張俊 孔德斌 蔡云鵬 李建華

(烏魯木齊市生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)醫(yī)院神經(jīng)外科，新疆 烏魯木齊 830063)

蘆丁對(duì)大鼠腦缺血性再灌注損傷的保護(hù)作用

張俊 孔德斌 蔡云鵬 李建華

(烏魯木齊市生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)醫(yī)院神經(jīng)外科，新疆 烏魯木齊 830063)

目的 探討蘆丁對(duì)腦缺血再灌注損傷的作用及機(jī)制。方法 30只SD 大鼠隨機(jī)分為3組。模型組和蘆丁組采用線栓法構(gòu)建大腦中動(dòng)脈局灶缺血(1.5 h)再灌注損傷模型，蘆丁組在缺血前 15 min腹腔注射蘆丁(10 mg /kg)， 模型組腹腔注射等量生理鹽水。術(shù)后 24 h處死大鼠，收集腦組織和血清，HE染色觀察腦組織病理形態(tài)學(xué)變化，ELISA檢測(cè)和RT-PCR檢測(cè)腦組織促炎癥細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β 和IL-8的表達(dá)變化， Western Blot檢測(cè)腦組織中Wnt，β-catenin，cyclin D 1 和 survivin 的表達(dá)變化。結(jié)果 蘆丁可減輕腦缺血再灌注損傷大鼠的腦組織病理形態(tài)學(xué)變化， Wnt和β-catenin的表達(dá)和促炎癥細(xì)胞因子TNF-α， IL-1β和IL-8表達(dá)(P< 0.05)。結(jié)論 蘆丁可通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)途徑介導(dǎo)的炎性反應(yīng)而減輕腦缺血再灌注損傷。

蘆丁; 腦缺血再灌注損傷; 促炎癥細(xì)胞因子; Wnt/β-catenin

腦缺血性卒中是導(dǎo)致人群致死和致殘的重要原因，僅次于心臟疾病和癌癥。而腦缺血再灌注損傷是導(dǎo)致腦缺血性卒中的重要病理過(guò)程，因此減輕腦缺血再灌注損傷具有重要的臨床意義[1-2]。蘆丁是一種從水果，蔬菜和植物中提取的黃酮類物質(zhì)，研究[3-4]發(fā)現(xiàn)其具有抗炎功效，而炎癥是導(dǎo)致腦缺血再灌注損傷的重要原因[5-6]。因此本實(shí)驗(yàn)以大鼠為研究對(duì)象，探討蘆丁對(duì)腦缺血再灌注損傷的作用及其機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物 雄性SD 大鼠 30 只，體質(zhì)量(220 ± 20)g，合格證號(hào) SCXK(京)2010-20149， 由北京華?？祵?shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。均提前 2 周購(gòu)入，放置在SPF動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)喂養(yǎng)。

1.2 藥物及試劑 白介素-6 ( IL-6) , 腫瘤壞死因子-α( TNF-α)、 白介素-8 ( IL-8)， ELISA檢測(cè)盒(Ebioscience, USA)，蘆丁注射液(哈森，中國(guó))，Wnt(CST, USA), β-catenin (CST, USA)，cyclin D 1(CST, USA) ，survivin(CST, USA),β-actin (abgent，USA), HE染色劑、顯微鏡(Olympus BX51)及成像系統(tǒng)(HITMAS-30)顯微鏡( Olympus BX51) 及成像系統(tǒng)(HITMAS-30)均為醫(yī)院病理科實(shí)驗(yàn)室臨床病理組提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組和腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型的構(gòu)建 30只SD大鼠隨機(jī)均分為假手術(shù)組、模型組和蘆丁組，每組10只。蘆丁組在缺血前 15 min腹腔注射蘆丁10 mg/kg，劑量參考文獻(xiàn)[7]，模型組腹腔注射等量生理鹽水，參照 Zea Longa方法[8]構(gòu)建腦缺血再灌注損傷手術(shù)。在戊巴比妥鈉(6 mL/kg)麻醉下，SD大鼠頸部正中切開， 依次序貫分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、 頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端及頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端。在頸內(nèi)動(dòng)脈近端備線， 遠(yuǎn)端放置動(dòng)脈夾，頸總動(dòng)脈切口，插入直徑為 0.286 mm 的標(biāo)記魚線，松開動(dòng)脈血管夾，標(biāo)記魚線向頸內(nèi)動(dòng)脈插入約20 mm， 栓線進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，穿過(guò)大腦中動(dòng)脈起始端至大腦前動(dòng)脈近端。固定栓線， 計(jì)時(shí)， 逐層縫合手術(shù)切口， 消毒， 將動(dòng)物放置籠中。缺血2 h 后將栓線拉出1 cm恢復(fù)血供行再灌注。假手術(shù)組除不插栓線外， 其余步驟同上。大鼠再灌注2 4 h 處死大鼠，收集血清和腦組織。

1.4 腦組織病理組織學(xué)檢查 腦組織置于 4%多聚甲醛液4 ℃后固定1周。依次脫水、透明、 浸蠟及包埋， 行厚 8 μm 冠狀切片、 常規(guī) HE 染色、 封片， 光鏡下觀察，損傷評(píng)分參考文獻(xiàn)[6]。

1.5 RT-PCR檢測(cè) IL-6, TNF-α 和 IL-8稱取適量腦組織，于液氮中研磨成粉末狀提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)量濃度，逆轉(zhuǎn)錄以及擴(kuò)增反應(yīng)按試劑盒說(shuō)明書。以管家基因β-actin作為內(nèi)參對(duì)照基因，用各樣本的Ct值按公式2-ΔΔCT計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的引物序列

1.6 ELISA檢測(cè)血清中IL-6、TNF-α 和 IL-8 表達(dá)水平 按照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作步驟檢測(cè) 血清中IL-6, TNF-α 和 IL-8表達(dá)水平。

1.7 Western blot檢測(cè)腦組織Wnt、β-catenin、cyclin D 1 和 survivin表達(dá) 取腦組織按照每50 mg組織中加入1 mL RIPA裂解液(以1∶50加入50×cocktail)，冰上勻漿，裂解30 min后，4 ℃ 12 000r/min離心30 min后取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。以含50 μg蛋白質(zhì)的上樣量，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳(5%濃縮膠，10%分離膠，恒壓80～100 V)后轉(zhuǎn)膜(PVDF膜,恒流300 mA)，然后洗膜，以5%脫脂奶粉(TBST配制)封閉1 h，Wnt(1∶1000), β-catenin (1∶1 000)，cyclin D 1 (1∶1 000) ， survivin (1∶1 000)，β-actin(1∶3 000)單抗孵育過(guò)夜，再次振洗后加入羊抗兔IgG-HRP(二抗)37 ℃孵育1 h。洗膜后加ECL試劑，Kodak化學(xué)發(fā)光儀曝光顯示目的蛋白并拍照。以Quantity one對(duì)條帶進(jìn)行定量分析，以目的條帶和β-actin條帶積分灰度值比值作為結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 腦缺血再灌注損傷的病理改變 與假手術(shù)組

比較，模型組神經(jīng)元細(xì)胞損傷，固縮核和神經(jīng)元染色明顯增加(P<0.001)，而蘆丁組神經(jīng)元細(xì)胞損傷，固縮核和神經(jīng)元染色明顯降低(P<0.05)。顯示蘆丁預(yù)處理可明顯減輕腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的腦損害，其損傷評(píng)分見圖1。

圖1 HE檢測(cè)蘆丁對(duì)腦組織病理改變的影響(*P<0.001，▲P<0.05)

2.2 蘆丁對(duì)促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和 IL-8表達(dá)的影響 結(jié)果顯示與假手術(shù)組比較，模型組促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和 IL-8 表達(dá)明顯增加(P<0.001)，而蘆丁組與模型組比較，促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和 IL-8 表達(dá)明顯減少(P<0.05)，提示蘆丁預(yù)處理可減輕促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和 IL-8 在腦組織的表達(dá) 。見圖2。

圖2 RT-PCR檢測(cè)蘆丁對(duì)促炎癥細(xì)胞因子TNF-α， IL-6和 IL-8的表達(dá)影響(*P<0.001，▲P<0.05)

2.3 蘆丁可對(duì)促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和 IL-8的分泌的影響 結(jié)果顯示與假手術(shù)組比較，模型組促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和 IL-8分泌明顯增加(P<0.001)，而蘆丁組與模型組比較，促炎癥

細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和 IL-8分泌明顯減少(P<0.05)，這提示蘆丁預(yù)處理可減輕促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和 IL-8 的分泌。見圖3。

圖3 ELISA檢測(cè)蘆丁對(duì)促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和 IL-8分泌的影響(*P<0.001，▲P<0.01，#P<0.05)

2.4 蘆丁對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響 結(jié)果顯示與假手術(shù)組比較，模型組Wnt和β-catenin蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.001)，而蘆丁組與模型組比較Wnt和β-catenin蛋白表達(dá)明顯減少 (P<0.05)，見圖4。蘆丁預(yù)處理可明顯抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活。

圖4 Western Blotting檢測(cè)蘆丁對(duì)Wnt和β-catenin蛋白表達(dá)影響

2.5 蘆丁對(duì)cyclin D 1 和 survivin表達(dá)的影響 結(jié)果顯示與假手術(shù)組相比，模型組cyclin D 1 和 survivin蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.001)，而蘆丁組與模型組相比cyclin D 1 和 survivin 蛋白表達(dá)明顯減少 (P<0.05)，見圖5。蘆丁預(yù)處理可明顯減少cyclin D 1 和 survivin的表達(dá)。

圖5 Western Blotting檢測(cè)蘆丁對(duì)cyclin D 1 和 survivin蛋白 表達(dá)影響(*P<0.001，▲P<0.05)

3 討 論

最近研究[5-6]發(fā)現(xiàn)腦組織缺血可導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞缺氧，從而機(jī)體ATP合成減少，引起炎癥反應(yīng)激活，腦組織血流灌注恢復(fù)后，炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加劇導(dǎo)致大量神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，壞死，進(jìn)而加劇腦組織損傷。因此減輕炎癥反應(yīng)是減輕腦缺血再灌注損傷的有效治療途徑之一。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,腦缺血再灌注損傷可引起腦神經(jīng)元細(xì)胞損傷，固縮核和神經(jīng)元染色明顯增加，引發(fā)腦組織結(jié)構(gòu)的改變，而蘆丁預(yù)處理可以明顯減輕腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的腦組織病理結(jié)構(gòu)的改變，經(jīng)蘆丁預(yù)處理后，神經(jīng)元細(xì)胞損傷，固縮核和神經(jīng)元染色明顯降低 。這提示蘆丁預(yù)處理可以明顯減輕腦缺血再灌注損傷，與既往的研究[5]報(bào)道一致。但具體機(jī)制不明，本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，蘆丁組促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、 IL-6和 IL-8 表達(dá)和分泌明顯減少, 提示蘆丁預(yù)處理可明顯抑制炎癥信號(hào)通路的激活,從而減輕腦缺血再灌注損傷。但蘆丁預(yù)處理抑制炎癥減輕腦缺血再灌注損傷的具體機(jī)制尚不清楚。Wnt/β-catenin信號(hào)途徑是一經(jīng)典細(xì)胞信號(hào)通路，可介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡，細(xì)胞分化，代謝等[7]。cyclin D 1 和 survivin 是Wnt/β-catenin信號(hào)途徑激活的定向靶向基因[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路激活可介導(dǎo)炎癥，而蘆丁可調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)途徑[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蘆丁可減少Wnt/β-catenin激活，和減少Wnt/β-catenin定向靶向基因cyclin D 1 和 survivin的表達(dá)。因此我們可以推測(cè)蘆丁可通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活而減輕炎癥。

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