劉明海 吳昌學(xué) 葉凌 劉楊 陳量 劉艷潔△

(1.貴陽(yáng)市花溪區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué)病理教研室，貴州 貴陽(yáng) 550004)

硫酸軟骨素對(duì)低營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用的觀察

劉明海1吳昌學(xué)2葉凌1劉楊3陳量3劉艷潔3△

(1.貴陽(yáng)市花溪區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué)病理教研室，貴州 貴陽(yáng) 550004)

目的 通過(guò)觀察硫酸軟骨素對(duì)體外培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞株生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞生存率和超微結(jié)構(gòu)的影響，探討硫酸軟骨素對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)作用及損害的保護(hù)作用。 方法 培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，觀察正常SH-SY5Y細(xì)胞、低營(yíng)養(yǎng)處理及硫酸軟骨素處理SH-SY5Y細(xì)胞的形態(tài)及細(xì)胞活力。用光學(xué)顯微鏡及透射電子顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)改變，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率。結(jié)果 硫酸軟骨素處理組SH-SY5Y細(xì)胞較低營(yíng)養(yǎng)處理組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)好，細(xì)胞形態(tài)完整，低營(yíng)養(yǎng)處理組存活細(xì)胞數(shù)量減少，突起減少、變短；電鏡觀察低營(yíng)養(yǎng)處理組細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體及線粒體腫脹呈空泡狀，部分細(xì)胞破裂成碎片，正常對(duì)照組和硫酸軟骨素處理組細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體及線粒體結(jié)構(gòu)正常；細(xì)胞存活率低營(yíng)養(yǎng)處理組較對(duì)照組明顯降低，相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)存活細(xì)胞數(shù)量較少，而硫酸軟骨素處理組較對(duì)照組和低營(yíng)養(yǎng)處理組存活率明顯升高，存活細(xì)胞數(shù)量明顯增多。結(jié)論 硫酸軟骨素可延長(zhǎng)SH-SY5Y細(xì)胞生存時(shí)間，可維持和改善低營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)及生理功能。硫酸軟骨素對(duì)保護(hù)和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)具有一定作用。

SH-SY5Y細(xì)胞； 硫酸軟骨素； 細(xì)胞生存率； 超微結(jié)構(gòu)

近年研究表明，硫酸軟骨素作為細(xì)胞外基質(zhì)中主要的組成成分對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)及存活具有十分重要的作用。硫酸軟骨素作為抗動(dòng)脈硬化和阿爾茨海默病的輔助藥物在臨床中也得到應(yīng)用。硫酸軟骨素有緩和的抗凝血作用，在體內(nèi)與蛋白質(zhì)形成硫酸軟骨素蛋白多糖(CSPGs),CSPGs可減弱β-淀粉樣蛋白對(duì)海馬神經(jīng)元的破壞作用，并可迅速降解酪氨酸，防止酪氨酸對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的破壞作用，增強(qiáng)神經(jīng)元的活性。腦缺血缺氧引起腦組織及功能損害在臨床極為常見(jiàn)。關(guān)于硫酸軟骨素對(duì)腦缺血導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損害的保護(hù)作用方面的研究較少，本研究旨在通過(guò)硫酸軟骨素對(duì)體外培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞株生長(zhǎng)的影響，探討其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，為進(jìn)一步研究大腦損害的治療及臨床用藥提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞試劑：SH-SY5Y細(xì)胞(購(gòu)自德國(guó)German Collection of Microorganisms and Cell Cultures 公司)；DMEM 培養(yǎng)液(購(gòu)自英國(guó) Gibco Invitrogen 公司)；胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)及培養(yǎng)細(xì)胞用青霉素—鏈霉素(購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5- 二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT](購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)；硫酸軟骨素注射液(湖南康普藥業(yè)有限公司)；H-7650 透射電鏡( 日本日立公司 )；ELX 800酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tec公司)。

1.2 方法

1.2.1 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存SH-SY5Y細(xì)胞株復(fù)蘇，并于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后換培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1∶100雙抗的DMEM)繼續(xù)培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底傳代繼續(xù)培養(yǎng)。正常對(duì)照組細(xì)胞用完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1∶100雙抗的DMEM)培養(yǎng)，低營(yíng)養(yǎng)處理組細(xì)胞用完全培養(yǎng)基(含5%胎牛血清、1∶100雙抗的DMEM)培養(yǎng)，硫酸軟骨素處理組細(xì)胞用0.4 mg/mL硫酸軟骨素處理(含5%胎牛血清、1∶100雙抗的DMEM)培養(yǎng)96 h以上。

1.2.2 細(xì)胞存活數(shù)量觀察 觀察相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)正常組SH-SY5Y細(xì)胞，低營(yíng)養(yǎng)組細(xì)胞和經(jīng)硫酸軟骨素處理組細(xì)胞的數(shù)量，并進(jìn)行對(duì)比。計(jì)數(shù)前換液，用0.25%胰酶進(jìn)行消化5 min，貼壁細(xì)胞脫落形成細(xì)胞懸液后，用移液器將細(xì)胞分散均勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100 μL，鋪板時(shí)使待測(cè)細(xì)胞密度達(dá)1 000～10 000 孔(邊緣孔用無(wú)菌PBS填充)；5%CO2，37 ℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，加入濃度梯度的藥物，每孔100 μL，設(shè)3個(gè)復(fù)孔；5%CO2，37 ℃孵育16～48 h，倒置顯微鏡下觀察；每孔加入0.5%MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2～3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液；終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液；每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570 nm處測(cè)量各孔的吸光值；同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)、對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)。

1.2.4 電子顯微鏡觀察細(xì)胞處理 PBS清洗細(xì)胞兩次，刮取細(xì)胞并用PBS形成細(xì)胞懸液，離心(800～1 000 r/min)獲得細(xì)胞沉淀，棄去PBS，用電鏡固定液重懸細(xì)胞，4 °C保存待檢。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)觀察

相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)與對(duì)照組比較，低營(yíng)養(yǎng)處理組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)明顯下降，細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞突起明顯減少；經(jīng)硫酸軟骨素處理的SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞數(shù)量多，突起多有分枝并交織成網(wǎng)狀。

2.2 細(xì)胞生存時(shí)間觀察

從表1可見(jiàn)，培養(yǎng)72 h后，對(duì)照組細(xì)胞及低營(yíng)養(yǎng)組細(xì)胞存活率均明顯下降，細(xì)胞計(jì)數(shù)存活細(xì)胞數(shù)量也明顯下降；硫酸軟骨素處理組細(xì)胞存活率較對(duì)照組及低營(yíng)養(yǎng)處理組都明顯升高，細(xì)胞計(jì)數(shù)存活細(xì)胞數(shù)量明顯升高。

分 組 細(xì)胞存活率細(xì)胞計(jì)數(shù)(×106個(gè)/mL)對(duì)照組(10%FBS)0.25±0.037.2±1.5低營(yíng)養(yǎng)處理組(5%FBS)0.05±0.02a2.2±1.3a硫酸軟骨素處理組(0.4mg/mL)0.85±0.23ab7.8±1.4ab

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與低營(yíng)養(yǎng)處理組相比，bP<0.05。

2.3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞存活率

從表2可見(jiàn)，細(xì)胞經(jīng)不同濃度硫酸軟骨素處理培養(yǎng)72 h后，隨著硫酸軟骨素處理濃度升高，細(xì)胞存活率逐漸升高，當(dāng)處理濃度達(dá)到0.80 mg/mL時(shí)細(xì)胞存活率未見(jiàn)明顯升高。

表2 細(xì)胞存活率觀察

2.4 電子顯微鏡觀察

從圖2可見(jiàn)，細(xì)胞經(jīng)硫酸軟骨素處理形態(tài)與對(duì)照組細(xì)胞無(wú)明顯差異；電鏡觀察顯示，細(xì)胞核、線粒體結(jié)構(gòu)清晰，硫酸軟骨素處理細(xì)胞內(nèi)吞飲小泡較多。

圖2 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

3 討 論

硫酸軟骨素是細(xì)胞外基質(zhì)中主要的組成成分，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)及存活具有十分重要的作用。CSPGs可減弱β-淀粉樣蛋白對(duì)海馬神經(jīng)元的破壞作用，迅速降解酪氨酸，防止酪氨酸對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的破壞作用，增強(qiáng)神經(jīng)元的活性。CSPGs能激活胞內(nèi)蛋白激酶，增加DNA和RNA合成，加速蛋白合成，從而促進(jìn)海馬與神經(jīng)軸突等神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)，修復(fù)受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，促進(jìn)神經(jīng)突起的再生長(zhǎng)。因此，硫酸軟骨素對(duì)受損的腦細(xì)胞具有支持存活、延緩死亡、增強(qiáng)修復(fù)和再生的能力[1-2]。

以往臨床治療中硫酸軟骨素主要用于降血脂、軟化血管和抗動(dòng)脈粥樣硬化，隨著對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)作用研究的不斷深入，其應(yīng)用范圍也日益廣泛，在神經(jīng)性頭痛、神經(jīng)退行性病變治療中也取得一定效果。但也有研究表明，在治療過(guò)程中，過(guò)度表達(dá)的硫酸軟骨素會(huì)促進(jìn)角質(zhì)瘢痕形成，抑制神經(jīng)元軸突及突觸的生長(zhǎng)，在神經(jīng)損害修復(fù)中起到了負(fù)面作用[3]。所以，對(duì)硫酸軟骨素在神經(jīng)損害后作用機(jī)制的研究對(duì)臨床安全用藥具有十分重要的意義。研究顯示，腦缺血缺氧后神經(jīng)元中線粒體融合受到阻礙，導(dǎo)致線粒體形態(tài)異常及功能障礙[4]。急性缺血大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)也觀察到線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，高爾基體結(jié)構(gòu)不清[5]。我們的研究結(jié)果亦顯示，低營(yíng)養(yǎng)處理組SH-SY5Y細(xì)胞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，高爾基體腫脹，而硫酸軟骨素處理組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)腫脹擴(kuò)張較少；檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和活力發(fā)現(xiàn)，硫酸軟骨素能較好地維持SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，延長(zhǎng)細(xì)胞在低營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下的生存時(shí)間，說(shuō)明藥物對(duì)細(xì)胞具有一定保護(hù)作用。以往研究認(rèn)為，硫酸軟骨素對(duì)腦缺血損害的主要作用體現(xiàn)在緩和的抗凝血、溶栓、通栓及改善腦血管微循環(huán)方面。研究表明，每1 mg硫酸軟骨素A相當(dāng)于0.45 U肝素的抗凝活性，這種抗凝活性并不依賴于抗凝酶Ⅲ而發(fā)揮作用，它可以通過(guò)纖維蛋白原系統(tǒng)而發(fā)揮抗凝血活性，因此具有溶栓、通栓作用[6]。因此，硫酸軟骨素能夠改善腦血管的微循環(huán)，增加腦組織灌流量，改善腦缺血。作為重要的細(xì)胞外基質(zhì)，它對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的生存內(nèi)環(huán)境可產(chǎn)生直接影響，本研究結(jié)果顯示硫酸軟骨素對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，對(duì)低營(yíng)養(yǎng)損害有一定保護(hù)作用。但鑒于硫酸軟骨素過(guò)量表達(dá)會(huì)抑制神經(jīng)元生長(zhǎng)并形成角質(zhì)瘢痕，所以將其作為腦損害治療藥物的用量及用藥時(shí)機(jī)還有待進(jìn)一步深入研究。

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Observation of protective function of chondroitin sulfate proteoglycans in SH-SY5Y cell treated with low serum medium

LiuMinghai1,WuChangxue2,Yelin1,LiuYang3,ChenLiang3,LiuYanjie3.

1.DepartmentofNeurology,HuaxiDistractPeople'sHospitalofGuiyangCity,Guiyang550004,China. 2.KeyLaboratoryofMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China. 3.DepartmentofPathology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China.

Objective To investigate the protecting function of chondroitin sulfate proteoglycans in neuron injury, through observing growth state, survival rate and ultrastructure of SH-SY5Y cell line treated with chondroitin sulfate proteoglycans. Methods To observe the difference between normal SH-SY5Y cell and the cell line treated with sulfate proteoglycans and low serum medium, to observe morphology by light microscopy and electron microscopy, to observe survival rate of cell line by MTT. Results The growth of SH-SY5Y cell treated with sulfate proteoglycans was greater than normal SH-SY5Y cell and cell treated with low serum medium. The shorter neurite and decreased amount was observed in SH-SY5Y treated with low serum medium, mitochondrial, golgi and endoplasmic reticulum swelling was observed by electron microscopy, but the impairment of ultrastructure in SH-SY5Y cell treated with chondroitin sulfate proteoglycans was slighter than SH-SY5Y cell treated with low serum medium. The higher survival rate and amount of living cells was observed in SH-SY5Y cell treated with chondroitin sulfate proteoglycans than SH-SY5Y cell treated with low serum medium and control. Conclusion The chondroitin sulfate proteoglycans can protect neuron improve survival rate of the neurons and decrease impairment.

SH-SY5Y cell; Chondroitin sulfate proteoglycans; Survival rate Ultrastructure

國(guó)家自然科學(xué)基金(81260417)；貴州省科技廳貴州醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合基金[黔科合LG(2012)006號(hào)]

R392.12

A

1000-744X(2016)02-0146-03

2015-08-05)

△通信作者，E-mail：lyj_liuyanjie@hotmail.com