高 玲

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東青島 266109)

制取小麥旗葉粗酶液的最佳緩沖體系研究

高 玲

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東青島 266109)

[目的]探討制取小麥旗葉粗酶液的最佳緩沖體系。[方法]采用不同的緩沖體系制備小麥旗葉粗酶液，測定小麥旗葉中過氧化物酶(POD)、淀粉酶、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、脂氧合酶(LOX)的活力。 [結(jié)果] 當(dāng)pH為6.2時，POD活力最高；當(dāng)pH為5.8時，淀粉酶活力最高；當(dāng)pH為7.0時，PAL和LOX活力最高。選用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液為提取緩沖液時，PAL和LOX活力最高。當(dāng)此緩沖液濃度為0.15 mol/L時，POD活力最高；當(dāng)此緩沖液濃度為0.10 mol/L時，淀粉酶和LOX活力最高；當(dāng)此緩沖液濃度為0.05 mol/L時，PAL活力最高。 [結(jié)論]制取粗酶液的最佳緩沖體系是pH 7.0、0.10 mol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液。

小麥；旗葉；粗酶液；緩沖體系

小麥籽粒產(chǎn)量主要依賴于小麥開花后光合物質(zhì)的積累[1-2]，而旗葉是小麥生育后期重要的光合器官，其功能期的長短與小麥的單穗重和千粒重的關(guān)系極為密切。目前，國內(nèi)外對籽粒干物質(zhì)積累的作用已有大量報道。大量研究表明，小麥旗葉中保護酶含量的高低能在一定程度上反映葉片的衰老進程[3-4]，因此研究不同條件對旗葉中保護酶活性的影響可為生產(chǎn)中如何延長旗葉功能期，進而增加小麥產(chǎn)量提供理論依據(jù)[5-7]。但是，不同種酶采用提取液的類型、濃度、pH等存在差異[8-15]。筆者以小麥旗葉為試驗材料，探討制取小麥旗葉粗酶液的最佳緩沖體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 選用5月初大田種植的LN-3小麥旗葉為試驗材料。

1.2 試驗方法 先將采集的小麥旗葉葉片洗凈擦干，稱取0.2 g，加入適量緩沖液及少量石英砂，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管，10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min。記錄上清液體積，放入冰浴中備用。過氧化物酶(POD)活力的測定參照王學(xué)奎[16]的方法；淀粉酶(Amylase)活力的測定采用DNS法[17]；脂氧合酶(LOX)活力的測定參照鐘芳等[18]的方法；苯丙氨酸解氨酶(PAL)活力的測定參照邵伏文等[19]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH對小麥旗葉中酶活力的影響 用不同pH的緩沖液提取小麥旗葉中的混合酶，然后進行相應(yīng)酶活力的測定。從圖1、2可以看出，POD和淀粉酶活力在pH 6.0時最高，PAL和LOX活力在pH 7.0時最高。當(dāng)pH為7.0時，POD和淀粉酶活力分別為pH 6.0時酶活的92%和80%，因此在后續(xù)試驗中選取pH 7.0的緩沖液。

圖1 不同pH對小麥旗葉中POD和淀粉酶活力的影響Fig.1 The effects of different pH on the activities of POD and amylase in flag leaves of wheat

圖2 不同pH對小麥旗葉中PAL和LOX活力的影響Fig.2 The effects of different pH on the activities of PAL and LOX in flag leaves of wheat

2.2 不同緩沖液類型對小麥旗葉中酶活力的影響 在確定不同酶活力最高的pH大致范圍后，為分析不同緩沖液類型對小麥旗葉中酶活力的影響，試驗選用3種pH相同但組分不同的常用緩沖體系對酶活力進行測定。從圖3、4可以看出，磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液最適合這4種酶，此條件下PAL和LOX活力最高，POD活力達到最高活力的74.5%，淀粉酶活力達到最高活力的78.0%。

圖3 不同緩沖液類型對小麥旗葉中POD和淀粉酶活力的影響Fig.3 The effects of different types of buffer on the activities of POD and amylase in flag leaves of wheat

圖4 不同緩沖液類型對小麥旗葉中PAL和LOX活力的影響Fig.4 The effects of different types of buffer on the activities of PAL and LOX in flag leaves of wheat

2.3 不同濃度的緩沖液對小麥旗葉中酶活力的影響 為了探討緩沖液的濃度變化對酶活力的影響，試驗選用對4種酶均適合的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液進行。從圖5、6可以看出，當(dāng)緩沖液濃度為0.15 mol/L時，POD活力最高；當(dāng)緩沖液濃度為0.10 mol/L時，淀粉酶和LOX活力最高；當(dāng)緩沖液濃度為0.05 mol/L時，PAL活力最高。

圖5 不同緩沖液濃度對小麥旗葉中POD和淀粉酶活力的影響Fig.5 The effects of buffer concentration on the activities of POD and amylase in flag leaves of wheat

圖6 不同緩沖液濃度對小麥旗葉中PAL和LOX活力的影響Fig.6 The effects of buffer concentration on the activities of PAL and LOX in flag leaves of wheat

2.4 pH的微調(diào)對小麥旗葉中酶活力的影響 為了探討緩沖液pH的細微變化對酶活力的影響，選擇對4種酶均適合的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液進行試驗。從圖7、8可以看出，當(dāng)pH為5.8時，小麥旗葉中淀粉酶活力最高；當(dāng)pH為6.2時，POD活力最高；當(dāng)pH為7.0時，PAL和LOX活力最高。

圖7 pH的微調(diào)對小麥旗葉中POD和淀粉酶活力的影響Fig.7 The effects of fine adjustment of pH on the activities of POD and amylase in flag leaves of wheat

圖8 pH的微調(diào)對小麥旗葉中PAL和LOX活力的影響Fig.8 The effects of fine adjustment of pH on the activities of PAL and LOX in flag leaves of wheat

3 討論與結(jié)論

酶的結(jié)構(gòu)特點及催化特性決定了不同的酶在活力最高時所需的條件不同，因此提取酶所用的緩沖體系的類型、pH、溶液離子濃度的高低等是必須考慮的因素。小麥籽粒產(chǎn)量的高低與旗葉的功能期長短直接相關(guān)，因此旗葉中各種酶的活力成為檢測旗葉功能的重要指標(biāo)。在測定各種酶活力時應(yīng)根據(jù)不同的酶選擇不同的緩沖體系進行提取與測定，增加了工作量和難度。筆者采用不同的緩沖體系對小麥旗葉中POD、淀粉酶、PAL、LOX這4種酶活力進行了測定。結(jié)果表明，當(dāng)pH為6.2時，POD活力最高；當(dāng)pH為5.8時，淀粉酶活力最高；當(dāng)pH為7.0時，PAL和LOX活力最高。磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液最適合這4種酶，此條件下PAL和LOX活力最高，POD活力達到最高活力的74.5%，淀粉酶活力達到最高活力的78.0%。

當(dāng)緩沖液濃度為0.15 mol/L時，POD活力最高；當(dāng)緩沖液濃度為0.10 mol/L時，淀粉酶與LOX活力最高；當(dāng)緩沖液濃度為0.05 mol/L時，PAL活力最高。 綜上所述，提取小麥旗葉中混合酶的粗酶液的最佳緩沖體系為pH 7.0、0.10 mol/L 磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液。參考文獻

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Study on the Optimum Buffering System for Preparing Crude Enzymes in Flag Leaves of Wheat

GAO Ling

(College of Life Sciences, Qingdao Agricultural University, Qingdao, Shandong 266109)

[Objective] To study the optimum buffering system for preparing crude enzymes in flag leaves of wheat. [Method] Taking flag leaves of wheat as test materials, different buffering systems were used to prepare crude enzymes in flag leaves of wheat. And the activities of POD, amylase, PAL, LOX in flag leaves of wheat were determined. [Result] When pH was 6.2, POD activity was the highest; When pH was 5.8, amylase activity was the highest; When pH was 7.0, both PAL activity and LOX activity reached the maximum values. When Na2HPO4-NaH2PO4buffer was used as the extracting buffer in the test, PAL and LOX activities both reached the maximum values. When the concentration of Na2HPO4-NaH2PO4buffer was 0.15 mol/L, POD activity was the highest; When the concentration of Na2HPO4-NaH2PO4buffer was 0.10 mol/L, amylase activity and LOX activity reached the maximum values; When the concentration of Na2HPO4-NaH2PO4buffer was 0.05 mol/L, PAL activity was the highest. [Conclusion] The optimum buffering system for preparing crude enzymes in flag leaves of wheat was Na2HPO4-NaH2PO4buffer(pH 7.0, 0.10 mol/L).

Wheat; Flag leaves; Crude enzymes; Buffering system

青島市民生科技計劃項目(14-2-3-43-nsh)。

高玲(1967- )，女，山東濰坊人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事酶學(xué)和蛋白質(zhì)研究。

2016-11-11

S 512.1；Q 55

A

0517-6611(2016)35-0017-03