何凌 綜述 尹愛華 校審

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣東省婦兒醫(yī)院 醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 511442）

耳聾是常見的致殘性疾?。?］，可導(dǎo)致言語交流障礙，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。世界范圍內(nèi)，每1000個新生兒中就有1～2個為聽力障礙患兒［2］。據(jù)2006年第二次全國殘疾人抽樣調(diào)查報告，我國聽力殘疾人多達2780萬人，約占全國人口的1.54%［3，4］。耳聾的原因有遺傳因素和環(huán)境因素，或遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果［5］。約60%的早發(fā)型耳聾為遺傳因素所致，很多遲發(fā)性聽力下降也與基因缺陷造成患者對致聾因素易感有關(guān)［6］。在遺傳性耳聾患者中，70%的患者除耳聾外不伴有其他癥狀，這類耳聾為非綜合征型耳聾，另外30%為伴其他癥狀的綜合征型耳聾。大部分的非綜合型遺傳性耳聾符合孟德爾遺傳方式，即單基因突變導(dǎo)致耳聾，約80%為常染色體隱性遺傳，15%～20%為常染色體顯性遺傳，X連鎖遺傳比較少見，約占1%［7］，而遵循母系遺傳的線粒體DNA基因突變致聾約占1%～4%［8，9］。隨著人類基因組計劃的完成，耳聾基因的定位和克隆取得了巨大的進步。分子診斷技術(shù)是目前檢測非綜合征型遺傳性耳聾的主要方法，通過確定耳聾患者及高危人群的相關(guān)突變位點，給予正確的指導(dǎo)及干預(yù)，可在一定程度上預(yù)防耳聾發(fā)生，并可對耳聾患者進行有針對性的治療［10］。

1 非綜合征型遺傳性耳聾致病基因概述

非綜合征型遺傳性耳聾具有高度遺傳異質(zhì)性。目前已被定位的與非綜合征型遺傳性耳聾相關(guān)的基因座已有100余個（http：／／hereditaryhearingloss.org／）。不同的種族、地區(qū)均有不同的致聾基因和突變位點。在眾多的耳聾致病基因中，GJB2、SLC26A 4和線粒體DNA基因是被研究最多的［11-13］。GJB 2基因是第一個被發(fā)現(xiàn)的遺傳性耳聾致病基因，也是導(dǎo)致非綜合征型遺傳性耳聾最常見的致病基因［14］。據(jù)世界各國對本國耳聾患者的GJB2基因進行的大規(guī)模調(diào)查研究報道，GJB2基因突變 約 占 非 綜 合 征 型 耳 聾 的 10% ～25%［5，12］。GJB 2基因在不同地區(qū)及種族有不同的突變熱點［11］：c.35delG是歐洲、中東、北美等最常見的突變位點；c.167del T是猶太人中最常見的突變熱點；c.235delC是東亞人群（中國、日本及韓國）最常見的突變熱點；c.427C＞T是加納人最常見的突變位點。據(jù)Pu Dai等［15］對中國26個不同地區(qū)的耳聾人群大規(guī)模調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國常見的GJB 2基因突變類型有：c.235delC、c.299-300del AT、c.176-191del16、c.109G＞A等，可占GJB 2基因突變?nèi)巳旱?0%以上。SLC26A 4基因是第二常見的耳聾致病基因。SLC26A 4基因突變與大前庭水管綜合征和Pendred綜合征密切相關(guān)［16］。目前發(fā)現(xiàn)的SLC26A 4基因突變已有170多種，其突變類型也是多種多樣。在歐美高加索人中，最常見的突變是c.707T＞C、c.1246A＞C、IVS8＋1G＞A等；而在東亞（中國、日本和韓國）人群中，IVS7-2A＞G及c.2168A＞G最常見［11，16］。線粒體DNA基因與氨基糖苷類抗生素藥物致聾及非綜合征型遺傳性耳聾密切相關(guān)［9］，其遺傳方式為母系遺傳。常見的突變有12S r RNA基因的m.1555A＞G和m.1494C＞T兩種，其中m.1555A＞G在我國耳聾患者中發(fā)生率約為3.9%［17］。GJB2、SLC26A4 和 線 粒 體 DNA 12S r RNA基因突變在我國遺傳性非綜合征型耳聾患者中約占全部致聾基因的33%［18］。明確致聾基因及突變位點，這使遺傳性耳聾篩查成為可能。

2 非綜合征型遺傳性耳聾的基因診斷

分子診斷是目前診斷非綜合征型遺傳性耳聾的主要方法。對非綜合征型遺傳性耳聾患者的準(zhǔn)確快速診斷有利于指導(dǎo)對患者進一步治療，從而改善其生存質(zhì)量，并通過確定耳聾患者及高危人群的相關(guān)突變位點，指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育，對提高我國人口質(zhì)量有重大意義。目前，針對耳聾患者的遺傳基因診斷已在國內(nèi)外開展，新生兒免費耳聾基因篩查也在一些城市如北京、上海進行，但由于檢測成本的原因未能在全國全面展開。耳聾基因篩查技術(shù)仍需不斷改進和完善。非綜合征遺傳性耳聾基因診斷的方法主要有以下幾種。

2.1 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP） 是遺傳性耳聾傳統(tǒng)的基因診斷方法。該技術(shù)是針對已知突變位點的染色體片段的檢測，對含有突變位點的片段及野生型片段進行PCR擴增，采用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶，分別對突變和野生的DNA片段進行酶切，由于DNA序列變異而引起酶切位點的改變，故有不同長度的酶切產(chǎn)物，對產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶區(qū)分出對應(yīng)的基因型。Pandya等［19］早在1997年利用該技術(shù)對三家系的線粒DNA 12S r RNA基因的m.1555A＞G、m.663 A＞G及16S r RNA基因的m.1736 A＞G突變位點進行檢測。Vivero R.J等［20］對217名非綜合征型耳聾患者采用PCRRFLP法檢測線粒體DNA基因的3個常見突變點（A1555G、G7444A、A3243G），并用直接測序法加以驗證，3個常見線粒體DNA基因突變的檢出率為1.84%。此法的優(yōu)點是：快速、簡單，適合小批量樣本的分型試驗，不需要特殊儀器。但存在的缺點有：不能同時檢測不同基因的多個突變位點，如要檢測多個突變位點，則需要多次PCR，工作量大；多態(tài)性過分依賴限制性內(nèi)切酶的種類和數(shù)量，對位點要求高，沒法準(zhǔn)確鑒別假陽性情況（酶切不完全）。

2.2 多重定量連接酶鏈反應(yīng)（multiplex quantitative ligase chain reaction，MQ-LCR） 定量連接酶鏈反應(yīng)是在檢測位點兩側(cè)的寡核苷酸探針標(biāo)記上一個熒光基團，該熒光基團在發(fā)生連接反應(yīng)時，兩個熒光基團被拉進則熒光消失，若有堿基錯配則不能發(fā)生連接反應(yīng)而熒光不消滅［21］。在熒光技術(shù)和LCR技術(shù)結(jié)合的基礎(chǔ)上，針對不同的檢測位點，選擇不同波段的熒光基團來標(biāo)記探針，便可以實現(xiàn)在一次反應(yīng)中檢測多個基因位點［22］。楊曉林等［23］以 MQLCR法對98名耳聾患兒進行檢測，檢測到GJB2基因突變致聾的有29例，線粒體DNA Al555G致聾的有4例，SLC26A4致聾的有15例。該方法操作簡單、快速、經(jīng)濟，但檢測一次需要較多的探針，且相近波段的熒光基團可能會有一定程度的相互干擾，定量判斷基因結(jié)果有待完善。

單核苷酸多態(tài)分型（single nucleotide polymorphisms scan，SNPscan）技術(shù)由上海天昊生物科技有限公司自主研發(fā)，該技術(shù)基本原理是采用連接酶連接反應(yīng)的高特異性實現(xiàn)對SNP位點等位基因的識別，然后通過在連接探針末段引入不同長度的非特異序列以及通過連接酶加接反應(yīng)獲得位點對應(yīng)的不同長度連接產(chǎn)物，利用標(biāo)記熒光的通用引物對連接產(chǎn)物進行PCR擴增，通過熒光毛細管電泳對擴增產(chǎn)物進行電泳分離，最后通過對Gene Mapper軟件分析獲取各個SNP位點的基因型（http：／／www.geneskies.com／index.php／Index／fenxing／fid／60.html）。具有高通量、高效、高準(zhǔn)確性、低成本等特點。張迪等［24］對天津市225例非綜合征型耳聾患者進行耳聾基因篩查，利用SNPscan技術(shù)對GJB2、SLC26A4和線粒體DNA 12S r RNA 3個基因的115個位點進行突變檢測，共找到明確基因致聾者111例（49.3%，111／225），經(jīng) Sanger測序驗證，符合率達100%。

2.3 變性高效液相色譜分析（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC） 變性高效液相色譜分析是一項在單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析和變性梯度凝膠電泳基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新的雜合雙鏈突變檢測技術(shù)。其工作原理是在部分變性的條件下，利用雜合雙鏈與純合雙鏈在柱中保留時間的差異，可以快速分析單個核苷酸的突變和多態(tài)性［25］。Zainal等［26］采用變性高效液相色譜法對91例非綜合征型遺傳性耳聾兒童及91例聽力正常兒童進行GJB 2基因檢測，對篩查出的突變位點進行DNA測序，在32例患兒及37例正常聽力兒童中檢測出GJB 2基因突變。戴樸等［27］對來自35個家庭的38例中重度感音性耳聾患者以高效液相色譜分析結(jié)合序列分析進行SLC26A 4基因分析，發(fā)現(xiàn)32個先證者攜帶有SLC26A4基因突變，在所有受檢患者中突變發(fā)現(xiàn)率91.4%（32／35）。此法具有高通量檢測、快速篩查等優(yōu)點。但只是一個定性的篩查技術(shù)，無法確定具體突變類型及突變位點，有異常峰形的樣本需進行DNA測序；許多片段有多個主要解鏈溫度，需要篩查的溫度較多，操作仍較繁瑣；其儀器設(shè)備昂貴，對技術(shù)人員要求高，在臨床中的應(yīng)用受限制，多用于實驗室研究。

2.4 多重等位基因特異性PCR技術(shù)（multiplex allele-specific PCR，MAS-PCR） 多重等位基因特異性PCR技術(shù)結(jié)合了多重PCR和等位基因特異性PCR的原理，其根據(jù)突變類型設(shè)計和合成多組PCR引物，通過適當(dāng)?shù)慕M合和調(diào)整，組成一個MAS-PCR體系，通過凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物中是否產(chǎn)生相應(yīng)的特異長度擴增帶，可以檢測出被檢樣品是否具有這種突變，還可判斷出這種突變是雜合子還是純合子。1999年，Scrimshaw等［28］首次將多重等位基因PCR技術(shù)應(yīng)用于線粒體12S r RNA基因A1555G突變檢測，發(fā)現(xiàn)新西蘭人中12S r RNA基因A1555G突變率與其他國家普通人群發(fā)病率相似，表示MAS-PCR是一種快速、經(jīng)濟、有效的檢測技術(shù)。Esteves MC等［29］也報道了應(yīng)用多重等位基因PCR技術(shù)對101個耳聾患者進行GJB2基因和GJB6基因突變檢測，6.93%的患者為GJB2基因c.35delG雜合突變，1%的患者為GIB2基因與GJB6基因雙重雜合突變（c.35delG／Del（D13S1830））。鄭靜等［30］采用多重等位基因特異性PCR同時檢測138例非綜合征型耳聾患者線粒體DNA 12S r RNA基因A1555G和C1494T突變，A1555G和C1494T突變的檢出率為7.97%，以DNA測序法驗證，兩種方法具有良好的一致性。此技術(shù)只需兩次PCR和一次凝膠電泳即可確定基因型，具有簡便、快速、經(jīng)濟、有效等優(yōu)點，也不需要昂貴的實驗設(shè)備。但由于特異引物的特異性較差，在某些情況下，即使引物的3’末端堿基與模板不互補，延伸仍可進行，產(chǎn)生不可靠的結(jié)果。

2.5 高分辨率熔解曲線分析（high resolution melting，HRM） 是猶他大學(xué)和愛德華科技公司合作開發(fā)的專門用于突變研究的技術(shù)，主要原理：利用雙鏈DNA受熱解離成為單鏈的核酸物理特性，采集解鏈時釋放的熒光信號繪制熔解曲線，再通過熔解曲線的變化來反映核酸性質(zhì)的差異［31］。國內(nèi)外均有文獻報道利用高分辨熔解曲線技術(shù)分析致聾基因［32，33］。有學(xué)者結(jié)合染料熔解曲線Tm值分型技術(shù)及熒光PCR多色多通道的雙重優(yōu)點，建立了多色熒光熔解曲線分析技術(shù)（multiplex fluorescence melting curve analysis，F(xiàn)MCA），實現(xiàn)了多位點的檢測［34，35］。該技術(shù)具有高通量、高靈敏度、自動化程度高、完全閉管操作等優(yōu)點，適合于臨床使用。存在的缺點是：檢測位點仍有局限，易受退火溫度、引物、鎂離子濃度、DNA模板質(zhì)量、PCR產(chǎn)物等多因素影響。

2.6 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS） 此技術(shù)的基本原理是：用一定強度的激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量，樣品解吸附，基質(zhì)-樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使得樣品分子電離，電離的樣品在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達檢測器的飛行時間不同來加以區(qū)分檢測（離子的質(zhì)量電荷比與其飛行時間成正比），并可獲得樣品分子的相對分子質(zhì)量，從而確定突變位點［36］。曾云等［37］采用 MALDI-TOF MS對454例非綜合征型耳聾患者檢測常見的4個耳聾致病基因的20個位點，包括：GJB2（c.35delG、c.167del T、c.176-191dell6、c.235delC、c.299-300del AT），GJB 3（c.538C＞T，c.547G＞A），SLA 26A 4（c.281C＞T，c.589G＞A），IVS7-2A＞G，c.1174A＞T，c.1226G＞A，c.1229C＞T，IVS15＋5G＞A，c.1975G＞C、c.2027T＞A、c.2162C＞T、c.2168A＞G），線粒體DNA 12S r RNA（m.1494C＞T、m.1555A＞G），通過用直接測序法證實，兩者符合率達100%。該技術(shù)具有檢測位點多、覆蓋率高、準(zhǔn)確、高通量、低成本、周期短等特點，適合大范圍、大規(guī)模的檢測項目。但此法對分析樣品的分離純化程度要求高，樣品需反復(fù)層析，儀器設(shè)備價格昂貴，需專業(yè)人員進行操作，其應(yīng)用受到限制。

2.7 生物芯片技術(shù) 是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一種新型、簡便的實用生物技術(shù)。按檢測載體可分為固相基因芯片和液相芯片?；蛐酒驹恚和ㄟ^光刻原位合成或點樣技術(shù)，將大量已知序列的DNA或寡核苷酸片段按特定順序密度固定在玻璃等載體上，待測基因經(jīng)擴增、熒光標(biāo)記后與探針雜交、洗樣后通過激光掃描，根據(jù)熒光強弱或熒光的種類可獲得樣品基因信息［38］。該技術(shù)具有高通量、高集成、微型化、連續(xù)化和自動化等特點，應(yīng)用于臨床可以在短時間內(nèi)完成大樣本的多基因篩查、診斷，操作簡單，結(jié)果容易判讀，檢測成本低，大大提高了診斷效率。國內(nèi)外學(xué)者均有利用基因芯片對耳聾基因進行了大量的應(yīng)用研究。Phyllis Gardner等［39］2006年報道應(yīng)用該技術(shù)實現(xiàn)了同時對8個耳聾基因 （GJB 2、GJB 6、GJB3、GJA 1、SLC26A 4、SLC26A 5和線粒體DNA 12S r RNA、t RNA-Ser基因）198個突變位點的檢測。也有報道［40，41］采用APEX、Invader等芯片檢測技術(shù)，可以同時針對數(shù)百個突變位點進行高通量檢測，但檢測周期較長、檢測成本也較高。目前國內(nèi)應(yīng)用較多的有北京博奧生物有限公司研發(fā)的晶芯耳聾基因芯片，可同時檢測4個基 因 （GJB2、GJB3、SLC26A4 和線粒 體 DNA 12S r RNA基因）9個突變位點［42］。為涵蓋足夠多的位點以提高耳聾基因突變檢出率，學(xué)者們不斷改進技術(shù)增加檢測位點，檢測位點最多可達16個［43］。但固相基因芯片技術(shù)目前仍存在許多缺點：檢測的信噪比較高，信號穩(wěn)定性較差，同一探針往往需要重復(fù)4～5個點方可判讀；試劑成本也較高，結(jié)果需要依賴于昂貴的激光掃描儀才能判讀；只能將一定數(shù)目的DNA探針固定于支持物上，檢測位點有限，對除點突變之外的其他突變類型的檢出能力有限，容易造成漏診。

2.9 SNaPshot技術(shù) 是一種基于熒光標(biāo)記單堿基延伸原理的分型技術(shù)，也稱小測序。其原理是：多重PCR擴增目的區(qū)域后，經(jīng)寡核苷酸引物延伸標(biāo)記擴增，突變位點匹配上一個熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸后終止延伸。然后通過毛細血管電泳進行片段分析，相當(dāng)于單個位點的微測序，可以檢測單核苷酸的突變。根據(jù)電泳峰的移動位置確定該延伸引物的片段長度，根據(jù)峰的顏色確定延伸位點的堿基類型，從而確定該樣本的基因型［45］。具有高通量、高效、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點。Bardien S等［46］在南非人群中利用此技術(shù)檢測與氨基糖甙類藥物致聾相關(guān)的5個線粒體 DNA 基因突變［A1555G、C1494T、T1095C、961del T＋C（n）和 A827G］，發(fā)現(xiàn)在南非黑人血統(tǒng)中A1555G突變的攜帶率為0.9%。Borum S等［47］報道采用此技術(shù)在韓國197名聽力正常人及139名新生兒中篩查7個常見致病突變點（GJB2-c.235delC、SLC26A 4-c.439A＞G、c.919-2A＞G、c.1149＋3A＞G、c.1229C＞T、c.2168A＞G和線粒體DNA基因m.1555A＞G）的攜帶率，檢出率分別為4.06%和4.32%。

2.10 DNA測序 即分析特定DNA片段的堿基序列。目前用于測序的技術(shù)主要有Sanger等發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法和Maxam及Gilbert發(fā)明的化學(xué)降解法。運用最多的是Sanger測序法。現(xiàn)Sanger測序技術(shù)的測序長度可達1000bp，堿基的讀取準(zhǔn)確率達99.99%，已成為測序的金標(biāo)準(zhǔn)。其具有技術(shù)平臺標(biāo)準(zhǔn)化、結(jié)果直觀、準(zhǔn)確率極高等優(yōu)點，但由于耳聾相關(guān)致病突變分散于數(shù)個基因上，或一個基因包含數(shù)個外顯子，測序成本高、檢測效率低、耗時長、對技術(shù)人員要求高以及檢測設(shè)備有限，應(yīng)用受到限制。

2.11 下一代測序技術(shù)（next generation sequencing，NGS） 也叫高通量測序，或深度測序，使耳聾基因研究和基因診斷步入一個新的高速發(fā)展階段。包括全基因組重測序技術(shù)（whole genome sequencing，WGS）、全外顯子測序技術(shù)（whole exome sequencing，WES）、目標(biāo)序列捕獲測序技術(shù)（targeted gene capture，TGC）等［48］。全外顯子組測序又稱為定向外顯子組捕獲（targeted exome capture），是優(yōu)先選擇編碼區(qū)的基因為目標(biāo)基因，利用外顯子捕獲技術(shù)獲取全基因組區(qū)域的全部外顯子序列并進行高通量測序。由于大部分孟德爾遺傳性疾病都是由致病基因的外顯子或者剪切區(qū)域的突變引起，外顯子組測序捕獲的目標(biāo)區(qū)域只占人類基因組長度的約1%，因此比進行全基因組序列測序更經(jīng)濟，且對目標(biāo)區(qū)域的覆蓋率高，便于變異檢測。目標(biāo)序列捕獲測序技術(shù)是利用微陣列技術(shù)合成大量寡核苷酸探針，與基因組上的特定區(qū)域互補結(jié)合，從而富集到特定區(qū)段，然后用第二代測序技術(shù)對這些區(qū)段進行測序［49］。目前認為目標(biāo)序列捕獲測序技術(shù)的最大優(yōu)勢在于，任何一個感興趣的基因組區(qū)域都可以被設(shè)計出來而被富集，目標(biāo)區(qū)域更有針對性，測序深度更高，測序的數(shù)據(jù)分析計算量較小，與生物學(xué)表型結(jié)合更為直接，而且費用也大大降低。盧宇等［50］應(yīng)用全外顯子組測序技術(shù)鑒定2位患者的一個家系的致聾基因，對11名家系成員進行全外顯子組測序確定候選基因，并對所有家系成員進行候選基因突變的Sanger測序驗證，確定耳聾基因ACTG1第4外顯子c.364A＞G（p.I122V）突變?yōu)樵摱@家系的致病原因。Baek JI等［51］2012年報道了在8個韓國家系中以80個已知耳聾基因為目標(biāo)區(qū)域的大規(guī)模平行測序研究，檢出了5個耳聾家系為常染色體顯性遺傳，為5種不同致病基因的5個突變所致，其中4個基因是未曾報道的，此研究中未檢出熱點突變基因。Xue Gao等［52］對一中國家系進行常染色體非綜合征性耳聾分析，采用目標(biāo)捕獲技術(shù)捕獲82個已知耳聾基因，采用二代測序分析及生物信息學(xué)分析，確定TMC1c.1714G＞A為致病基因，在家系中共分離。Gu X等［53］也報道了對63名散發(fā)的非綜合征耳聾患者進行檢測，應(yīng)用目標(biāo)序列捕獲技術(shù)捕獲131個已知耳聾基因，采用大規(guī)模平行序列分析，檢出14個致病基因，其中10個為新發(fā)致病突變。二代測序技術(shù)降低了測序成本，極大地提高了耳聾致病基因的研究效率，能夠獲得編碼區(qū)測序覆蓋度更深、準(zhǔn)確性更高的數(shù)據(jù)。但目前仍存在不足：①目標(biāo)序列捕獲技術(shù)在目標(biāo)區(qū)域捕獲時存在偏倚，盡管增加測序深度可以一定程度彌補偏倚，但是仍有部分區(qū)域難以捕獲；②大規(guī)模平行測序?qū)蚪M結(jié)構(gòu)變異的檢測具有局限性，通過增加測序深度和改進數(shù)據(jù)分析算法已顯著提高了其檢測能力，但其靈敏度和特異度仍然低于點突變的檢測；③大多數(shù)非編碼序列和表觀遺傳學(xué)的修飾尚無法應(yīng)用該技術(shù)檢出，可能因此存在一定的假陰性結(jié)論；④該技術(shù)獲得的檢測結(jié)果仍然需要通過Sanger測序等方法進行驗證；⑤在大量的檢出數(shù)據(jù)中仍有部分突變未確定是否與耳聾相關(guān)，或部分突變的致病性尚存爭議，需要更加大量的數(shù)據(jù)和詳盡的分析。

3 展望

耳聾是一種嚴(yán)重影響人類生活質(zhì)量的常見疾病，其對個人、社會的影響之大是不言而喻的。流行病學(xué)研究顯示，我國正常人群中至少4%～5%為耳聾相關(guān)基因攜帶者［54］。在新生兒中普遍開展耳聾致病基因篩查，做到早期診斷，可指導(dǎo)攜帶致病基因的兒童行為，預(yù)防疾病的發(fā)生。對確診的耳聾患者及早進行語言訓(xùn)練和干預(yù)治療（耳蝸移植、配戴助聽器等），也可極大提高患者的生活質(zhì)量。產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢的開展，也會大大降低先天性耳聾患兒的出生率，從而提高我國人口質(zhì)量，減輕社會壓力。非綜合征型遺傳性耳聾具有高度的遺傳異質(zhì)性，各突變位點在不同種族、不同地域均有極大差異。在非綜合征型遺傳性耳聾診斷中，分子診斷作為查找致病原因、協(xié)助臨床診斷和開展產(chǎn)前診斷的主要手段發(fā)揮了重要作用。上述的各種基因檢測技術(shù)存在各自的優(yōu)缺點，應(yīng)根據(jù)病人的自身特點，結(jié)合以上各種技術(shù)的優(yōu)勢，制定個性化的檢測方案。下一代測序技術(shù)能發(fā)現(xiàn)新基因、新突變點，能檢測所有耳聾相關(guān)基因，具有廣泛的應(yīng)用前景，必將是未來很長一段時間內(nèi)非綜合征型遺傳性耳聾基因研究的主要手段，但該技術(shù)的臨床應(yīng)用目前仍充滿挑戰(zhàn)，諸多方面的問題有待解決及完善。

［1］ Matsunaga T.Value of genetic testing in the otological approach for sensorineural hearing loss［J］.Keio J Med，2009，58（4）：216-222.

［2］ Tekin D，Yan D，Bademci G，et al.A next-generation sequencing gene panel（MiamiOtoGenes）for comprehensive analysis of deafness genes［J］.Hear Res，2016，333：179-184.

［3］ Yuan Y，Zhang X，Huang S，et al.Common molecular etiologies are rare in nonsyndromic Tibetan Chinese patients with hearing impairment［J］.PLoS One，2012，7（2）：e30720.

［4］ 孫喜斌，于麗玫，曲成毅，等.中國聽力殘疾構(gòu)成特點及康復(fù)對策［J］.中國聽力語言康復(fù)科學(xué)雜志，2008（2）：21-24.

［5］ Usami S，Nishio SY，Nagano M，et al.Simultaneous screening of multiple mutations by invader assay improves molecular diagnosis of hereditary hearing loss：a multicenter study［J］.PLoS One，2012，7（2）：e31276.

［6］ Reardon W，Pembrey M.The genetics of deafness［J］.Arch Dis Child，1990，65（11）：1196-1197.

［7］ Dai ZY，Sun BC，Huang SS，et al.Correlation analysis of phenotype and genotype of GJB2 in patients with non-syndromic hearing loss in China［J］.Gene，2015，570（2）：272-276.

［8］ Chen K，Zong L，Liu M，et al.Developing regional genetic counseling for southern Chinese with nonsyndromic hearing impairment：a unique mutational spectrum［J］.J Transl Med，2014，12：64.

［9］ Usami S，Abe S，Akita J，et al.Prevalence of mitochondrial gene mutations among hearing impaired patients［J］.J Med Genet，2000，37（1）：38-40.

［10］ Nance WE.The genetics of deafness［J］.Ment Retard Dev Disabil Res Rev，2003，9（2）：109-119.

［11］ Tsukada K，Nishio SY，Hattori M，et al.Ethnic-specific spectrum of GJB2 and SLC26A4 mutations：their origin and a literature review［J］.Ann Otol Rhinol Laryngol，2015，124（5S）：61S-76S.

［12］ Morton CC，Nance WE.Newborn hearing screening--a silent revolution［J］.N Engl J Med，2006，354（20）：2151-2164.

［13］ Botstein D，White RL，Skolnick M，et al.Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms［J］.Am J Hum Genet，1980，32（3）：314-331.

［14］ Ouyang XM，Yan D，Yuan H J，et al.The genetic bases for non-syndromic hearing loss among Chinese［J］.J Hum Genet，2009，54（3）：131-140.

［15］ Dai P，Yu F，Han B，et al.GJB2 mutation spectrum in 2，063 Chinese patients with nonsyndromic hearing impairment［J］.J Transl Med，2009，7：26.

［16］ Lu YJ，Yao J，Wei QJ，et al.Diagnostic value of SLC26A4 mutation status in hereditary hearing loss with EVA：a PRISMA-compliant meta-analysis［J］.Medicine （Baltimore），2015，94（50）：e2248.

［17］ Lu J，Qian Y，Li Z，et al.Mitochondrial haplotypes may modulate the phenotypic manifestation of the deafness-associated 12S r RNA 1555A>；G mutation［J］.Mitochondrion，2010，10（1）：69-81.

［18］ Yuan Y，You Y，Huang D，et al.Comprehensive molecular etiology analysis of nonsyndromic hearing impairment from typical areas in China［J］.J Transl Med，2009，7：79.

［19］ Pandya A，Xia X，Radnaabazar J，et al.Mutation in the mitochondrial 12S r RNA gene in two families from Mongolia with matrilineal aminoglycoside ototoxicity［J］.J Med Genet，1997，34（2）：169-172.

［20］ Vivero RJ，Ouyang X，Yan D，et al.Mitochondrial DNA mutation screening in an ethnically diverse nonsyndromic deafness cohort［J］.Genet Test Mol Biomarkers，2012，16（9）：1146-1148.

［21］ Masasyesva BG，Tong BC，Brock MV，et al.Molecular margin analysis predicts local recurrence after sublobar resection of lung cancer［J］.Int J Cancer，2005，113（6）：1022-1025.

［22］ Abravaya K，Carrino J J，Muldoon S，et al.Detection of point mutations with a modified ligase chain reaction（Gap-LCR）［J］.Nucleic Acids Res，1995，23（4）：675-682.

［23］ Yang XL，Xu ZM.Establishment of the multiplex quantitative ligase chain reaction for detecting mutations of deafness genes［J］.Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi，2010，27（5）：530-534.

［24］ 張迪，段宏，林鵬，等.新型多基因檢測技術(shù)在225例非綜合征型耳聾患者基因檢測中的應(yīng)用［J］.中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2016，51（3）：203-208.

［25］ Xiao W，Oefner PJ.Denaturing high-performance liquid chromatography：a review［J］.Hum Mutat，2001，17（6）：439-474.

［26］ Zainal SA，Md DM，Abd RN，et al.Mutation detection in GJB2 gene among Malays with non-syndromic hearing loss［J］.Int J Pediatr Otorhinolaryngol，2012，76（8）：1175-1179.

［27］ 戴樸，韓東一，馮勃，等.大前庭水管綜合征的基因診斷和SLC26A4基因突變分析［J］.中國耳鼻咽喉頭頸外科，2006，13（5）：303-307.

［28］ Scrimshaw BJ，F(xiàn)aed JM，Tate WP，et al.Rapid identification of an A1555G mutation in human mitochondrial DNA implicated in aminoglycoside-induced ototoxicity［J］.J Hum Genet，1999，44（6）：388-390.

［29］ Esteves MC，de Lima IM，F(xiàn)rancisco AM，et al.Analysis of the presence of the GJB6 mutations in patients heterozygous for GJB2 mutation in Brazil［J］.Eur Arch Otorhinolaryngol，2014，271（4）：695-699.

［30］ 鄭靜，楊愛芬，張婷，等.多重等位基因PCR檢測線粒體12S r RNA基因突變［J］.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2011，34（7）：628-632.

［31］ Gundry CN，Vandersteen JG，Reed GH，et al.Amplicon melting analysis with labeled primers：a closed-tube method for differentiating homozygotes and heterozygotes［J］.Clin Chem，2003，49（3）：396-406.

［32］ Chen N，Tranebjaerg L，Rendtorff ND，et al.Mutation analysis of SLC26A4 for Pendred syndrome and nonsyndromic hearing loss by high-resolution melting［J］.J Mol Diagn，2011，13（4）：416-426.

［33］ 鄭璐，羅光華，張俊，等.堿基淬滅探針技術(shù)單管檢測線粒體DNA 12S r RNA A1555G及C1494T突變［J］.中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2012，47（4）：326-329.

［34］ Huang Q，Liu Z，Liao Y，et al.Multiplex fluorescence melting curve analysis for mutation detection with dual-labeled，self-quenched probes［J］.PLoS One，2011，6（4）：e19206.

［35］ 高慧，劉晶晶，沈姍姍，等.FMCA技術(shù)分析大前庭水管綜合征家系及產(chǎn)前診斷［J］.中華耳科學(xué)雜志，2015（03）：536-540.

［36］ De Carolis E，Vella A，Vaccaro L，et al.Application of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology［J］.J Infect Dev Ctries，2014，8（9）：1081-1088.

［37］ Zeng Y，Jiang D，F(xiàn)eng DF，et al.Application of MALDITOF-MS in gene testing for non-syndromic hearing loss［J］.Zhonghua Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi，2013，48（12）：985-990.

［38］ Choi SY，Kim YE，Ahn DB，et al.Construction of a DNA chip for screening of genetic hearing loss［J］.Clin Exp Otorhinolaryngol，2009，2（1）：44-47.

［39］ Gardner P，Oitmaa E，Messner A，et al.Simultaneous multigene mutation detection in patients with sensorineural hearing loss through a novel diagnostic microarray：a new approach for newborn screening follow-up［J］.Pediatrics，2006，118（3）：985-994.

［40］ Rodriguez-Paris J，Pique L，Colen T，et al.Genotyping with a 198 mutation arrayed primer extension array for hereditary hearing loss：assessment of its diagnostic value for medical practice［J］.PLoS One，2010，5（7）：e11804.

［41］ Abe S，Yamaguchi T，Usami S.Application of deafness diagnostic screening panel based on deafness mutation／gene database using invader assay［J］.Genet Test，2007，11（3）：333-340.

［42］ Yin A，Liu C，Zhang Y，et al.Genetic counseling and prenatal diagnosis for hereditary hearing loss in high-risk families［J］.Int J Pediatr Otorhinolaryngol，2014，78（8）：1356-1359.

［43］ 滿榮軍，張增，路榮忠，等.非綜合征型耳聾患兒十六項遺傳性耳聾基因突變檢測分析［J］.臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2015（04）：319-324.

［44］ Svidnicki MC，Silva-Costa SM，Ramos PZ，et al.Screening of genetic alterations related to non-syndromic hearing loss using Mass ARRAY iPLEX（R）technology［J］.BMC Med Genet，2015，16：85.

［45］ Wu CC，Lu YC，Chen PJ，et al.Application of SNaPshot multiplex assays for simultaneous multigene mutation screening in patients with idiopathic sensorineural hearing impairment［J］.Laryngoscope，2009，119（12）：2411-2416.

［46］ Bardien S，Human H，Harris T，et al.A rapid method for detection of five known mutations associated with aminoglycoside-induced deafness［J］.BMC Med Genet，2009，10：2.

［47］ Sagong B，Baek JI，Oh SK，et al.A rapid method for simultaneous screening of multi-gene mutations associated with hearing loss in the Korean population［J］.PLoS One，2013，8（3）：e57237.

［48］ Chang MY，Choi BY.Strategy for the customized mass screening of genetic sensorineural hearing loss in koreans［J］.Korean J Audiol，2014，18（2）：45-49.

［49］ Tekin D，Yan D，Bademci G，et al.A next-generation sequencing gene panel（MiamiOtoGenes）for comprehensive analysis of deafness genes［J］.Hear Res，2016，333：179-184.

［50］ 盧宇，張旭，燕志強，等.外顯子組測序一個常染色體顯性遺傳非綜合征型聾家系致病基因ACTG1［J］.中華耳科學(xué)雜志，2013，3：340-344.

［51］ Baek JI，Oh SK，Kim DB，et al.Targeted massive parallel sequencing：the effective detection of novel causative mutations associated with hearing loss in small families［J］.Orphanet J Rare Dis，2012，7：60.

［52］ Gao X，Huang SS，Yuan YY，et al.Targeted gene capture and massively parallel sequencing identify TMC1 as the causative gene in a six-generation Chinese family with autosomal dominant hearing loss［J］.Am J Med Genet A，2015，167A（10）：2357-2365.

［53］ Gu X，Guo L，Ji H，et al.Genetic testing for sporadic hearing loss using targeted massively parallel sequencing identifies 10 novel mutations［J］.Clin Genet，2015，87（6）：588-593.

［54］ Yin A，Liu C，Zhang Y，et al.The carrier rate and mutation spectrum of genes associated with hearing loss in South China hearing female population of childbearing age［J］.BMC Med Genet，2013，14：57.