臧 皓，徐 倩，滕 云，張海豐

(1.通化師范學院制藥與食品科學學院，吉林通化134002;2.通化市通化縣三棵榆樹鎮(zhèn)中心校，吉林通化134002)

肌肽酯類衍生物脾細胞增殖活性及血漿穩(wěn)定性研究*

臧 皓1，徐 倩1，滕 云2，張海豐1

(1.通化師范學院制藥與食品科學學院，吉林通化134002;2.通化市通化縣三棵榆樹鎮(zhèn)中心校，吉林通化134002)

目的:研究肌肽酯類衍生物的脾細胞增殖活性及血漿穩(wěn)定性.方法:應用小鼠的脾臟和健康人的血漿進行實驗研究.結果:脾細胞增殖活性測試結果表明，在實驗濃度下，大部分化合物表現出一定的脾細胞增殖活性，特別是化合物3b、3c、3d 和3e對脾細胞的增殖活性高于陽性對照ConA.血漿穩(wěn)定性實驗結果表明，與肌肽相比，10個化合物均具有很好的血漿穩(wěn)定性.結論:化合物3b、3c、3d和3e具有良好的血漿穩(wěn)定性和脾細胞增殖活性，具有深入研究的價值.

肌肽;酯類衍生物;脾細胞增殖;血漿穩(wěn)定性

肌肽是一種內源性二肽，具有清除活性氧和活性氮的功能，同時還具有螯合金屬離子作用，可以清除脂質自氧化產生的α，β－不飽和醛［1－2］，肌肽還可以保護蛋白免于非酶糖化反應［3－4］.近年來，研究發(fā)現肌肽還具有抗腫瘤、治療白內障、糖尿病腎病和阿爾茨海默病、肝臟疾病和眼科疾病等多種藥理作用.而且肌肽性質溫和，幾乎沒有毒副作用，在醫(yī)藥領域具有廣闊的應用前景.然而，血漿中的肌肽酶能迅速把肌肽水解生成β－丙氨酸和L－組氨酸，阻止肌肽發(fā)揮治療作用，因此，對肌肽進行結構修飾、得到血漿穩(wěn)定性好、活性高的化合物一直是研究的熱點，本實驗主要研究肌肽酯類衍生物3a－3j是否具有脾細胞增殖作用及良好的血漿穩(wěn)定性.

1 實驗材料

1.1 藥品

肌肽酯類衍生物3a－3j按照之前的方法［5］制備，它們是對肌肽羧基位點進行結構修飾，與醇進行酯化反應得到的，結構見圖1.

1.2 試劑與儀器

圖1 肌肽酯類衍生物的結構式

25～40歲健康成年人的血漿(長春市中心血站)，胎牛血清(美國Gibco公司)，RPMI 1640(美國Gibco公司)，四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma公司)，青霉素鈉(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)，硫酸鏈霉素(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)，WST－1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(北京東方德教育科技有限公司)，2010型高效液相色譜儀(日本島津公司)，BIO－RAD－680型酶標儀(美國Bio－Rad公司);Heraeus HERAcell 150i二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋公司).

2 生物活性實驗

2.1 脾細胞增殖活性

將2只小鼠麻醉后脫椎處死，浸泡于體積分數為75%的乙醇溶液中約10min，將脾取出放在已滅菌的培養(yǎng)皿中，加入5mL胎牛血清(FBS)/1640完全培養(yǎng)基，將脾剪碎，用3～4層紗布過濾，收集濾液，以轉速1000 r/min離心10min，棄去上清液.加入10mL完全培養(yǎng)基，吹打成均勻的懸浮細胞，用含體積分數為10%體積分數的FBS/1640培養(yǎng)液將細胞密度調至106個/mL，以100μL/孔將細胞懸浮液接種于96孔板，實驗組樣品濃度分為高中低三種濃度，分別為20μg/mL、100μg/mL、500μg/mL.每孔接種100μL/孔，空白對照每孔接種100μL的1640培養(yǎng)基，陽性對照組每孔接種20μL濃度為5μg/mL的伴刀豆蛋白(ConA)，每組設3個復孔.置于37℃體積分數為5%的CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)2d，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，以轉速1000 r/min離心10min，將96孔板傾斜30o，小心吸去上清液.每孔加入100μL的二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10min，用酶標儀于490nm測定吸光值，按照下式計算增殖率，結果列于表1.

細胞增殖率(%)=［(給藥組A490nm-空白對照組A490nm)/空白對照組A490nm］×100%

表1 化合物3a－3j的脾細胞增殖活性評價

2.2 血漿穩(wěn)定性實驗

采用25～40歲成年人的血漿，底物的濃度為1.5mmol/L，用pH=7.4的磷酸緩沖鹽配制，血漿未經稀釋直接與等體積底物混合，于37℃孵化2h，每30min取樣1次，用血漿2倍體積的冷乙腈終止反應，立即混合后以轉速12000 r/min離心10min，用0.45μm的有機濾膜過濾后直接注入液相色譜儀測試，根據底物峰面積減少計算其水解程度.

根據時間對肌肽的含量作圖得到圖2，可得肌肽的降解方程:y=－0.059x+0.9936，R2= 0.9983，可見肌肽的水解成線性由方程得到肌肽的血漿半衰期t1/2=8.37min.其他化合物的實驗結果見表2.

圖2 肌肽血漿穩(wěn)定性的標準曲線

表2 化合物3a－3j的血漿穩(wěn)定性評價

3 結果與討論

從表1可以看出，肌肽酯類衍生物在三種濃度下都有增殖脾細胞的作用，但不是呈線性分布，增殖率最高的往往出現在低濃度組和中濃度組，這表明化合物的濃度對脾細胞的增殖率影響很大，合適的濃度設置是實驗成敗的關鍵.實驗結果表明，肌肽并沒有顯示出脾細胞增殖作用，相反還有輕微的抑制作用.化合物3b的低濃度組增殖率為123.2%，中濃度組為95.6%，均超過陽性對照組，高濃度組增殖率為67.8%，也與陽性對照組非常接近，說明3b在低濃度時即對脾細胞有很好的增殖作用;化合物3c在中濃度時的增殖率為70.5%，也超過陽性對照組，說明3c在中濃度時對脾細胞有不錯的增殖效果;化合物3d在低濃度組增殖率為93.8%，也超過陽性對照組，顯示了很好的增殖作用;化合物3e在高濃度組增殖率為69.5%，也略高于陽性對照組，其余的肌肽酯類衍生物均具有中等強度的脾細胞增殖作用.這說明通過對肌肽羧基結構修飾成酯基可以增加肌肽對脾細胞增殖作用，使肌肽衍生物具有新的藥理活性.

通過研究發(fā)現，脾細胞增殖活性高于陽性對照組的四個化合物3b－3e的碳鏈長度為2～4之間，過長或過短都使增殖活性降低，為以后設計合成肌肽酯類衍生物的碳鏈長度提供依據.通過實驗數據發(fā)現肌肽并沒有顯示出脾細胞增殖作用，相反，還有輕微的抑制作用.雖然有文獻［6］顯示服用肌肽可以使應激小鼠脾細胞的個數不下降，但并未得出肌肽可以使脾細胞增殖的結論，可能肌肽在體內是通過其他途徑發(fā)揮的作用.而肌肽酯類衍生物對脾細胞增殖活性很好，且有4個化合物的增殖率超過陽性對照組，由此證明:肌肽酯類衍生物具有有絲分裂原的作用，具有較強的提高免疫力的作用，這4個化合物具有進一步研究的價值.

從血漿穩(wěn)定性實驗數據來看，通過對肌肽的結構修飾，極大地提高了肌肽衍生物的血漿穩(wěn)定性.肌肽的半衰期僅為8.37min，而修飾得到的化合物2h的水解率均未超過5%，與肌肽相比，它們的水解很緩慢，血漿中的相對穩(wěn)定可以保證它們溫和地水解成肌肽，使肌肽達到治療濃度從而發(fā)揮治療作用.與肌肽酰胺類衍生物相比［7］，肌肽酯類衍生物的血漿穩(wěn)定性相對差一些，因為血漿中存在酯酶，它們會使酯鍵斷裂從而得到肌肽，肌肽再被肌肽酶水解得到L－組氨酸和β－丙氨酸，而酰胺鍵在這些酶的存在下相對穩(wěn)定，不易水解成肌肽，這也阻止肌肽酰胺類衍生物發(fā)揮藥理作用.通過穩(wěn)定性實驗發(fā)現，肌肽的不穩(wěn)定基團是肽鍵，它是肌肽酶主要的識別位點，通過對肌肽的羧基修飾成酯，改變了肌肽的結構，增加了肽鍵附近的空間位阻，使血漿中的肌肽酶無法識別出結合位點從而提高了化合物的血漿穩(wěn)定性.血漿穩(wěn)定性是化合物成藥性的關鍵一環(huán)，它決定候選化合物是否有機會成為藥物，肌肽是一個多功能的化合物，有著許多重要的藥理活性，但阻止其成為藥物的關鍵因素就是血漿穩(wěn)定性差，半衰期短，通過結構修飾極大地提高了其血漿穩(wěn)定性，使其成藥性的幾率大大增加，離開發(fā)成為藥物更近了一步.

綜上，化合物3b、3c、3d和3e具有良好的血漿穩(wěn)定性和脾細胞增殖活性，具有深入研究的價值.

［1］Aldini G，Carini M，Beretta G，et al.Carnosine is a quencher of 4－h(huán)ydroxy－nonenal:through what mechanism of reaction［J］.Biochem Biophys Res Commun，2002，298(5):699－706.

［2］Carini M，Aldini G，Beretta G，et al.Acrolein－sequestering ability of endogenous dipeptides:characterization of carnosine and homocarnosine/acrolein adducts by electrospray ionization tandem mass spectrometry［J］.J Mass Spectrom，2003，38(9):996－1006.

［3］Hobart LJ，Seibel I，Yeargans GS，et al.Anti－crosslinking properties of carnosine:significance of histidine［J］.Life Sci，2004，75 (11):1379－1389.

［4］Szwergold BS.Carnosine and anserine act as effective transglycating agents in decomposition of aldose－derived Schiff bases［J］.Biochem Biophys Res Commun，2005，336(1):36－41.

［5］臧皓，李曉東，黃曉光，等.肌肽酯類衍生物的合成與生物活性評價［J］.中國藥物化學雜志，2014，24(5):364－369.

［6］Li YF，He RR，Tsoi B，et al.Anti－stress effects of carnosine on restraint－evoked immunocompromise in mice through spleen lymphocyte number maintenance［J］.PLoS One，2012，7(4):e33190.

［7］臧皓，孫佳明，黃曉光，等.N－取代肌肽酰胺類衍生物的的合成及生物活性［J］.高等學校化學學報，2014，35(12):2567－ 2573.

(責任編輯:王海波)

R914

1008－7974(2016)06－0060－03

10.13877/j.cnki.cn22－1284.2016.12.019

2016－08－26

吉林省教育廳項目“基于UPLC－Q－TOF－MS的代謝組學技術研究草蓯蓉抗衰老的作用機理”(吉教科合字［2013］第399號)

臧皓，吉林長春人，博士研究生，講師.

張海豐，博士研究生，副教授.Email:dragon1976999@163.com