，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，采用單盲法，每張切片任選兩個(gè)皮片，每個(gè)皮片隨機(jī)選取表皮層5個(gè)高倍(400倍)視野進(jìn)行評(píng)分，取其得分的平均數(shù)作為該標(biāo)本分值，將(+)-(+++)歸為陽(yáng)性表達(dá)組計(jì)算陽(yáng)性率[4]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，不同組間陽(yáng)性率比較用Fisher確切概率法，兩蛋白表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman非參數(shù)相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。

2 結(jié)果

2.1 XIAP在正常皮膚與CA組織中的表達(dá) XIAP蛋白的表達(dá)情況見(jiàn)表1，CA組XIAP蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率(56.94%)較對(duì)照組(15.00%)高，其差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.036，P<0.05)。

表1 XIAP在正常皮膚與CA組織中的表達(dá)

注：*與對(duì)照組相比，P=0.001

2.2 Caspase-9在正常皮膚與CA組織中的表達(dá) caspase-9蛋白的表達(dá)情況見(jiàn)表2，CA組caspase-9蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率(37.50%)低于對(duì)照組(70.00%)，其差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.692，P<0.05)。

表2 Caspase-9在正常皮膚與CA組織中的表達(dá)

注：*與對(duì)照組相比，P=0.012

圖1 CA組織(HE,×100) 圖2 CA組織的空白對(duì)照(×400) 圖3 XIAP在正常皮膚組織中的表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞主要位于基底層及棘層中下部，數(shù)目較少，染色較淺，呈灶狀分布(×400) 圖4 XIAP在CA組織中的表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞分布于表皮全層，以棘層為主，染色較強(qiáng)(×400) 圖5 Caspase-9在正常皮膚組織中的表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞主要位于增生上皮的基底層及棘層中下部，染色較強(qiáng)(×400) 圖6 Caspase-9在CA組織中的表達(dá)，染色淺，表達(dá)較少(×400)

2.3 XIAP和caspase-9蛋白定位表達(dá)情況 XIAP蛋白陽(yáng)性著色主要位于細(xì)胞漿或細(xì)胞膜。在正常皮膚組織中，陽(yáng)性細(xì)胞主要位于基底層及棘層中下部，數(shù)目較少，染色較淺，呈灶狀分布(圖3)；而在CA組織中，陽(yáng)性細(xì)胞分布于表皮全層，以棘層為主，染色較強(qiáng)(圖4)。Caspase-9蛋白陽(yáng)性著色在細(xì)胞漿或細(xì)胞核。在正常皮膚組織中，陽(yáng)性細(xì)胞主要位于增生上皮的基底層及棘層中下部，染色較強(qiáng)(圖5)；在CA組織中表達(dá)較少，著色較淺(圖6)。

2.4 CA組織中XIAP和caspase-9蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析 采用Spearman相關(guān)分析對(duì)二者在CA組織中的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示XIAP和caspase-9的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.83，P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 XIAP和caspase-9蛋白表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

XIAP是Peter等于1996年在人的胚胎腦細(xì)胞中克隆出的IAP家族新成員，在體內(nèi)除外周血淋巴細(xì)胞以外的所有組織中廣泛表達(dá)[5]。XIAP分子N-端的3個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域可以直接結(jié)合和抑制caspases-3、caspases-7、caspases-9，是唯一能同時(shí)抑制起始階段和效應(yīng)階段的凋亡抑制蛋白[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，XIAP 在CA組織中表達(dá)高于正常皮膚組織，推測(cè)HPV感染宿主細(xì)胞后，可能激活了XIAP基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯，使XIAP蛋白過(guò)度表達(dá)，阻礙凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致被感染的角質(zhì)形成細(xì)胞避開(kāi)凋亡、逃離生長(zhǎng)監(jiān)控，繼而保護(hù)病毒自身的復(fù)制，促進(jìn)CA的生長(zhǎng)和發(fā)展。Yin等[7]報(bào)道XIAP在CA組織中表達(dá)的陽(yáng)性率為80%，且均為較高水平表達(dá)，以棘層最為明顯，本實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性率低于該報(bào)道。近年來(lái)，HPV的致癌性已得到證實(shí)，被HPV感染角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡具有控制CA進(jìn)一步發(fā)展的作用，Cillessen等在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，XIAP的拮抗劑能恢復(fù)caspase-9介導(dǎo)的凋亡[8]，提示能夠通過(guò)XIAP作為靶標(biāo)研發(fā)治療CA的新藥物。

Caspases是一類(lèi)半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶家族，該家族是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的主要酶類(lèi)。其中caspases-9是線粒體通路中凋亡的啟動(dòng)者，激活其下游的效應(yīng)caspases，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Caspases-9廣泛表達(dá)于人類(lèi)的正常組織如神經(jīng)、肌肉等，在多種腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)caspase-9基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的下調(diào)[9，10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示caspase-9在CA組織中低表達(dá)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示caspase-9也參與了CA的發(fā)病過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)caspase-9與高表達(dá)的XIAP呈明顯的負(fù)相關(guān)。我們推測(cè)，一方面，CA中caspase-9部分表達(dá)，可以使少數(shù)細(xì)胞發(fā)生凋亡，限制HPV的復(fù)制，這可能是機(jī)體的一種自我保護(hù)機(jī)制；另一方面，caspase-9的活性受到高表達(dá)的XIAP的抑制，細(xì)胞凋亡不能有效進(jìn)行，HPV仍能保持較高水平的復(fù)制和繁殖，使越來(lái)越多的角質(zhì)形成細(xì)胞被感染，促進(jìn)病變組織不斷生長(zhǎng)。

綜上所述，我們認(rèn)為XIAP高表達(dá)及caspase-9活性降低共同參與CA的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，它們之間的相互作用關(guān)系可能是細(xì)胞凋亡通路中重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。已有研究報(bào)道，通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的shRNA穩(wěn)定抑制XIAP的表達(dá)，可以顯著減少腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)、誘導(dǎo)凋亡并增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療和放療的敏感性[11-13]。因此，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，阻斷XIAP的表達(dá)及上調(diào)caspase-9可能成為防止CA發(fā)生、復(fù)發(fā)的新靶點(diǎn)。

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(收稿：2016-06-24 修回：2016-08-16)

The expression of XIAP and caspase-9 in condyloma acuminatum

LIJing1,XUHongyu1,WUZhentao2.

1.DepartmentofDermatology,ShandongJiaotongHospital,Jinan250031China; 2.QingzhouSkinDiseaseControlStation,Qingzhou262500,Sandong,China

LIJing,E-mail:lijing810222@126.com

Objective: To detect the expression of XIAP and caspase-9 in condyloma acuminatum. Methods: The immunohistochemistry method was used to detect the expression of XIAP and caspase-9 in the tissues of 72 patients with condyloma acuminatum and prepuce tissues of 20 healthy persons. Results: The positive rate of XIAP protein in condyloma acuminatum was significantly higher than that in normal prepuces (56.94% vs 15%,P<0.05), while the positive rate of caspase-9 protein in condyloma acuminatum was lower than that in normal prepuces (37.5% vs 70%,P<0.05). There was a negative correlation between the expression of XIAP and caspase-9 (r=-0.83P<0.05). Conclusion: XIAP may promote the development of condyloma acuminatum by inhibiting the activity of caspase-9. The abnormal expression of XIAP and caspase-9 may be involved in the progression of condyloma acuminatum.

condyloma acuminatum; XIAP; caspase-9; apoptosis

1山東省交通醫(yī)院皮膚科，濟(jì)南,250031 2山東省青州市皮膚病防治站，青州,262500

李晶，E-mail: lijing810222@126.com