王娣，柯春林，曹珂珂，謝海偉，李妍

(蚌埠學(xué)院 生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233030)

纖維素酶法提取百里香黃酮的工藝優(yōu)化研究

王娣，柯春林，曹珂珂，謝海偉，李妍

(蚌埠學(xué)院 生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233030)

利用纖維素酶對(duì)百里香中黃酮進(jìn)行了提取工藝研究。考察了酶解溫度、酶量、pH和酶解時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響。百里香黃酮最佳提取工藝：酶解溫度45 ℃，酶量0.2%，pH 5.0，酶解時(shí)間1.5 h，黃酮得率可達(dá)1.528%?？寡趸瘜?shí)驗(yàn)表明百里香黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化活性，黃酮提取物濃度為1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)73.84%，對(duì)羥基自由基的清除率為51.73%。

纖維素酶；黃酮；正交試驗(yàn)；抗氧化

百里香(Thyme)，別稱麝香草，為唇形科百里香屬植物，原產(chǎn)地中海沿岸，為西方珍貴的香辛調(diào)味料，在我國(guó)多分布在內(nèi)蒙古、甘肅、陜西、青海、寧夏等地[1]。其所含精油因成分獨(dú)特，在醫(yī)藥、日用化工及精細(xì)化工等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[2-4]。百里香莖葉中富含百里香酚、黃酮等活性成分，近年來又成為食品工業(yè)中保鮮劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑等的理想替代品[5-8]。

纖維素酶是一組能夠降解纖維素酶的總稱，可破壞細(xì)胞壁的致密結(jié)構(gòu)，消除胞內(nèi)黃酮等大分子溶出的屏障，加速有效成分的溶出[9]。近年來，使用纖維素酶進(jìn)行植物有效成分的提取取得了不少新的成果[10-13]。本課題擬采用單因素和正交試驗(yàn)法優(yōu)化提取條件，考察酶解溫度、酶量、pH、酶解時(shí)間等因素對(duì)百里香黃酮提取的影響，并對(duì)黃酮提取物的抗氧化活性進(jìn)行初探，以期為百里香黃酮的進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用提供有價(jià)值的參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

百里香 安徽亳州醫(yī)藥公司，粉碎，過60目篩。纖維素酶 上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(分析純) 上海生化試劑廠；DPPH(分析純) Sigma 公司。

DZKW-4電子恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；UV1102紫外-可見分光光度計(jì) 上海天普紫外可見分光光度計(jì)有限公司；DY881-8恒溫干燥箱 合肥愛拓實(shí)驗(yàn)器材公司；JA2003A電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HH-1(HH-5)恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市恒豐儀器制造有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 方法

準(zhǔn)確稱取2.00 g百里香粉，加入纖維素酶和10 mL的HAc-NaAc緩沖液混合，在不同纖維素酶濃度、酶解溫度和pH條件下酶解后，95 ℃維持10 min，使酶滅活；接著加入等體積無水乙醇浸提24 h后過濾，濾渣再加入50%乙醇20 mL浸提24 h過濾，合并濾液備用。

1.2.1 黃酮含量的測(cè)定

1.2.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.020 g，用30%乙醇溶解，定容于100 mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL于10 mL容量瓶中，加入5%的NaNO2溶液0.3 mL還原6 min，加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL絡(luò)合6 min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%(即1 mol/L)的NaOH溶液4 mL，最后用30%乙醇定容，搖勻，顯色15 min，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度C為橫坐標(biāo)，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.2 提取物中黃酮含量的確定

準(zhǔn)確吸取樣液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入5%的NaNO2溶液0.3 mL還原6 min，加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL絡(luò)合6 min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%(即1 mol/L)的NaOH溶液4 mL，最后用30%乙醇定容，搖勻，顯色15 min，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計(jì)算出黃酮含量，進(jìn)而計(jì)算出黃酮得率。

式中：C為測(cè)得的樣品溶液的黃酮濃度(mg/mL)；K為樣品溶液的稀釋倍數(shù)；V為測(cè)定液總量(mL)；M為樣品的質(zhì)量(g)。

1.2.2 單因素和正交試驗(yàn)

1.2.2.1 酶解溫度對(duì)百里香黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取2.00 g百里香粉，加入0.2%的纖維素酶和10 mL的HAc-NaAc緩沖液(pH 4.6)，不同溫度(35，40，45，50，55 ℃)下水解1.5 h，95 ℃維持10 min，使酶滅活；加入等體積無水乙醇浸提24 h過濾，濾渣再加入50%乙醇20 mL浸提24 h過濾，合并濾液備用?？疾觳煌附鉁囟葘?duì)百里香黃酮得率的影響。

1.2.2.2 酶量對(duì)百里香黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取2.00 g百里香粉，按不同質(zhì)量比(0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%)添加纖維素酶和10 mL的HAc-NaAc緩沖液(pH 4.6)，45 ℃下水解1.5 h，以下操作同上?？疾觳煌噶繉?duì)百里香黃酮得率的影響。

1.2.2.3 pH對(duì)百里香黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取2.00 g百里香粉，加入0.2%的纖維素酶和10 mL的HAc-NaAc緩沖液(pH分別為4.2，4.6，5.0，5.4，5.8)，45 ℃水解1.5 h，以下操作同上。考察不同pH對(duì)百里香黃酮得率的影響。

1.2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)百里香黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取2.00 g百里香粉，加入0.2%的纖維素酶和10 mL的HAc-NaAc緩沖液(pH 4.6)，45 ℃下水解不同時(shí)間(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h)，以下操作同上?？疾觳煌附鈺r(shí)間對(duì)百里香黃酮得率的影響。

1.2.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

正交試驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表L9(34)
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

水平A酶解溫度(℃)B酶量(%)CpHD酶解時(shí)間(h)1400.14.21.02450.24.61.53500.35.02.0

1.2.3 百里香提取物抗氧化活性研究[14,15]

1.2.3.1 百里香提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力

將百里香提取液減壓濃縮，真空冷凍干燥，得到黃褐色粉狀提取物，用無水乙醇溶解。將待測(cè)的百里香提取物溶液稀釋成系列溶液，添加6.5×10-5mol/L DPPH·乙醇溶液，避光反應(yīng)10 min，在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。

清除率(%)=[1-(A2-A1)/A0]×100。

式中：A0為2.5 mL 6.5×10-5mol/L DPPH·乙醇溶液+0.5 mL無水乙醇的吸光值；A1為2.5 mL無水乙醇+0.5 mL樣品溶液的吸光值；A2為2.5 mL 6.5×10-5mol/L DPPH·乙醇溶液+0.5 mL樣品溶液的吸光值。

1.2.3.2 羥自由基實(shí)驗(yàn)

羥基自由基是一種強(qiáng)氧化劑，對(duì)羥基自由基的清除率是反映提取物抗氧化作用的一項(xiàng)重要指標(biāo)。反應(yīng)體系中加入鄰二氮菲，鄰二氮菲-Fe2+被羥自由基氧化為鄰二氮菲-Fe3+后，紅色褪去，在536 nm處的吸收大幅度下降。將百里香粉狀提取物用無水乙醇溶解，稀釋成系列溶液。按表2加樣，37 ℃保溫60 min，于波長(zhǎng)536 nm處測(cè)吸光度(A)值(3次平均)，計(jì)算羥自由基清除率。

表2 實(shí)驗(yàn)加樣表及相應(yīng)的吸光值Table 2 Sampling table of experiments and the corresponding absorbance

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

以吸光度為橫坐標(biāo)，蘆丁濃度(μg/mL)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。得回歸方程y=0.0115x+0.0063，R2= 0.9997，具有良好的線性關(guān)系。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of rutin

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶解溫度對(duì)百里香黃酮得率的影響

圖2 酶解溫度對(duì)黃酮得率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis temperature on the yield of flavonoids

由圖2可知，開始隨著溫度的升高，黃酮的得率也不斷地增大；當(dāng)溫度達(dá)到45 ℃時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大1.453%；再隨著溫度的升高，黃酮得率則出現(xiàn)了下降趨勢(shì)。因此，選定40，45，50 ℃為溫度對(duì)總黃酮得率較敏感的3個(gè)水平。

2.2.2 酶量對(duì)百里香黃酮得率的影響

圖3 酶量對(duì)黃酮得率的影響Fig.3 Effect of enzyme amount on the yield of flavonoids

由圖3可知，黃酮得率先隨著酶加量的增加而增大，當(dāng)酶量添加到0.2%時(shí)，得率達(dá)到最大值并趨于穩(wěn)定；再增加酶用量，增幅效果不明顯。因此，選定0.1%，0.2%，0.3%為酶量對(duì)總黃酮得率較敏感的3個(gè)水平。

2.2.3 pH對(duì)百里香黃酮得率的影響

圖4 pH值對(duì)黃酮得率的影響Fig.4 Effect of pH value on the yield of flavonoids

由圖4可知，隨著pH值的升高，黃酮得率逐漸增大，當(dāng)pH為4.6時(shí)，得率最高；再增大pH值，黃酮得率則呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。因此，選定4.2，4.6，5.0為pH對(duì)總黃酮得率較敏感的3個(gè)水平。

2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)百里香黃酮得率的影響

圖5 酶解時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響Fig.5 Effect of enzymolysis time on the yield of flavonoids

由圖5可知，隨著酶解反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮得率逐漸增大，當(dāng)達(dá)到1.5 h時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大，這說明此時(shí)酶和底物已經(jīng)充分反應(yīng)；當(dāng)時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，黃酮得率增幅很小，趨于穩(wěn)定。因此，選定1.0，1.5，2.0 h為提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率較敏感的3個(gè)水平。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表3 正交設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果
Table 3 The orthogonal array design matrix and experimental results

序號(hào)酶解溫度(℃)酶量(%)pH酶解時(shí)間(h)黃酮得率(%)111110.986212220.997313331.072421231.319522311.473623121.326731321.128832131.056933210.795k11.0181.1441.1231.085k21.3731.1751.0371.150k30.9931.0641.2241.149極差r0.3800.1110.1870.065

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析
Table 4 Variance analysis of orthogonal experimental results

因素偏差平方和自由度方差F比顯著性酶解溫度0.27020.13533.750*酶量0.02020.0102.500pH0.05320.0276.625酶解時(shí)間0.00820.0041.000誤差0.012

注：F0.05(2,2)=19。

由表3和表4可知，纖維素酶法提取百里香黃酮的影響因素依次為酶解溫度>pH值>酶量>酶解時(shí)間。由表4可知，酶解溫度對(duì)黃酮提取的影響顯著，而pH、酶量和酶解時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響較小。確定了最佳提取條件為A2B2C3D2，即：在酶解溫度45 ℃，酶量0.2%，pH 5.0，酶解時(shí)間1.5 h的條件下，黃酮得率可達(dá)1.528%(3次平均)。

2.4 百里香提取物抗氧化實(shí)驗(yàn)

2.4.1 對(duì)DPPH自由基的清除能力

百里香黃酮提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6，表明百里香黃酮提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性。隨著百里香黃酮提取物濃度的不斷增加，對(duì)DPPH自由基清除能力逐步增大。當(dāng)提取物濃度為1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率可達(dá)73.84%。

圖6 百里香黃酮提取物清除DPPH自由基的量效關(guān)系Fig.6 The DPPH·scavenging effect of thyme flavonoids

2.4.2 對(duì)羥基自由基的清除能力

百里香黃酮提取物對(duì)羥基自由基的清除能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7，表明百里香黃酮提取物對(duì)羥基自由基有明顯的清除作用。隨著百里香黃酮提取物濃度的增加，對(duì)羥基自由基的清除作用也逐漸增強(qiáng)。當(dāng)提取物濃度為1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率為51.73%。

圖7 百里香黃酮提取物清除羥自由基的量效關(guān)系Fig.7 The ·OH scavenging effect of thyme flavonoids

3 結(jié)論

采用纖維素酶法可有效提取百里香黃酮。酶解溫度對(duì)百里香黃酮提取的影響最顯著，百里香黃酮的最優(yōu)提取條件為：酶解溫度45 ℃，酶量0.2%，pH 5.0，酶解時(shí)間1.5 h，黃酮得率可達(dá)1.528%。抗氧化實(shí)驗(yàn)表明百里香黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化活性。對(duì)DPPH自由基的清除能力很強(qiáng)，當(dāng)黃酮提取物濃度為1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)73.84%。隨著百里香黃酮濃度的增加，對(duì)羥基自由基的清除作用也逐漸增強(qiáng)。當(dāng)黃酮提取物濃度為1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率為51.73%。本實(shí)驗(yàn)為初步抗氧化探究，旨在為百里香資源在我國(guó)的開發(fā)利用和發(fā)展提供一定基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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Study on Extraction Technology of Flavonoids from Thyme by Cellulase

WANG Di, KE Chun-lin, CAO Ke-ke, XIE Hai-wei, LI Yan

(Department of Biology and Food Engineering, Bengbu College, Bengbu 233030, China)

The extraction technology of flavonoids from thyme by cellulase is studied. The effects of enzymolysis temperature, enzyme amount, pH and enzymolysis time on the yield of flavonoids are investigated. The orthogonal experimental results show that the optimum extraction technology conditions of flavonoids from thyme by cellulase are as follows: enzymolysis temperature of 45 ℃, enzyme amount of 0.2%, pH of 5.0 and enzymolysis time of 1.5 h, the yield of flavonoids is 1.528%. The antioxidant experiments indicate that when the concentration of flavonoid extracts is 1.0 mg/mL, the clearance rate of DPPH·reaches 73.84%, and the clearance rate of OH·reaches51.73%.

cellulase; flavonoid; orthogonal experiment; antioxidant

2016-06-20

安徽省教育廳重點(diǎn)科研項(xiàng)目(KJ2015A204)

王娣(1976-)，女，副教授，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。

TS201.1

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2016.12.009

1000-9973(2016)12-0038-05