周龍霞，王燕*，郭玉蓉，張海濤，孫自頂，王志超

(1.齊魯工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250353；2.陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，西安 710062)

等離子誘變選育木糖醇高產(chǎn)菌及發(fā)酵條件優(yōu)化

周龍霞1，王燕1*，郭玉蓉2，張海濤1，孫自頂1，王志超1

(1.齊魯工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250353；2.陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，西安 710062)

以熱帶假絲酵母Y-14(Tropicalcandida)為出發(fā)菌株，采用等離子體對(duì)其進(jìn)行誘變，得到最佳誘變條件：在功率120 W下處理150 s，致死率達(dá)到96%。誘變后經(jīng)過篩選得到1株高產(chǎn)木糖醇的菌株Y-117，與出發(fā)菌株相比，其木糖醇產(chǎn)量提高了30.4%。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析試驗(yàn)對(duì)菌株Y-117的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳條件：初始木糖添加量105 g/L、溫度30.5 ℃、搖床轉(zhuǎn)速190 r/min。在此條件下，Y-117的木糖醇產(chǎn)量為76.45 g/L，比出發(fā)菌株高42%。

木糖醇；熱帶假絲酵母；等離子誘變；響應(yīng)面法

木糖醇是甜味調(diào)味品的一種，目前在人們的日常生活中作為調(diào)味品得到廣泛應(yīng)用。木糖醇(xylitol)即戊五醇，分子式為C5H12O5，是木糖代謝的正常中間產(chǎn)物，外形為結(jié)晶性白色粉末，廣泛存在于水果、蔬菜、谷類等食物和木材、稻草秸稈及玉米芯等植物中。木糖醇作為一種甜味調(diào)味品易溶于水，其甜度與蔗糖相近，但熱量?jī)H為蔗糖的1/3，廣泛用于糖果、飲料和糕點(diǎn)等生產(chǎn)加工以及人們的日常生活中[1]。木糖醇具有預(yù)防齲齒的功效，對(duì)人體的血糖值上升沒有影響，可作為糖尿病人食用的營(yíng)養(yǎng)型食糖替代品。因?yàn)槟咎谴急旧聿缓驶?，且有較強(qiáng)的化學(xué)穩(wěn)定性，因此作為食品添加劑可以延長(zhǎng)食品的保鮮期[2]。近幾年，由于木糖醇在食品、調(diào)味品、醫(yī)藥和輕工等行業(yè)的應(yīng)用，木糖醇已經(jīng)得到廣泛關(guān)注。

目前國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)木糖醇的主要方法為化學(xué)合成法，化學(xué)合成法生產(chǎn)木糖醇工藝比較成熟，但是由于其工藝要求成本高、耗能大且污染較嚴(yán)重等缺點(diǎn)，也影響了其行業(yè)的發(fā)展；相對(duì)于化學(xué)合成法，生物轉(zhuǎn)化法以其條件溫和、轉(zhuǎn)化過程安全、消耗資源少等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注[3]。能夠利用木糖發(fā)酵產(chǎn)木糖醇的微生物中，酵母轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)(尤其是熱帶假絲酵母菌屬)。目前木糖醇的生產(chǎn)效率低是微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)木糖醇的瓶頸問題，木糖醇產(chǎn)率是限制微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)木糖醇規(guī)模化的關(guān)鍵因素。

通過微生物育種技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)菌株的選育是提高發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇能力的途徑之一。常溫等離子(Atmospheric and Room Temperature Plasma, ARTP)誘變技術(shù)是一種新型的誘變技術(shù)，ARTP具有操作簡(jiǎn)單、安全性高、環(huán)境友好、突變速度快、突變率高和突變多樣性等特點(diǎn)，能夠快速突變微生物，是一種新型的生物誘變方法[4]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的熱帶假絲酵母Y-14進(jìn)行等離子誘變，篩選得到遺傳性狀穩(wěn)定的高產(chǎn)突變菌株Y-117，并通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法試驗(yàn)對(duì)Y-117的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，顯著提高了菌株的木糖醇產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

熱帶假絲酵母Y-14分離于存放玉米芯的土壤中，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要試劑與儀器

試劑：木糖；酵母膏；蛋白胨；七水硫酸鎂；磷酸氫二鉀；氯化鈉；硫酸銨；瓊脂粉；變色酸；氯化亞錫。

儀器：DL-5-B飛鴿牌離心機(jī)；PHS-25數(shù)顯pH計(jì)；SHP-150數(shù)顯生化培養(yǎng)箱；HYG-A全溫?fù)u瓶柜；ARTP誘變系統(tǒng)；722型分光光度計(jì)。

1.1.3 培養(yǎng)基[5]

斜面培養(yǎng)基：木糖 100 g/L，酵母膏3 g/L，七水硫酸鎂 1 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，氯化鈉2 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH 6.0，115 ℃滅菌30 min。

平板培養(yǎng)基：同斜面培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基：木糖 100 g/L，酵母膏3 g/L，蛋白胨5 g/L，七水硫酸鎂 1 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，硫酸銨2 g/L， pH 6.0，115 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：木糖 100 g/L，酵母膏3 g/L，硫酸銨2 g/L，七水硫酸鎂 1 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，氯化鈉2 g/L， pH 6.0，115 ℃滅菌30 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 等離子誘變

本試驗(yàn)工作氣體為氦氣，工作氣流量為10 SLM，處理距離為2 mm，電源輸出功率為120 W[6]。將試驗(yàn)前培養(yǎng)的處于對(duì)數(shù)期的菌體進(jìn)行梯度稀釋，制備菌懸液，取菌懸液進(jìn)行等離子誘變，以處理時(shí)間作為誘變參數(shù)，處理時(shí)間為30，60，90，120，150，180，210，240 s。將照射后的菌液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后涂布到平板培養(yǎng)基上，對(duì)照組未經(jīng)誘變的菌液做同樣處理，每組試驗(yàn)做3個(gè)平行，30 ℃下培養(yǎng)。記錄菌落數(shù)目，計(jì)算致死率。將優(yōu)勢(shì)單菌落接種到種子培養(yǎng)基中，測(cè)定發(fā)酵液中木糖醇產(chǎn)量，確定優(yōu)勢(shì)菌株。

致死率=(對(duì)照組活菌數(shù)目-誘變處理后活菌數(shù)目)/ 對(duì)照組活菌數(shù)目×100%。

1.2.2 突變菌株遺傳穩(wěn)定性測(cè)定

將篩選出的木糖醇高產(chǎn)菌株低溫保藏，連續(xù)傳代8次，測(cè)定每一代菌株的木糖醇產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率。

1.2.3 木糖含量測(cè)定

利用DNS法測(cè)定發(fā)酵液中木糖殘余量[7]。

1.2.4 木糖醇含量測(cè)定

利用變色酸法測(cè)定發(fā)酵液中木糖醇產(chǎn)量[8]。

1.2.5 生物量測(cè)定

取適量發(fā)酵液離心，用蒸餾水清洗2遍后，放于烘箱內(nèi)60 ℃烘干至恒重，用天平稱量重量，以每1 L發(fā)酵液中所含干菌體克數(shù)表示生物量。

1.2.6 單因素試驗(yàn)

主要考察不同因素條件對(duì)木糖醇產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率的影響。

1.2.6.1 初始木糖濃度

在 250 mL 三角瓶中裝入 50 mL木糖發(fā)酵培養(yǎng)基，初始木糖添加量分別為 60，80，100，120，150，180 g/L，種子液接種量為 10%，放置于搖床上30 ℃，180 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)至所需時(shí)間。

1.2.6.2 溫度

在 250 mL 三角瓶中裝入 50 mL木糖發(fā)酵培養(yǎng)基，種子液接種量為 10%，恒溫?fù)u床溫度分別設(shè)為 25，28，30，32，34，36 ℃，180 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)至所需時(shí)間。

1.2.6.3 pH

在 250 mL 三角瓶中裝入 50 mL木糖發(fā)酵培養(yǎng)基，種子液接種量為 10%，初始 pH 分別為 5，5.5，6.0，6.5，7.0，放置于搖床上30 ℃，180 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)至所需時(shí)間。

1.2.6.4 轉(zhuǎn)速

在 250 mL 三角瓶中裝入 50 mL木糖發(fā)酵培養(yǎng)基，種子液接種量為 10%，搖床轉(zhuǎn)速分別為 140，160，180，200，220 r/min，30 ℃，發(fā)酵培養(yǎng)至所需時(shí)間。

1.2.6.5 接種量

在 250 mL 三角瓶中裝入 50 mL木糖發(fā)酵培養(yǎng)基，將種子液接種量分別設(shè)定為 6%，8%，10%，12%，14%，放置于搖床上30 ℃，180 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)至所需時(shí)間。

1.2.7 響應(yīng)面分析法

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以木糖醇產(chǎn)量為試驗(yàn)指標(biāo)，確立影響木糖醇發(fā)酵的主要因素。以初始木糖濃度、溫度和轉(zhuǎn)速為試驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，以獲得菌株的最佳發(fā)酵條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)菌株的篩選

2.1.1 ARTP誘變條件確定

經(jīng)過ARTP誘變后，不同誘變時(shí)間菌株的致死率結(jié)果見表1。

表1 ARTP誘變的致死率
Table 1 The lethality of ARTP mutation

處理時(shí)間(s)306090120150180210240致死率(%)37.649.373.489.196.3100100100

由表1可知，隨著誘變時(shí)間的增加，致死率也不斷上升，在150 s時(shí)，致死率達(dá)到96.3%以上，之后隨時(shí)間增加，致死率接近100%，為使菌株獲得較好的正突變，實(shí)驗(yàn)選擇150 s作為ARTP的誘變條件。

2.1.2 誘變菌株的篩選

根據(jù)菌落生長(zhǎng)的形態(tài)，從ARTP誘變后的單菌落中挑選得到153個(gè)單菌落。將篩選得到的菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)，經(jīng)過數(shù)次重復(fù)試驗(yàn)，篩選出木糖醇含量較高的正突變菌株18株，其中突變株Y-117的發(fā)酵液中木糖醇轉(zhuǎn)化率最高為74.36%，木糖醇產(chǎn)量為70.38 g/L，菌體濃度為15.36 g/L。相比出發(fā)菌株Y-14的木糖醇產(chǎn)量提高了31.04%。

2.1.3 突變株遺傳穩(wěn)定性測(cè)定

將突變株Y-117連續(xù)傳代8次，測(cè)定其木糖醇產(chǎn)量，結(jié)果見圖1。

圖1 突變株Y-117遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)Fig.1 Genetic stability test of mutant strain Y-117

由圖1可知，菌株Y-117經(jīng)過連續(xù)傳代8次后，木糖醇產(chǎn)量較穩(wěn)定，由此說明其遺傳性能穩(wěn)定，可作為后續(xù)發(fā)酵試驗(yàn)的菌株。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同初始木糖濃度對(duì)木糖醇轉(zhuǎn)化的影響

表2 初始木糖濃度對(duì)菌株Y-117木糖醇轉(zhuǎn)化能力的影響
Table 2 The effect of initial xylose concentration on xylitol transforming ability of strain Y-117

初始木糖濃度(g/L)木糖殘余量(g/L)木糖醇產(chǎn)量(g/L)轉(zhuǎn)化率(%)菌體濃度(g/L)60026.1843.6313.5880049.4864.8514.731005.7275.4279.9515.3612027.6464.8769.8214.4315059.3352.0457.4113.6918049.1849.1352.0213.07

由表2可知，隨著發(fā)酵液中初始木糖濃度的增加，木糖醇的產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率先增加后降低，木糖殘余量則呈上升趨勢(shì)。當(dāng)初始木糖濃度過低時(shí)，木糖多作為菌體生長(zhǎng)的碳源被利用，因此轉(zhuǎn)化率較低。當(dāng)初始木糖濃度為100 g/L時(shí)，菌體生長(zhǎng)最快，木糖醇產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率都達(dá)到最大，轉(zhuǎn)化率為79.97%。當(dāng)初始木糖濃度不斷增大，菌體濃度和木糖醇產(chǎn)量都有明顯下降，這說明高濃度的初始木糖濃度對(duì)菌體有抑制作用，導(dǎo)致發(fā)酵周期變長(zhǎng)。綜合考慮木糖醇產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率，選擇100 g/L初始木糖濃度比較有利于菌株Y-117木糖醇的轉(zhuǎn)化。

2.2.2 不同溫度對(duì)木糖醇轉(zhuǎn)化的影響

溫度是影響微生物酶活性的重要因素，相關(guān)研究證明酵母菌的最適溫度一般為30 ℃左右，溫度主要影響菌體代謝中關(guān)鍵酶的活性，溫度過高或過低都會(huì)對(duì)酶的活性產(chǎn)生影響[9]。本試驗(yàn)考察溫度從25～36 ℃對(duì)于菌株轉(zhuǎn)化木糖醇的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同溫度對(duì)木糖醇轉(zhuǎn)化的影響Fig.2 The effect of different temperatures on the transforming of xylitol

隨著溫度的不斷升高，木糖醇產(chǎn)量也在不斷積累增加，當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，木糖醇產(chǎn)量最高為73.52 g/L，此時(shí)的木糖醇轉(zhuǎn)化率最高，當(dāng)溫度高于30 ℃時(shí)，木糖醇的積累量和轉(zhuǎn)化率都開始下降。因此，確定30 ℃為菌株Y-117的最佳轉(zhuǎn)化溫度。

2.2.3 初始pH對(duì)木糖醇轉(zhuǎn)化的影響

不同初始pH對(duì)于菌株的轉(zhuǎn)化能力有很大影響，pH主要影響菌株的菌體繁殖和生長(zhǎng)代謝過程，對(duì)目的產(chǎn)物的積累有較大影響[10]。本文研究不同初始pH對(duì)菌株Y-117轉(zhuǎn)化木糖醇的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 初始pH對(duì)菌株Y-117轉(zhuǎn)化木糖醇的影響Fig.3 The effect of initial pH value on xylitol transforming ability of strain Y-117

初始pH由5.0增大到7.0的過程中，木糖醇的產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率及菌體量隨著pH的增加先增大后減小，pH為6.0時(shí)條件最佳，且菌體量與木糖醇產(chǎn)量呈正相關(guān)關(guān)系。

2.2.4 不同轉(zhuǎn)速對(duì)木糖醇轉(zhuǎn)化的影響

轉(zhuǎn)速是發(fā)酵過程中控制溶氧的重要途徑。研究表明溶氧是影響木糖醇轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素[11]，發(fā)酵液中的溶氧量不僅對(duì)木糖醇的產(chǎn)量有影響，對(duì)菌體的生長(zhǎng)和副產(chǎn)物的產(chǎn)生也有一定的影響。本文通過改變搖床的轉(zhuǎn)速來考察溶氧對(duì)于菌株Y-117轉(zhuǎn)化木糖醇能力的影響，結(jié)果見表3。

表3 轉(zhuǎn)速對(duì)木糖醇轉(zhuǎn)化的影響
Table 3 The effect of rotation speed on the transforming of xylitol

轉(zhuǎn)速(r/min)菌體濃度(g/L)木糖殘余量(g/L)木糖醇產(chǎn)量(g/L)轉(zhuǎn)化率(%)14013.018.0265.2470.9316014.616.7468.4973.4518015.974.3673.4877.1620014.327.3867.0472.8222012.8110.0361.3968.21

由表3可知，隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加，菌體的木糖消耗速度和木糖醇的產(chǎn)量先增大后減小，當(dāng)轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)，木糖醇積累量達(dá)到最大為73.48 g/L，此時(shí)菌株轉(zhuǎn)化木糖醇的能力也是最強(qiáng)的。所以，搖床試驗(yàn)中選擇轉(zhuǎn)速180 r/min為最佳條件。

2.2.5 不同接種量對(duì)木糖醇轉(zhuǎn)化的影響

種子液的接種量不同對(duì)木糖醇的轉(zhuǎn)化也有一定影響，當(dāng)接種量較低時(shí)，可能會(huì)造成菌體生長(zhǎng)緩慢，延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間；當(dāng)接種量過大時(shí)，菌體會(huì)大量消耗培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)成分，導(dǎo)致代謝產(chǎn)物積累量過少。本文考察接種量為6%，8%，10%，12%，14%時(shí)菌株的轉(zhuǎn)化能力，結(jié)果見圖4。

圖4 不同接種量對(duì)菌株Y-117轉(zhuǎn)化木糖醇的影響Fig.4 The effect of inoculum size on xylitol transforming ability of strain Y-117

當(dāng)接種量為10%時(shí)，發(fā)酵液中木糖醇產(chǎn)量最大為75.46 g/L，木糖殘余量最少，且此時(shí)轉(zhuǎn)化率最大為78.43%。當(dāng)接種量低于10%時(shí)，菌體濃度低，生長(zhǎng)緩慢，從而導(dǎo)致木糖醇的轉(zhuǎn)化率不高；當(dāng)接種量大于10%時(shí)，菌體會(huì)消耗過多的底物，從而導(dǎo)致木糖醇的產(chǎn)量下降。因此，選擇接種量10%為最佳接種量。

2.3 響應(yīng)面分析法

2.3.1 響應(yīng)面分析因素水平的選取及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以初始木糖濃度(A)、溫度(B)和轉(zhuǎn)速(C)為試驗(yàn)因素，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以木糖醇產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析，其中零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，試驗(yàn)因素水平和編碼見表4。

表4 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平表
Table 4 Factors and levels of Box-Behnken design

因素水平-101A初始木糖濃度(g/L))80100120B溫度(℃)283032C轉(zhuǎn)速(r/min)160180200

采用Design-Expert 8.0.5b統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，響應(yīng)面分析試驗(yàn)的結(jié)果見表5。

表5 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果
Table 5 Box-Behnken design and results

試驗(yàn)序號(hào)ABC木糖醇產(chǎn)量(g/L)100076.03211075.1331-1069.574-10-168.155-1-1070.84601-172.717-11071.28800075.83901173.9310-10174.161100075.951200075.691310-172.311400075.811510174.08160-1-168.46170-1173.19

2.3.2 回歸模型建立及分析

利用Design-Expert 8.0.5b軟件對(duì)表5中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到木糖醇產(chǎn)量對(duì)自變量A，B，C的回歸方程：

木糖醇產(chǎn)量(g/L)=75.86+0.83A+1.37B+1.72C+1.28AB-1.06AC-0.88BC-2.03A2-2.13B2-1.66C2。

對(duì)模型進(jìn)行方差分析及對(duì)系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表6。

表6 響應(yīng)面回歸系數(shù)的方差分析
Table 6 Analysis of variance for the response surface

來源平方和自由度均方F值P值模型111.90912.4397.06<0.0001A5.5415.5443.28<0.0001B15.10115.10117.860.0003C23.56123.56183.96<0.0001AB6.5516.5551.160.002AC4.4914.4935.090.0006BC3.0813.0824.050.017A217.30117.30135.09<0.0001B219.10119.10149.10<0.0001C211.60111.6090.55<0.0001殘差0.9070.13失擬項(xiàng)0.8330.2815.920.1090凈誤差0.06940.017合計(jì)112.7916

由表6可知，P<0.05表示該指標(biāo)顯著，模型P<0.0001表示極其顯著；失擬值P=0.109>0.05表示無顯著性差異。由此說明模型擬合有效，可用此模型和方程來分析木糖醇的產(chǎn)量。

軟件分析得到模型的校正決定系數(shù)Radj2=98.18%，說明該實(shí)驗(yàn)方法是可靠的，此模型數(shù)據(jù)擬合度較好，試驗(yàn)誤差較小。由回歸模擬系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果中可知其中A和C的影響最為顯著；B的影響顯著；方程的二次項(xiàng)AA，BB，CC都極顯著；交互項(xiàng)中AC極顯著，說明初始木糖添加量(A)與轉(zhuǎn)速(C)對(duì)木糖醇產(chǎn)量的交互作用影響更明顯。由此可得出3個(gè)因素對(duì)結(jié)果的影響排序?yàn)椋撼跏寄咎翘砑恿?轉(zhuǎn)速>溫度。

2.3.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

根據(jù)回歸方程做出模型的響應(yīng)面及等高線圖，結(jié)果見圖5～圖7。

圖5 初始木糖添加量與溫度對(duì)木糖醇產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖(a)和等高線圖(b)Fig.5 The response surface plot(a)and the contour(b)for the effects of initial xylose amount and temperature on the production of xylitol

圖6 初始木糖添加量與轉(zhuǎn)速對(duì)木糖醇產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖(a)和等高線圖(b)Fig.6 The response surface plot(a)and the contour(b)for the effects of initial xylose amount and rotation speed on the production of xylitol

圖7 溫度與轉(zhuǎn)速對(duì)木糖醇產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖(a)和等高線圖(b)Fig.7 The response surface plot(a)and the contour(b)for the effects of temperature and rotation speed on the production of xylitol

由響應(yīng)面的最高點(diǎn)與等值線可以看出，初始木糖添加量(A)與轉(zhuǎn)速(C)的交互作用明顯，這與方差分析的結(jié)果一致，經(jīng)優(yōu)化后得到：當(dāng)(A,B,C)=(0.206,0.308，0.371)時(shí)，此時(shí)木糖醇的產(chǎn)量最大。

2.3.4 最佳發(fā)酵條件確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過響應(yīng)值分析得到最佳發(fā)酵條件：初始木糖添加量為104.14 g/L；溫度為30.618 ℃；轉(zhuǎn)速為187.1 r/min。在此條件下，木糖醇產(chǎn)量最大為76.48 g/L。結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)條件，確定初始木糖添加量為105 g/L；溫度為30.5 ℃；轉(zhuǎn)速為190 r/min，其他條件不變，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，經(jīng)過多次試驗(yàn)得到木糖醇產(chǎn)量為76.43 g/L，與理論預(yù)測(cè)值相差不大。

3 結(jié)論

等離子誘變是一種新興的誘變育種技術(shù)，本文通過等離子誘變方法選育出一株遺傳性狀穩(wěn)定、木糖醇產(chǎn)量較高的菌株Y-117，其木糖醇產(chǎn)量由原來的54.06 g/L提高到71.38 g/L。在微生物代謝產(chǎn)物研究中，發(fā)酵條件的優(yōu)化起著重要作用，本文在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對(duì)菌株Y-117的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，通過Box-Behnke試驗(yàn)，然后結(jié)合統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert 8.0.5b進(jìn)行二次回歸模型擬合及方差分析，得到最佳發(fā)酵條件：初始木糖添加量為105 g/L，溫度為30.5 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為190 r/min。經(jīng)多次試驗(yàn)驗(yàn)證，此發(fā)酵條件下木糖產(chǎn)量達(dá)到76.43 g/L，與原始菌株相比提高了41.38%。

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Mutation Breeding of High-yield Xylitol Strain by Plasma and Optimization of Fermentation Conditions

ZHOU Long-xia1, WANG Yan1*, GUO Yu-rong2, ZHANG Hai-tao1, SUN Zi-ding1,WANG Zhi-chao1

(1.College of Biological Engineering, Qilu University of Technology, Shandong Provincial Key Laboratory of Microbial Engineering, Ji'nan 250353, China; 2.College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi'an 710062, China)

TheTropicalcandidaY-14 is mutagenized by atmospheric and room temperature plasma (ARTP). The optimal mutation condition is 150 s at 120 W, under such condition, the lethality rate is 96%. The strain Y-117 with high-yield xylitol is screened from mutagenizedTropicalcandida. The xylitol productivity of Y-117 is increased by 30.4% comparing withTropicalcandidaY-14. The single factor experiment is utilized combining with response surface methodology to optimize the fermentation conditions for strain Y-117. The fermentation conditions of Y-117 are optimized as follows: initial xylose content is 105 g/L, temperature is 30.5 ℃, and shaker speed is 190 r/min. Under these conditions, the xylitol productivity of Y-117 is 76.45 g/L, which is 42% higher than the starting strain.

xylitol;Tropicalcandida; plasma mutation; response surface method

2016-06-26 *通訊作者

農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目(CARS-28)

周龍霞(1989-)，女，山東臨沂人，碩士，研究方向：微生物酶技術(shù)；

王燕(1961-)，女，山東濟(jì)南人，教授，博士，研究方向：微生物酶技術(shù)和生物活性產(chǎn)品的分離等。

TS245.8

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2016.12.001

1000-9973(2016)12-0001-06