王晛玨，蘇秀蘭

生物活性肽制備、純化和分析的研究進展

王晛玨，蘇秀蘭

生物活性肽具有特殊的生理特性，其在醫(yī)藥和保健食品領(lǐng)域的研究已成為熱點?，F(xiàn)代科學(xué)發(fā)展不僅要求能夠分離得到具有不同功能的活性肽類，更重要的是能夠經(jīng)過進一步純化和鑒定得到準確的肽結(jié)構(gòu)、氨基酸序列以及功能通路。

生物活性肽分子質(zhì)量小但活性顯著，主要根據(jù)不同的氨基酸的排列順序而表現(xiàn)出抗氧化、清除自由基、免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抑制病毒等特性[1]。生物體內(nèi)的活性肽是蛋白質(zhì)長鏈經(jīng)過一定程度的水解之后，將非活性的短肽釋放出來，形成的有特殊功能的活性物質(zhì)[2]。但是，從天然物質(zhì)中提取活性肽卻十分困難，通常每毫克組織中能夠有效提取的肽含量很低，又受到原材料來源和分離方法的限制，因此，迫切地需要有效的分離提取、純化和鑒定的技術(shù)來發(fā)現(xiàn)和獲得更多的生物活性肽。

生物活性肽的制備方法通常有：酶法、微生物發(fā)酵法、生物合成法以及基因重組法等。提取純化的方法有：膜分離技術(shù)、層析技術(shù)、電泳技術(shù)、色譜技術(shù)以及探針分離法等；同時還會將多種方法進行聯(lián)用，以期獲得更加單一和結(jié)構(gòu)清晰的活性肽，例如高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用。利用不同的分離技術(shù)獲得的生物活性肽均顯示出較好的生物學(xué)作用。通過小鼠負重游泳試驗證明，利用木瓜蛋白酶酶解林蛙油制備的生物活性肽能夠有效緩解疲勞[3]。凌敏等[4]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌均是堿性蛋白酶的生產(chǎn)菌，但地衣芽孢桿菌比枯草芽孢桿菌具有更強的分泌堿性蛋白酶的能力。通過重組 DNA 實現(xiàn)嗜堿性芽孢桿菌來源的堿性蛋白酶在地衣芽孢桿菌中的分泌表達，能夠提高表達量，并縮短發(fā)酵周期。色譜和質(zhì)譜聯(lián)用可同時實現(xiàn)單一組分的分離和氨基酸序列的鑒定，在現(xiàn)實中得到廣泛應(yīng)用。Puchalska 等[5]采用高效液相-電噴霧四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（HPLC-ESI-Q-TOF）提取到亮氨酰-絲氨酰-脯氨酸、亮氨酰-谷氨酰胺酰-脯氨酸和亮氨酰-精氨酰-脯氨酸 3 種玉米抗壓肽。Zhao 等[6]利用超濾和連續(xù)色譜分離純化鹿茸得到4 種具有抗炎作用的活性肽，并用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進行肽結(jié)構(gòu)的鑒定。

隨著技術(shù)的進步，科研水平的完善以及人類需求的擴大，生物活性肽的制備、純化和鑒定的方法已不局限于一種或幾種方法，而是將多種高效的手段串聯(lián)起來發(fā)揮更全面的作用。但是無論使用何種方法制備得到的肽產(chǎn)物其實是包含雜質(zhì)的混合物，在進行必要的分離純化后，得到的產(chǎn)物依然存在糖類、鹽類及水分等物質(zhì)。肽的制備和應(yīng)用受到多種因素的制約，為得到其中有效組分，各種方法也在不斷更新和進步，筆者從健康和高效的角度出發(fā)，篩選出制備、純化和分析生物活性肽的有效方法供大家參考。

1 發(fā)酵法制備生物活性肽

制備生物活性肽的方法主要有酶解法、發(fā)酵法和定向合成法等幾種。酶解法條件溫和、快捷、安全、過程易控制。蛋白質(zhì)經(jīng)過預(yù)處理可提高酶對蛋白質(zhì)的敏感性，酶解技術(shù)可控制酶切位點，保證產(chǎn)物一定的分子質(zhì)量。其局限性在于必須選擇合適的酶和確定所需的時間、溫度、pH 等條件[7]。定向合成法包括：液相法、固相法、酶法合成及 DNA 重組等，其中液相法適合小肽合成；DNA 重組使活性肽的產(chǎn)量和純度提高。但液相法不適合用于反應(yīng)中間體溶解度低的情況；固相合成限于 40～200 個氨基酸[8]。而發(fā)酵法制備活性肽的優(yōu)勢在于生產(chǎn)的活性肽多來源于食品，更安全，可同時利用微生物降低或消除苦味。制備的關(guān)鍵是發(fā)酵菌株的選擇。

1.1 發(fā)酵法的應(yīng)用原理

微生物發(fā)酵工藝根據(jù)底物的不同分為液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵兩種，其基本原理是利用菌種在其代謝過程中產(chǎn)生的蛋白酶，將活性肽片段從底物蛋白中水解出來，實現(xiàn)對發(fā)酵產(chǎn)品的分離純化[9]。

固態(tài)發(fā)酵是先選擇合適的菌種進行擴大培養(yǎng)后得到產(chǎn)量大、活性好、抗雜菌能力強的發(fā)酵基團。將經(jīng)過滅菌和調(diào)制的預(yù)處理原料與發(fā)酵基團混合，進入發(fā)酵生產(chǎn)過程。固態(tài)發(fā)酵是需氧發(fā)酵，物料厚度要適當和均勻，保證通風透氣；而且發(fā)酵的過程中會產(chǎn)生熱量，需要經(jīng)常翻動來蒸發(fā)水分。固態(tài)發(fā)酵的不足之處在于發(fā)酵過程需要接觸外界空氣，容易受到雜菌的污染。因此需根據(jù)不同菌種的特性，提供足夠的營養(yǎng)和條件，使菌母形成絕對的生長優(yōu)勢，從而抑制雜菌。曹亞蘭[10]分別利用固態(tài)發(fā)酵和酶解偶聯(lián)制備大豆抗氧化活性肽，結(jié)果證明發(fā)酵法制備的大豆肽比酶解法制備的肽具有更高的抗氧化能力。許芳等[11]利用混合菌類固態(tài)發(fā)酵水解脫脂大豆粉制備活性肽，水解度可達到 90.61%。

液態(tài)發(fā)酵分為單菌發(fā)酵和復(fù)合菌種發(fā)酵兩種。單菌發(fā)酵是細菌或真菌液態(tài)發(fā)酵，復(fù)合菌發(fā)酵是真菌和細菌的混合發(fā)酵?；旌暇N發(fā)酵具有細菌和真菌的雙重優(yōu)點，產(chǎn)生的蛋白酶酶活強，而且酶系豐富，使發(fā)酵更迅速、更徹底。因此，復(fù)合菌液態(tài)發(fā)酵制備生物活性肽非常有研究價值。與固態(tài)發(fā)酵相比，液態(tài)發(fā)酵有發(fā)酵周期短，生產(chǎn)效率高，菌種生長狀況好等優(yōu)點，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[12]。蓋夢和張美莉[13]用液態(tài)發(fā)酵法制備燕麥 ACE 抑制肽，在發(fā)酵時間 39 h，初始 pH 9，發(fā)酵溫度 34 ℃ 的條件下驗證 ACE 抑制率為63.96%。李愛晨[14]在 32 ℃，pH 7，料液比為 4% 的條件下液態(tài)發(fā)酵黑曲霉和米曲霉混合菌種 48 h 制備米糠肽，肽轉(zhuǎn)化率達到 59.86%。相對于固態(tài)發(fā)酵法，液態(tài)發(fā)酵法便于實時觀測實驗現(xiàn)象和進度，更有利于控制米糠肽的轉(zhuǎn)化率。Torino 等[15]比較了固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵小扁豆獲得的水溶性提取物的生物活性，結(jié)果顯示，液態(tài)發(fā)酵的水溶性提取物含較多總酚和抗氧化物，在抗高血壓的治療上有廣闊前景。

1.2 發(fā)酵法的優(yōu)勢

相對于酶解法，微生物發(fā)酵的過程中能夠產(chǎn)生多種蛋白酶，有效避免了單一酶類水解不完全的問題；同時，快速繁殖和高產(chǎn)的菌類替代了酶解中的純化過程，有效降低了生產(chǎn)成本。在生產(chǎn)過程中無需附加條件，不會給產(chǎn)品帶來過多的無機鹽成分，同時植物原料的發(fā)酵副產(chǎn)品可用作飼料，有效避免浪費。微生物發(fā)酵的另一個優(yōu)勢在于可以對某些苦味肽基團進行修飾和重組，獲得的活性肽能達到基本無苦味，可以有效運用到保健食品領(lǐng)域[16]。在微生物發(fā)酵過程中添加酵母菌、乳酸菌或醋酸桿菌等有益菌，可產(chǎn)生有香味的有機酸，從而改善發(fā)酵產(chǎn)物的風味。

微生物發(fā)酵的原材料富含蛋白質(zhì)，例如乳制品、大豆、米糠等，通過控制不同的發(fā)酵條件，以可食用的動植物蛋白做發(fā)酵原料，生產(chǎn)出多種安全可靠的生物活性肽類。正所謂“藥食同源”，這些活性肽更有利于人體消化和吸收，具有廣闊的應(yīng)用前景。

1.3 發(fā)酵菌株的選擇

微生物發(fā)酵常用的菌株有芽孢桿菌、酵母菌、米曲霉、黑曲霉、乳酸菌等。下文就幾種發(fā)酵效率高的菌株進行詳細論述。

1.3.1 芽孢桿菌 枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌是堿性蛋白酶的主要生產(chǎn)菌，但地衣芽孢桿菌的分泌能力是枯草芽孢桿菌的 2 倍，且地衣芽孢桿菌生長緩慢，能夠使分泌出的蛋白充分折疊和運輸[17]。

有實驗證明，通過重組地衣芽孢桿菌的 DNA 來實現(xiàn)堿性蛋白酶高分泌量，并縮短發(fā)酵周期而制備出高純度的酪蛋白磷酸肽[4]。王文平[18]發(fā)酵豆粕制備大豆活性肽，證明枯草芽孢桿菌的蛋白水解能力要優(yōu)于米曲霉、黑曲霉和酵母菌，且枯草芽孢桿菌的單菌水解度要高于混合菌。管國強等[19]以大豆肽轉(zhuǎn)化率為指標，優(yōu)化了枯草芽孢桿菌 ZC1 發(fā)酵豆粕制備大豆肽的工藝條件。在料液 pH 5.42、碳源含量1.73%、發(fā)酵時間 43.45 h 的條件下發(fā)酵羊胎盤下腳料制備的免疫活性肽對小鼠淋巴細胞的促增殖作用顯著[20]。

1.3.2 米曲霉與黑曲霉 米曲霉是生產(chǎn)蛋白酶的優(yōu)良菌種，米曲霉在生長過程中分泌的蛋白酶的活性高低受到其利用的物料以及生產(chǎn)環(huán)境的影響[21]。黑曲霉所產(chǎn)生的酸性蛋白酶是具有良好熱穩(wěn)定性和金屬離子穩(wěn)定性的端肽酶[11]。

比較枯草芽孢桿菌、黑曲霉和米曲霉發(fā)酵羊胎盤殘留物制備的活性肽，證明黑曲霉的發(fā)酵產(chǎn)物多肽含量最高，且抗氧化性能最好，在相同胎盤肽質(zhì)量濃度 100 μg/ml 下，黑曲霉的免疫細胞刺激指數(shù)達到 24.89%[22]。武金霞等[23]利用米曲霉發(fā)酵蠅蛆蛋白，獲得質(zhì)量濃度為 7.9 mg/ml、肽轉(zhuǎn)化率為 31.6% 的蠅蛆肽，經(jīng) SDS-PAGE 檢測其分子質(zhì)量為4.3～65.9 kD。

1.3.3 乳酸菌 國外學(xué)者通常利用乳制品發(fā)酵制備生物活性肽。乳酸菌的蛋白水解系統(tǒng)主要有：將酪蛋白水解成寡肽的酶類；轉(zhuǎn)運寡肽的特殊蛋白；以及進一步水解寡肽的胞內(nèi)肽酶[24]。類似乳酸菌的研究還包括嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、雙歧桿菌、干酪乳桿菌等，它們高效的蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)均有利于活性肽的釋放。張奕[25]利用10 種乳酸菌和 4 種酵母菌發(fā)酵駝乳制備免疫活性肽。在制備大米蛋白 ACE 抑制肽中，乳酸菌的脫蛋白能力要明顯優(yōu)于芽孢桿菌，且乳酸菌與胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶的組合脫除率最高達到 91%[26]。

1.3.4 復(fù)合菌 微生物通過自身生理活動產(chǎn)生多種功能的肽酶譜系，這些酶類將發(fā)酵產(chǎn)物中的基團修飾和重組，讓肽段之間或與氨基酸之間進行重組，進而改善多肽的功能和特性。不同微生物內(nèi)存在不同的蛋白酶系，產(chǎn)酶的種類與數(shù)量會隨著生產(chǎn)條件的不同而發(fā)生改變。不同的菌種有不同的發(fā)酵效果，根據(jù)各菌種的生長條件和生理特性來選擇最優(yōu)的發(fā)酵條件，可以充分發(fā)揮其發(fā)酵優(yōu)勢。例如用于花生粕發(fā)酵時，枯草芽孢桿菌多用于液態(tài)發(fā)酵，而霉菌多用于固態(tài)發(fā)酵，近些年用混合菌種固態(tài)發(fā)酵花生粕制備生物多肽的案例有很多[27]。

張吉鹍[28]曾提出利用多菌種組合固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)大豆肽蛋白飼料。有研究顯示，以黑曲霉與枯草芽孢桿菌 1∶1.5的比例共生發(fā)酵甘薯蛋白 48 h，制備的活性肽產(chǎn)量高[29]。王瑋[30]利用米曲霉、黑曲霉、枯草芽孢桿菌和啤酒酵母組合發(fā)酵花生粕制備抗氧化肽，證明米曲霉和酵母菌以 1.4∶1的比例發(fā)酵效果最佳。

復(fù)合菌種的發(fā)酵雖然具有很多優(yōu)點，但是不同菌種之間存在相互拮抗作用，可以通過控制菌種的比例和添加量來降低這種作用。另外，高產(chǎn)菌種的篩選仍需要繼續(xù)深入探索和研究。

2 親水作用色譜分離提取生物活性肽

1990年，美國科學(xué)家 Alpert 首次提出了親水作用色譜（HILIC）的概念[31]，但早在 20 世紀 50年代，親水作用色譜就有使用的記錄，直到 2000年前后該方法得到了廣泛的應(yīng)用。

2.1 親水作用色譜的應(yīng)用原理

親水作用色譜是液相色譜中的一種，是親水基質(zhì)分離的有效手段，隨著固定相和溶質(zhì)的極性增加，而有機溶劑的極性減小來實現(xiàn)分離，與反向液相色譜的原理相反[32]。

親水作用色譜利用強極性的固定相結(jié)合不同比例的有機相與水組成的流動相來實現(xiàn)對強極性化合物保留的目的。親水性的固定相表面附著一層富水層，富水層與貧水的流動相形成一個液/液萃取的系統(tǒng)，溶質(zhì)通過這個萃取系統(tǒng)實現(xiàn)保留。

親水作用色譜的固定相是與水有較好親和性的強極性基團。其中，氨基鍵合相是較早用于親水作用色譜的固定相，對碳水化合物有良好的分離選擇性[33]。硅膠是最早應(yīng)用于親水色譜的固定相，其具有良好的質(zhì)譜兼容性[34]。酰胺鍵合相和聚（琥珀酰亞胺）型鍵合相具有很好的親水性和獨特的分離選擇性，被廣泛用于多肽的分離，在蛋白質(zhì)組學(xué)中發(fā)揮重要的作用。兩性離子鍵合相表面的正負官能團具有良好的親水性，同樣在蛋白質(zhì)組學(xué)中有良好的應(yīng)用[35]。

另外，親水色譜的流動相是乙腈-水或揮發(fā)性緩沖鹽溶液體系，水相的比例最高達到 60%，是為了能夠保證固定相顆粒被充分地潤濕并保持親水作用[36]。流動相的種類和有機溶劑的含量都會對溶質(zhì)的保留產(chǎn)生影響，在流動相中，必須有一定比例的有機溶劑方能體現(xiàn)出溶質(zhì)與固定相的親水作用。有時流動相中的有機溶劑與水分的組成已不能滿足色譜的分離效果，有人考慮用鹽來調(diào)節(jié)流動相的濃度，如甲酸銨、乙酸銨等[37]。

2.2 親水作用色譜分離生物活性肽的優(yōu)勢與應(yīng)用前景

親水作用色譜不僅能夠分離少于 5 個氨基酸的寡肽，而且也是一種定量定性分析的手段。流動相中的高濃度有機溶劑可以增強電噴霧離子源質(zhì)譜的離子化效率，從而提高檢測的靈敏度，與質(zhì)譜具有很好的兼容性。

親水色譜在分離提取氨基酸上已有成熟的應(yīng)用。氨基酸在兩性離子狀態(tài)下，其羧基基團可發(fā)生電離被質(zhì)子化，因此兩性離子固定相常用于氨基酸的分離、純化[38]。Pan 等[39]采用 HILIC-UPLC-MS/MS 法對 10 個板藍根樣品中的22 種游離氨基酸進行了分析，并取得了較好的分離效果。Yao 等[40]使用親水作用高效液相色譜與電噴霧電離質(zhì)譜聯(lián)用（HILIC-UPLCESI-MS/MS）對銀杏葉中 22 種游離氨基酸進行分離。

氨基酸成分的成熟應(yīng)用能夠為多肽、蛋白質(zhì)成分的分離和鑒定奠定基礎(chǔ)。Xu 等[41]采用 2D-RPLC/HILIC 對全蝎的蝎毒成分中肽類進行分割及純化，并通過 MS 的方法進行結(jié)構(gòu)鑒定，命名了兩種新肽，為肽類的研究提供了新的依據(jù)。Zhou 等[42]采用 HILIC-UHPLC-QTRAP?/MS2 聯(lián)合化學(xué)計量學(xué)的方法對羅漢果中的 27 種游離氨基酸、二肽和三肽類化合物進行了分析。但是，由于親水作用色譜的保留機制尚沒有統(tǒng)一定論，復(fù)雜的交互作用都可能對峰型有很大的影響。由于出峰次序與反向色譜不同，運用親水色譜分離氨基酸或多肽時，其中某些有機溶劑可能會影響蛋白質(zhì)的溶解度或性狀。所以確定必要參數(shù)對保留化合物非常重要。

3 基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜分析生物活性肽

基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）是一種軟電離質(zhì)譜技術(shù)，其具有高靈敏度和高精確度等特點，為生命科學(xué)的研究提供強有力的技術(shù)支持。

2002年諾貝爾化學(xué)獎得主田中耕一（日）和約翰·貝內(nèi)特（美）進一步發(fā)展了軟電離法對生物大分子的鑒定和結(jié)構(gòu)分析。

3.1 MALDI-TOF-MS 的應(yīng)用原理

質(zhì)譜的基本結(jié)構(gòu)是離子源、質(zhì)量分析器、離子檢測器、數(shù)據(jù)分析和質(zhì)譜譜圖五個部分。其工作原理是將樣品在離子源中電離，形成不同質(zhì)荷比（M/Z）的離子，經(jīng)電場加速進入質(zhì)量分析器；在電場或磁場作用下，離子從質(zhì)量分析器運行至離子檢測器，經(jīng)數(shù)據(jù)分析后繪出質(zhì)譜圖[43]。

MALDI-TOF-MS 的工作機制是在質(zhì)譜系統(tǒng)的基礎(chǔ)上進行了優(yōu)化。MALDI 是在 1987年后正式確立的一種軟電離方法，“軟電離”就是指用較低的能量使分子電離。樣品與基質(zhì)形成共結(jié)晶后，吸收了脈沖激光中的部分能量而發(fā)生解吸，使樣品離子化[44]?；|(zhì)的作用就是分散樣品分子，有利于把從激光中吸收的大部分能量快速傳遞給樣品，促進樣品離子化。

飛行時間質(zhì)譜（TOF-MS）是一個真空的無場離子漂移管，當離子加速后進入漂移管，會以恒定的速度飛向離子接收器，接收器就會通過離子的質(zhì)荷比與飛行時間所成的正比來測定樣品的分子量。

3.2 MALDI-TOF-MS 分析生物活性肽的優(yōu)勢與應(yīng)用前景

由于 MALDI-TOF-MS 使用的是軟電離技術(shù)，使得樣品分子在電離過程中不會破壞其結(jié)構(gòu)，保證分子的完整性。在保證使用合適的基質(zhì)時，理論的檢測范圍很寬，從 40 ～400 kD[45]，同時只需要很少的樣品量就能夠保證檢測的靈敏度。MALDI-TOF 的優(yōu)越性還體現(xiàn)在通過圖譜能夠直觀地得到樣品分子的質(zhì)量，同時也可以得到高分子的末端基結(jié)構(gòu)信息等。

在分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法中，高效液相色譜（HPLC）或十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS- PAGE）是相對較成熟和有效的手段。隨著質(zhì)譜手段的發(fā)展，曾有研究人員比較了幾種新型質(zhì)譜技術(shù)，認為 MALDI 的靈敏度高，抗干擾能力強[46]。

孫宜君[47]采用 MALDI-TOF/TOF-MS 以及 LTQ 串聯(lián)質(zhì)譜的方法對螺旋藻抗菌肽 SP-1 的結(jié)構(gòu)進行分析鑒定，最終確定 SP-1 為 18 個氨基酸（KLVD ASHRLATGDVAVRA）組成的陽離子小分子肽，分子量約為 1878.97 D。另有學(xué)者用 MALDI-TOF-MS 對羊胎盤抗氧化肽進行結(jié)構(gòu)鑒定和氨基酸序列測定，得到一種由六個氨基酸組成的新肽，序列為Glu-Pro-Val-Ser-His-Phe，相對分子量為 678.6[48]。也有研究利用該方法鑒定壇紫菜活性肽，其中 M/Z = 1846.8613 的多肽氨基酸序列為 QTDDNHSNVLWAGFSR，另外兩個質(zhì)荷比為 1280.676 和 1677.879 的多肽序列分別為VPGTPKNLDSPR 和 MPAPSCALPRSVVPPR[49]。

4 展望

生物活性肽的研究發(fā)展迅猛，可見其功能的優(yōu)越性以及人們需求的迫切性。但目前活性肽的研究還駐足在實驗室階段，研究人員需要利用更先進的手段來提取、純化和鑒定各類多肽。為了能達到商業(yè)化生產(chǎn)和大批量供應(yīng)，需要用臨床試驗數(shù)據(jù)來證明活性肽的功效，以及如何保證在人體內(nèi)發(fā)揮效用而不被其他物質(zhì)影響，同時還需要優(yōu)化產(chǎn)品嗅味。這些都是我們今后進行攻關(guān)的目標，生物活性肽的發(fā)展是機遇和挑戰(zhàn)并存的。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.04.012

010050 呼和浩特，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心

蘇秀蘭，Email：xlsu@hotmail.com

2017-05-08